מאמר שיטה

הטמעה של במבחנה תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

DOI:

10.3791/52879

⸱

9 בדצמבר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1H3 Biomedicine, 2Massachusetts General Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות - לפני או אחרי הופעה קלינית - היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גילוי המנגנונים אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שטיפולים ממוקדים יעילים בתחילה, בהכרח מופיעה עמידות. מספר שיטות, כגון ניתוח גנטי של דגימות קליניות עמידות, יושמו כדי לחשוף את מנגנוני העמידות הללו כדי להקל על טיפול המעקב. למרות שגישות אלה הובילו לתגליות רלוונטיות מבחינה קלינית, קשיים בהשגת חומר המטופל הרלוונטי או בפירוק הנתונים הגנומיים שנאספו מדגימות אלה פגעו קשות בדרך לריפוי. לשם כך, אנו מתארים כאן כלי לגילוי מהיר שעשוי להנחות שיפור בטיפולי קו ראשון ואסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. על ידי צימוד בחירת תרופות פרה-קליניות במבחנה או in vivo עם ריצוף הדור הבא, ניתן לזהות וריאציות מבניות גנומיות ו/או שינויים בביטוי גנים שעשויים לשמש כמניעים פונקציונליים של עמידות. גישה זו מאפשרת הופעה ספונטנית של שינויים, ומגדילה את ההסתברות שניתן להבחין במנגנונים אלה אצל החולים. בפרוטוקול זה אנו מספקים הנחיות למקסום הפוטנציאל לחשיפת וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים המניעים התנגדות באמצעות קווים דבקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון מולקולרי מפורט של הגנום גידול על ידי טכנולוגיות רצף חזקות וכלים אנליטיים נתונים משופרים הוביל לגילוי של שינויים גנטיים מרכזיים בסוגי הסרטן ספציפיים 1,2. פיתוח של טיפולים ממוקדים במטרה הנגעים הגנטיים הללו, כגון HER2, BCR-ABL, EGFR וALK, השתפר באופן משמעותי באיכות חיים של חולי 1,2. עם זאת, למרות ייחודה של גישה זו, התגובה הקלינית לטיפולים בודדים ביותר הייתה תת-אופטימלית כהתנגדות סופו של דבר מתגלה. לאחרונה, התקדמות משמעותית נעשתה בהבנת היסודות המולקולריים של התנגדות לתרופות ממוקדות. מעניין לציין, שזה הופך להיות ברור כי מנגנון בולט של התנגדות כרוכה פעילות היעד / מסלול מתמשך. כדוגמה לכך, קולטן האנדרוגן (AR) -directed טיפול enzalutamide של סרטן הערמונית גורם להעשרת הפעלת מוטציות בAR עצמו, שמירה על outp איתות-ARut בנוכחות המעכב 3-5. ידע זה הוביל לקמפיין אגרסיווי ל1) לפתח יריבים דור שלישיים שיכול להמשיך לדכא שני WT ותפקוד המוטציה-AR בenzalutamide עמיד PCA 3 ו -2) לזהות צמתים במורד הזרם פוטנציאליים של איתות AR שעשוי להיות ממוקד להתערבות טיפולית . באופן דומה, התנגדות לסוגים אחרים של מעכבים כגון אלה מיקוד EGFR, BRAF וABL לעתים קרובות להוביל למוטציות שמחדש את מסלול קינאז ממכר המקורי 1.

בידיעה שההתנגדות עולה באופן בלתי נמנע ברוב החולים, פיתוח גישות להביא זריזות מנגנונים אלה לאור יאפשר פיתוח של טיפולי מעקב יעילים. גישה אחת שנמצא בשימוש נרחב היא לנתח את הגנומיקה של גידולים עקשן קליניים ביחס לגידולי טיפול-נאיבי או -sensitive לזהות מוספים / depletions בנגעים גנטיים שעשויה להיות נוח לדגילוי שטיח. למרות הבטחתה, יש שתי התחייבויות עיקריות של גישה זו שתפגענה בגילוי מהיר. ראשית, לקבל גישה לחומר בזמן גידול לחקירה הגנומי עשויה לשמש כמכשול משמעותי במעבר מטיפול כדי לרפא. שנית, deconvolution של מספר עצום של נגעים גנטיים בהגדרה עמידה עשוי להיות מאתגר מאז גידולים יכולים להציג ההטרוגניות התוך ממאירות משמעותית 6,7.

לאור אתגרים אלה, יש כבר עלה הסתמכות על גילוי פרה-קליני של מנגנוני התנגדות. גישה זו עשויה לאפשר זיהוי של מנגנוני התנגדות בולטים לפני הניסויים הקליניים שעשויות להנחות 1 אסטרטגיות חלופיות לניהול קליני בחולים שנושאים מנגנונים אלה גם לפני טיפול או בעקבות תחילתה של התנגדות.

כלי אחד כזה פרה-קליני גילוי שנמצא בשימוש נרחב הוא להחיל מסכי RNAi פונקציונליים משוחד. לבחינהple, ויטאקר ועמיתים מיושמים מסך RNAi הגנום בקנה מידה לזהות כי אובדן NF1 מתווך התנגדות למעכבי RAF וMEK באמצעות הפעלת מסלול MAPK ספג 8. ממצאים אלה נמצאו להיות רלוונטיים מבחינה קלינית כמוטציות פסד של הפונקציה בNF1 נצפו בתאי גידול -mutant BRAF שמהותו עמידים לעיכוב חיל האוויר המלכותי ובגידולים מלנומה עמידים לvemurafenib הפעלה 8. עם זאת, למרות הצלחתה של גישה זו, מטרות רלוונטיות מבחינה קלינית רבות לעתים קרובות אינה מזוהות, ככל הנראה בשל ההטיה הפסד של פונקציה של גישה זו.

לעומת זאת, כלי פחות מוטה לגילוי פרה-קליני של מנגנוני התנגדות כרוך הדור של שורות תאים עמידות בחשיפה ממושכת למתחם של עניין בשילוב עם פרופיל הגנומי או transcriptomic מבוסס NGS. גישה זו יושמה בהצלחה על ידי מספר קבוצות לזהות ספונטנישינויים חוזרים ונשנים אחת גרסאות נוקלאוטיד או ביטוי שיאפשר התנגדות 5,9,10. לדוגמא, מוטציה F876L חוזרת בAR התגלתה לאחרונה בשיבוטים עמידים במבחנה 3-5 ובגידולי xenograft in vivo 5 לפני זיהוי מוטציה זו במרפאת 4. ממש לאחרונה, באנג ועמיתיו (2015) 11 משמשים ClonTracer בשני דגמים רלוונטיים קליני להראות כי רוב השיבוטים עמידים המתעוררים במהלך חשיפה לסמים ממושכת היו חלק מתת-אוכלוסייה מראש קיימים מצביעה על כך שרוב רלוונטי תפקודי מוטציות הם כנראה כבר קיים מראש שהופך נבחר לבמהלך בחירה 11.

בניגוד לפרופיל הגנטי של גידולים שנאמרו קודם לכן, יתרונות גישה זו מפחות ההטרוגניות כשיבוטים "הומוגנית" עמידים המשמשים לניתוח להקל נתיחה גנטית מדויקת יותר של פוטנציאל נהגים. Furthermבצר, מרגש, בנוסף לפוטנציאל לחשיפת מנגנונים של התנגדות, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לזהות את המנגנונים התאיים של פעולה ומטרות של מולקולות קטנות ביו שמידע זה הוא 10 לא ידוע. בהתחשב ביתרונות ברורים ושימושים רבים של גישה זו, כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט את היישום מוצלח של מסך כזה פרה-קליני למקסם את הפוטנציאל לתגליות משמעותיות קליני.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הערכה במערכת העיכול 50 למגרש (ים) של ריבית

  1. צור עקומת צמיחה (ים) לשורות תאים של עניין על מנת להעריך את צפיפות הזריעה המתאימה. עלילה מספר התאים בנקודות זמן שונות הבאים זריעה (ימים 2, 4, 6 ו -8) ביחס ליום 0. זה יספק שיעור צמיחה יחסי של הקו הסלולרי של עניין ויש להשתמש כדי להעריך את צפיפות הזריעה הראשונית כך ש מפגש הוא לא הגיע ב96-גם צלחות תוך 7 ימים.
  2. ברגע שעקומות גדילה נקבעו, מספר המתאים של תאי זרע בלוחות שאינם שקופים, ברורים תחתון 96-גם בתקשורת של תא 100 μl להעריך GI 50. זרע מספר התאים המבוססים על קו התא המשמש ונקבע ב1.1. בדרך כלל, זרע 3x10 3 תאים לשורות תאים בצמיחה מהירות עם הכפלה זמן של ~ 24 שעות, למשל., HCT116.
    1. הכן צלחת assay (יום 1). לצלחת assay, תאי זרע בצפיפות רצויה בתקשורת והתרבות שלי 100 μln בארות המוצלים בכחול (איור 1). ולס מודגש בלבן מכיל רק תקשורת.
    2. הכן צלחת שליטה (יום 1). לצלחת השליטה, זרע אותה הצפיפות של תאים כמו בשלב 1.2.1 בשל תקשורת בתרבות 100 μl בצלחת נפרדת 96-היטב. קריאה זו "יום 0 'תעזור בפרשנות הטבע ציטוטוקסיות / cytostatic של התרכובות שנתחה (איור 2).
  3. למחרת (היום 0), לקרוא את צלחת השליטה. לאזן מגיב כדאיות תא זורח (מצע cellTiter-Glo מעורב עם חיץ לפי הוראות יצרן) לRT ומערבבים בעדינות על ידי היפוך תוכן כדי להשיג פתרון הומוגני. להוסיף 80 μl של מגיב לשל תא / תערובת תקשורת 100 μl ולנער תוכן למשך 30 דקות כדי לגרום תמוגה תא.
    1. שיא הארה עם luminometer מוגדר חשיפה של .1-1.0 גל שניות וזיהוי של 560 ננומטר.
  4. להוסיף תרכובות מבחן (תרכובותשל ריבית) לassay צלחות (יום 0). הפוך דילול 1: 4 סדרתי של תרכובות בDMSO ב200x ריכוז סופי עבור הסכום כולל של 10 ריכוזים (9 דילולים המכילים תרכובת וDMSO אחד בלבד, צלחת מתחם). כנקודת התחלה ראשונית, לשאוף למינון הנמוך ביותר של 0.03 200x מיקרומטר ומנה עליונה של 2,000 מיקרומטר (μl נפח 200 סופי).
  5. להוסיף תרכובות בדילול סדרתי עד בינוני להפוך תערובת מתחם-בינוני ב10x ריכוז סופי (נפח 100 μl הסופי, צלחת ביניים). אחסן את צלחת המתחם ב -20 ° C לשימוש ביום 3 של assay. הוסף 10 μl של תערובת מתחם-בינוני לתאים בtriplicates כך שהמינון הגבוה ביותר הוא 10 מיקרומטר (למשל., שורות B, C ו- D, יום 0) (איור 1). דגירה צלחות assay במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. בטל צלחת ביניים (ים) לאחר שימוש.
  6. ביום 3, להכין תערובת מתחם בינוני 1x 400 μl באמצעות צלחות המתחם ערוכים 1.4. הפוך צלחות assay כדי להסיר תקשורת וללטף יבשים ברכבמגבות נייר claved 2-3x כדי להסיר תקשורת שיורית. להוסיף מתחם / תקשורת (100 μl / טוב) לבארות מוצלות בכחול ולהוסיף מדיה 100 μl להיקף בארות כדי למנוע אידוי (איור 1). Re-דגירה צלחות assay על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים נוספים.
  7. ביום 6, להעריך מספר יחסי של תאי קיימא על ידי ביצוע קריאת הארה כמתואר בשלב 1.3.
  8. השתמש בקריאת יום 0 להעריך את טבע סטטי / הרעיל של תרכובות. סוכנים רעילים לגרום אפופטוזיס ואילו סוכני cytostatic לגרום עצירת מחזור התא. אם המתחם הוא רעיל (יום 6 קריאה מתחת יום 0 קריאה), לשקול בחירת GI 50, וGI 50 x 5 ריכוזים עבור מבחני עמידות. עם זאת, אם המתחם גורם קיפאון (שווה או גבוה מקריאת D0), לשקול GI 100 ועבור מבחני עמידות GI X5 100 (איור 2).

2. הגדרת מבחני עמידות לתרופות

  1. אם שנינות עובדתחה סוכן cytostatic, תאי זרע במפגש של 30-40% ב150 מ"מ 2 מנות בתרבית רקמה (נפח = 30 מיליליטר) עבור assay ההתנגדות. אם עובד עם סוכן רעיל, זרע במפגש 70-80%.
  2. לשורות תאים שנמל מנגנון תיקון אי התאמה (MMR) ללא פגע, דגירה תאים מצעד 2.1 O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם סרטן N-אתיל-N-nitrosourea (ENU). פנק את התאים עם 30 μl של פתרון מניות של 50 מ"ג / מיליליטר ENU (50 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) כדי לשפר את חוסר יציבות גנומית. לתא קווים שיש לי פגום MMR (לוחות 2 ו -3), הטיפול בENU או חומרים מסרטנים אחרים ייתכן שיהיה צורך.
    1. לשורות תאים אחרות, לקבוע MMR-מחסור בקריטריוני NCI באמצעות חוסר יציבות microsatellite 12, או המבוסס על האפיון שפורסם באמצעות מבחני חוסר יציבות microsatellite או פרופיל הגנומי / epigenomic של גני MMR 13-15.
  3. תאי פינוק עם מתחם המבחן (ים) שלריבית בריכוז שנקבעה בשלב 1.8. לתרכובות רעילות ביותר הגורמים למוות של תאים בכדאיות assay שלושה ימים טיפוסי 10, להתחיל עם טיפול במינון נמוך (כלומר, במערכת העיכול 50) ואופן הדרגתי להגדיל את הריכוז (כפולות של GI 50) של מתחם כל 2-3 שבועות עד חזק התנגדות הוא ציין. לחדש תקשורת ומתחם כל 3 ד.
  4. ברגע שהבחירה כבר יזמה, תקשורת / מתחם שינוי לערבב כל 3-4 ימים עד שיבוטים עמידים לצוץ. התנגדות על ידי הגדרה עולה כאשר תאים שטופלו להראות גדולה יותר צמיחה / כדאיות בטיפול תרופתי בהשוואה לטיפול אקוטי של תאי שליטה טופל DMSO.

3. בידוד שיבוטים תא בודדים

  1. בדוק צלחת תרבות באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד (הגדלה 40x) לאשכולות קיימא של תאים.
  2. שיבוטים משביע רצון מארק בתחתית הצלחת עם עט סימון. בחר שיבוטים שהם בגודל ממוצע (מושבות גדולות יותר עשוימקורן תאים מרובים) ומבודד היטב ממושבות אחרות. בחר שיבוטים באמצעות אחת משתי גישות שתוארו בשלב 3.3.
  3. גישת 1: באמצעות pipettor (איור 3)
    1. הסר תקשורת צמיחה ולשטוף עם PBS 1x כדי להסיר את כל תאים צפים.
    2. להשתמש בסימנים שחורים כמדריך לשיבוטים "לקטוף" עם קצה pipet (מצורף לpipettor, p200 רצוי).
    3. העברת שיבוטים לתוך צלחות 48-היטב עם תקשורת טרי 200 μl (עם ריכוז מתחם המחצית לאפשר התאוששות אופטימלית של תאים).
    4. לאפשר לתאים להתאושש במשך 2-3 ימים לפני הוספת 200 μl תקשורת טרי / ריכוז מתחם אידיאלי.
    5. תמשיך להשתנות תקשורת / מתחם כל 3-4 ימים וימשיך להרחיב את השיבוטים.
  4. גישה 2: שימוש בשיבוט דיסקים (איור 3)
    1. סמן שיבוטים כמתואר בשלב 3.2.
    2. מניחים 3 דיסקי מ"מ שיבוט בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה לא 5 מיליליטר של 0.25%rypsin-EDTA למשך 2 דקות.
    3. תקשורת לשאוב מצלחת המכילה שיבוטים עמידים וכיסוי שיבוטים עם דיסקי שיבוט טריפסין ספוגים באמצעות מלקחיים חד פעמי סטרילית.
    4. השאר במשך 1-2 דקות, תלוי כמה בקלות שיבוטים להרים את הצלחות, בחממה 37 ° C.
    5. להרים דיסקי שיבוט באמצעות מלקחיים סטרילי ולהעביר לתוך צלחות 48-היטב עם תקשורת 200 μl טרי וחצי ריכוז של מתחם.
    6. פיפטה מעלה ומטה בעדינות כדי לסלק את התאים מדיסקי שיבוט דגירה O / N ב 37 ° C (להשאיר שיבוט דיסקים בבארות).
    7. למחרת בבוקר, להסיר את דיסקי שיבוט מצלחות 48-היטב ולחדש בארות עם 200 μl תקשורת / מתחם טרי (ריכוז מתחם מחצית אידיאלי).
    8. שלושה ימים לאחר מכן, לחדש תקשורת עם הריכוז האידיאלי של מתחם.
    9. תמשיך לשנות את התקשורת / המתחם כל 3-4 ימים וימשיכו להרחיב את השיבוטים.

4. הערכת התואר של Resistance של שיבוטים מבודדים

  1. ברגע 10-20 מושבות מורחבות, ליצור GI 50 עקומות כמתואר בשלב 1 כדי להעריך את מידת ההתנגדות.
  2. תמיד כולל אוכלוסיות שליטה טופלו בDMSO בתהליך הבחירה. סביר מאוד להניח שהספקטרום של התנגדות הולך להיות גדול (כמה מראים חלקי ואילו אחרים מראים התנגדות מלאה). לאסוף כמה שיבוטים מכל אחד מהשיעורים האלה כמנגנון של התנגדות עשויה להשתנות בין שתי הקבוצות.

רצף 5. הדור הבא

  1. ספין למטה 2 מיליון תאים (שליטה ושיבוטים עמידים) (XG 500 במשך 5 דקות) בבקבוקוני 15 מיליליטר חרוטי עבור שני gDNA ואוסף RNA (ולכן 2 x 2 מ').
  2. לשטוף פעמיים עם 1x PBS ולהקפיא כדורים ב-80 ° C עד מוכן לבידוד.
  3. השתמש בערכת חילוץ מסחרית לבודד RNA או gDNA פי הפרוטוקול של היצרן.
  4. שלח דגימות עבור סידור הדור הבאתוך שימוש בפרוטוקול של הספק 10.

6. ביואינפורמטיקה ניתוח של דגימות (רצף כל-exome)

  1. Preprocess רצף נתונים לפי DNA-seq צינור תרגול הטוב ביותר 16.
    1. מפה כל קורא להתייחסות GRCh37 הגנום האנושי באמצעות BWA 17. המרת יישור SAM מעוצב דחוס לפורמט BAM הדחוס עם Samtools 18. יישור מיין לפי לתאם עם Samtools. להוסיף קבוצות קריאה באמצעות פיקארד. (לBWA הספציפי, Samtools ופיקארד פקודות, ראה טקסט משלים 1, קווי 1-4)
    2. סמן את כל הכפילויות קורא באמצעות MarkDuplicates פקודה מכלי פיקארד להגדיר 19. מדד בקובץ זה עם Samtools. (טקסט משלים 1, קווי 5-6)
    3. כדי למזער את הבסיסים תואמים בכל קורא, ליישר מחדש קוראים באופן מקומי באזורי מחסה הוספות או מחיקות קטנות באמצעות realigner indel 20. (טקסט משלים 1, קווי 7-8)
    4. כדי לשפר את accurac נוסףy של קורא גרסה, ציוני איכות בסיס אמפירי לכייל מחדש באמצעות כלי כיול ציון איכות בסיס. כלי כיול איכות הבסיס צריך לא רק ציון איכות ראשונית נכון, אלא גם לקחת בחשבון השתנות המשותף של מספר תכונות, כוללים קבוצה לקרוא, מחזור מכונה, עמדת בסיס, והקשר dinucleotide (בסיסים הנוכחיים קודמים +). צור BAM recalibrated עם PrintReads פיקארד. (לפקודות ספציפיות לצעד זה, ראה טקסט משלים 1, קווי 9-10)
    5. חזרו על שלבים 6.1.1 באמצעות 6.1.4 (טקסט משלים 1, קווים 1-10) עבור כל דגימת רצף.
  2. לזהות וריאציה אחת נוקלאוטיד (SNV) בכל שיבוט באמצעות גרסה לזווג קוראת tool19, 21-23. לכל שיבוט רצף, לרוץ גרסה לזווג קוראת באמצעות שיבוט ההורים כמתאים "נורמלי". (טקסט משלים 1, קו 11)
  3. סנן חוזרות, גרסאות באיכות גבוהה ולהתכונן לביאור עם כלי ביאור גרסה 24. Deprioritize variants לא משותף לכל השיבוטים העמידים. (ראה תסריט R בטקסט משלים 2)
  4. תסמן גרסאות עם כלי ביאור 25, 26. יש לי כלים ביאור גרסה רבים יישום אינטרנט נלווה המאפשר לנתונים יועלו ועובדו על שרת מרוחק.
  5. השתמש בכלי חיזוי השפעה תפקודית 27-29 לתעדף אלה גרסאות חזו שיש השפעה תפקודית גבוהה. כמו ביאור גרסה, מספר כלים זמינים לחיזוי השפעה תפקודי באמצעות ממשק אינטרנט.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למקסם את הפוטנציאל לגילוי נהגים פונקציונליים מפתח של התנגדות, בחר שיבוטים תא בודדים להרחבה, בדיקה פנוטיפי ורצף. כפי שמודגם באיור 4 א, ​​תאי HCT116 טופלו במשך תקופה ממושכת עם המתחם ציטוטוקסיות # 1 הוביל להופעה הספונטנית של שיבוטים עמידים שהמשיכה לגדול במהלך הטיפול (עיגולים שחורים מקווקוים). שיבוטים אלה נאספו באמצעות # גישת 1 מודגש באיור 3 ולאחר מכן התרחב לניתוח פנוטיפי. כפי שניתן לראות באיור 4, שיבוטים עמידים 1-3 כל הראו התנגדות משמעותית למתחם המס '1 ו# מתחם אנלוגי קרוב 2 (הכדאיות / צמיחה גדולה יותר) שלה, ואילו כל השיבוטים הראו רגישות להוולקייד מתחם ציטוטוקסיות שאינו קשור. בעקבות אישור של התנגדות פנוטיפי, gDNA היה מבודד והוגש לניתוח רצפים כל-exome. הכלים ביואינפורמטיקה יושמו כדי לצמצם בגרסות המבניות אלה שהם) חוזרים 1 ו -2) יש פוטנציאל להשפעה תפקודית (איור 5 א). גרסאות מבניות שפגשו שני קריטריונים אלה אושרו על ידי כלי רצף עצמאי. כפי שמודגם באיור 5, מוטציה missense הטרוזיגוטיים שזוהתה באמצעות רצף כל-exome אושר בשיטת סנגר הרצף (פנל עליון, רצף WT; פנל תחתון, רצף מוטציה). בעקבות אישור רצף, קו תא ההורים שימש במקור עבור assay ההתנגדות היה מהונדס גנטי לבטא cDNA המוטציה כדי לאשר את התפקיד של המוטציה תפקודית. כפי שמודגם באיור 6, ואילו ביטוי יתר של cDNA WT לא הצליח להקנות עמידות, נאלץ ביטוי של התנגדות פנוטיפי העניק באופן משמעותי את cDNA המוטציה למתחם מס '1, המאשר את התפקיד הפונקציונלי של וריאציה מבנית זו כנהג של התנגדות. כל חומרים כימיים המשמשים לצורך הניסוי הזה מפורטים בטבלה 1 טרונג>.

figure-results-1
איור 1. פריסה של צלחות assay ושליטה. צל כחול, בארות טיפול מתחם. צל לבן, בינוני בלבד. תרכובות בדילול סדרתי 1: 4 ומנוהלות בtriplicates (BD או EG). 2 תרכובות יכולות להיות מיושמות לכל צלחת.

figure-results-2
איור 2. עקומות כדאיות נציג. קו מקווקו אדום מייצג את היום 0 קריאה. ציר X מציין הגדלת מינון של מתחם לימין וציר y מייצג כדאיות היחסית לבארות שליטת DMSO. GI 100 = מינון שניתן להשגה 100% עיכוב צמיחה; GI 50 = מנה משמשת להפחתת כדאיות 50% משליטת DMSO.

_upload / 52,879 / 52879fig3.jpg "/>
איור 3. שתי גישות לקטיף שיבוטים עמידים להרחבה. גישת pipettor 1 השימוש להרים ולהעביר שיבוטים מוגדרים היטב לצלחות 48-היטב. 2 שימוש בגישה טריפסין ספוג דיסקי שיבוט להרים שיבוטים ולהעביר לצלחות 48-היטב.

figure-results-3
אישור איור 4. ההתנגדות השיגה עבור שיבוטים HCT116 למתחם המס '1 במבחנה. # מתחם () השיבוטים HCT116 1 עמיד יצאו בעקבות בחירתה של שלושת שבועות רצופים. הכדאיות (B) של שיבוטים שליטה ועמידים נבדקה לאחר טיפול 72 שעות בתרכובות שונות. מתחם המס '2 הוא אנלוגי קרובה של מתחם מס' 1. הוולקייד שימש כסוכן ציטוטוקסיות שליטה. הנתונים מוצגים כסטיית תקן הממוצע של שלושה + משכפל ביולוגי.

EP-together.within עמודים = "תמיד"> figure-results-4
זיהוי איור 5. של מוטציה ייחודית, חוזרת ונשנית (גרסאות נוקלאוטיד הבודד, SNVs) בגן בשיבוטי HCT116 1 עמידים # מתחם. זרימת עבודה () לזהות SNVs נוכח בכל השיבוטים העמידים וצפויה להיות השפעה תפקודית גבוהה על ידי MutationAssessor. אישור (ב) למוטציה בגן על ידי סנגר רצף.

figure-results-5
איור 6. מחדש ביטוי של התנגדות מוטציה העניקה גן למתחם מס '1 במבחנה. הכדאיות של שורות תאים המהונדסים HCT116 נבדקה לאחר טיפול 72 שעות במתחם המס' 1. HCT116-WT או שורות תאי מוטציה ביציבות להביע WT או cDNAs מוטציה של גן, בהתאמה. הנתונים מוצגים כo סטייה ממוצעת + סטנדרטיתו שלושה משכפל ביולוגי.

שם לדוגמא חומצת אמינו רקמות עיקריות זיגוסיות
C-33- p.E768fs * 44 צוואר רחם הטרוזיגוטיים
C-33- p.S860 * צוואר רחם הטרוזיגוטיים
CML-T1 עמ '.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue הומוזיגוטים
CP66-MEL p.C822F עוֹר הטרוזיגוטיים
CTV-1 p.0? haematopoietic_and_lymphoid_tissue הומוזיגוטים
EFO-27 p.Q130fs * 2 שַׁחֲלָה הטרוזיגוטיים
EFO-27 עמ '.? שַׁחֲלָה הטרוזיגוטיים
HCC2218 p.E467K חָזֶה הטרוזיגוטיים
J-RT3-T3-5 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue הומוזיגוטים
LNCaP עמ '.? בלוטת הערמונית הומוזיגוטים
LoVo עמ '.? המעי הגס הומוזיגוטים
נשירה-13 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue הומוזיגוטים
NALM-6 עמ '.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue הומוזיגוטים
NCI-H630 p.R680 * המעי הגס הטרוזיגוטיים
SKUT-1 p.L787fs * 11 רירית הרחם הומוזיגוטים
SKUT-1B PL787fs * 11 רירית הרחם הומוזיגוטים
SUP-T1 עמ '.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue הומוזיגוטים

שורות תאי -mutated הטבלה 1. MSH2. שורת תאים (שם דוגמא), החלפת חומצת אמינו, שושלת היוחסין של מוצא וזיגוסיות מצוינות.

שם לדוגמא חומצת אמינו רקמות עיקריות זיגוסיות
CCRF-CEM p.R100 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue הטרוזיגוטיים
CCRF-CEM עמ '.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue הטרוזיגוטיים
CW-2 p.Y130fs * 6 המעי הגס הומוזיגוטים
DU-145 עמ '.? הומוזיגוטים
GR-ST עמ '.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue הומוזיגוטים
HCT-116 p.S252 * המעי הגס הומוזיגוטים
IGROV-1 p.S505fs * 3 שַׁחֲלָה הומוזיגוטים
MN-60 עמ '.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue הומוזיגוטים
NCI-SNU-1 p.R226 * בֶּטֶן הומוזיגוטים
P30-OHK עמ '.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue הומוזיגוטים
PR-מל עמ '.? עוֹר הומוזיגוטים
ר' עמ '.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue
SK-OV-3 p.0? שַׁחֲלָה הומוזיגוטים
SNU-1,544 p.S2L המעי הגס הטרוזיגוטיים
SNU-1,746 p.E523K המעי הגס הומוזיגוטים
SNU-324 p.C233R לַבלָב הטרוזיגוטיים
SNU-324 p.V384D לַבלָב הטרוזיגוטיים
SNU-478 p.V384D לַבלָב הטרוזיגוטיים
בלוטת הערמונית הומוזיגוטים

שורות תאי -mutated הטבלה 2. MLH1. שורת תאים (שם דוגמא), החלפת חומצת אמינו, שושלת היוחסין של מוצא וזיגוסיות מצוינות.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחירה של קו תא (ים): אפיון של מדינה גנטית וחוסר יציבות גנומית

אין ספק, הגורם היחיד הקריטי ביותר בחשיפה בהצלחה קלינית מנגנוני התנגדות רלוונטיים היא בחירת קו התא הראשונית. שני גורמים צריכים להיחשב. ראשית, מטרה לבחור קו תא (ים) של אותו השושלת / תת סוג חסת התכונות גנטיות ההגדרה של המחלה (למשל., BRAF V600E מלנומה). חקירה של נתונים transcriptomic ומוטציה זמינים בפומבי לשתי שורות תאי 30-32 וגידולים ראשוניים / גרורות למגוון אינדיקציות 33,34 תקל על תהליך הבחירה. למרות זיהוי של שורות תאים עם שינויים גנטיים רלוונטיים מבחינה קלינית הוא אידיאלי, במקרים מסוימים זה עשוי להיות לא אפשרי בגלל חוסר שורות תאים זמינים או אפשרי בשל גורמים כמו קושי ואורכו של תהליך המיון.

> בנוגע לנקודה האמורה, גורם שני הוא לשקול לאחר מכן במהלך בחירת שורת תאים הוא הקלות או הכדאיות של התנגדות הקרנה באמצעות הקו הרצוי. לדוגמא, גורמים כגון הפצה ושיעורי מוטציה פנימיות יכולים להשפיע במידה רבה על המהירות של גילוי. לשם כך, יכולות להיות מנוצלת שורות תאים עם קינטיקה מהירה צמיחה וחסרה מנגנוני DNA MMR בתקווה שהופעתה של התנגדות ספונטנית יכולה להיות מואצת 35. בהתבסס על המאגר קוסמי, כמה שורות תאי מועמד קיימות עם מחסור באחד משני הגנים שעברו מוטציה לעתים קרובות MMR, MSH2 או MLH1 (לוחות 2 ו -3). לחלופין, אם שורות תאים של עניין לא קיימות פגמים נושאים בMMR, טיפול אקוטי עם מוטציות כימיות פיזיות או DNA תגובתי כגון סוכן אלקילציה -nitrosourea N -ethyl- N (ENU) יכול לשמש כדי לשפר חוסר יציבות גנומית. למרות ששני הגישות רשאית זה באופן משמעותיHorten הזמן להשיג שיבוטים עמידים ומעקב רצף, בדיקות פונקציונליות מחמירות צריכה להתבצע על גני מועמדים כמספר גדול יותר של אי-פונקציונלי, מוטציות נוסעים צפויות לצאת. SNVs יכול להיות דרגת הורה למקסם את הסיכויים לזיהוי מוטציות רלוונטיות מבחינה תפקודית. ראשית, בחירה אלה מוטציות שחוזרות על עצמם בשיבוטים עצמאיים תגדיל את סבירות מוטציות אלה הן נהגים של התנגדות. במקרה מוטציות חוזרות ונשנות אינן מזוהות, תוך התמקדות בSNVs שמתאים את מנגנון פעולה של התרופה (לדוגמא, יעד הסמים או מפעיל במורד הזרם ידוע של יעד התרופה) עשוי להיות משמעותי. סופו של דבר, את תקן הזהב הוא תמיד הערכה ניסיונית של פעילות התנגדות-הענקת SNVs המועמד על ידי ביטוי cDNA חוץ רחמי בתאי הורים תרופה רגישה.

ה- DNA לעומת רצף RNA

שיבוטים פעם עמידים כבר נוצרו, DNA ו / או RNAיכול להיות רצף בהתאם לצורך. רצפי DNA, או exome או רצף הגנום, יאפשר זיהוי של גרסאות germline וגופניים, כגון SNPs, indels ולהעתיק מספר הגרסאות. בעוד רצף exome עלות ידידותית יותר מתמקד ביצירת קוראת מאזורי קידוד ידועים, רצף הגנום יפיק נתונים רצף לכל הגנום אשר עשוי להקל על זיהוי של מוטציות באלמנטי קידוד שאינו כגון משפרי או miRNAs 36. עם זאת, מאז נתונים ביטוי גנים לא תעיד ברצפי DNA, שקשה לחזות שמוטציה (ים) עשוי להיות נהג פונקציונלי. בהקשר זה, הרצף של RNA, אם כי יקר יותר, מציע את היתרון הזה. העובדה שייעוד המוטציה מתבצע רק על מיני RNA מתבטאים משפרת את הסיכוי שהמוטציה של עניין עשויה להיות נהג פונקציונלי. בנוסף מאפשר סקר ממוקד יותר של מוטציות לבדיקה פונקציונלית מעקב, רצף RNA גםמציע יתרון הנוסף של להיות מסוגל לזהות שינויים גנטיים ביטוי, שחבור חלופי ומיני RNA chimeric רומן, כולל שילובי גן שעשוי לשמש גם נהגים חזקים כמו של התנגדות.

צינור ביואינפורמטיקה

פקודות דוגמא מסופקות להמחשה, אבל תיעוד והדרכות מפורטים יותר זמינים מהרחב מכון 16 ויש לקרוא ביסודיות לפני תחילת ניתוח NGS. הפקודות הבאות מיועדות לסביבת UNIX פגז במערכת שבה כל הכלים ומידע התייחסות הותקנו מראש. פקודות אלה גם להניח קבצי FASTQ רצף לזווג-הסוף המכיל קורא משתי דגימות, בשם "הורים" ו- "עמיד", כבר קיבל מהספק והניח בספרייה "נתונים". ברוב המקרים צריכים להיות מותאמות בפקודות אלה או מותאמים ליישום ספציפי באמצעות arg נוסף של שורת הפקודהuments (למשל, הוספה "-t 8" לפקודת BWA מאפשרת פעולה מרובה על פני 8 ליבות מעבד). קבוצות קראו (שלהקצות מערכים לדגימות ביולוגיות), חייבות לעתים קרובות ניתן להוסיף לקבצי BAM גם אם יש דגימה אחת בלבד לכל קובץ BAM, על מנת לעמוד בדרישות פורמט קובץ לכלים מסוימים. קראו פרמטרים קבוצת RGID, RGSM, RGPL, RGPU, וRGLB יכול להיות מחרוזות שרירותיות המתארות את שם המדגם, פלטפורמת רצף, ואסטרטגיה ספרייה.

במבחנה לעומת מבחני in vivo

למרות שכמה מנגנוני התנגדות זוהו על ידי בחירה במבחנה אומתו להיות רלוונטי מבחינה קלינית, קיים אפשרות שהמנגנונים לא יכולים לשמש מנגנונים רלוונטיים או דומיננטיים כמו של התנגדות קלינית. אחת סיבות לכך עשויות לכלול תפקיד חיוני למייקרו-הסביבה בנהיגת התנגדות לטיפול, רכיב שהוא נטול בניסוי הפרוטוקול / ההתקנה דiscussed עד כה. ואכן, מספר מחקרים הראו כי חומרים אנטי-סרטניים שמסוגלים להרוג תאי גידול כבלתי יעילים כאשר התאים הסרטניים בתרבית בנוכחות של תאי סטרומה רומזים מנגנונים מולדים של התנגדות שמעניק סטרומה 37,38. לזהות מנגנונים מושרה סטרומה כגון רכשו התנגדות, ניתן לשקול ביצוע שיתוף תרבות במבחנה או במבחני עמידות גידול vivo. מאז assay לשעבר הוא די מורכב, רבים נקטו יצירת xenografts גידול עמידה לתרופות לטיפול בתפקיד הפוטנציאלי של סטרומה בנהיגת התנגדות. מחקרים כאלה חשפו 5 וייחודיים 39 שני מנגנונים הזהים של התנגדות ביחס לבחירה במבחנה, רומזים כי סטרומה אכן עשויה לשחק תפקיד באחרון. עם זאת, יש להיות מודע לאורכו של זמן זה עלול לקחת כדי ליצור גידולים עמידים כגון ואת המורכבות של הניתוח-complexitie הגנומי המעקבים בשל ההטרוגניות המולקולרית ותאית תוך ממאירות.

זיהוי יעד

בנוסף לחשיפת מנגנוני עמידות לתרופה, גישת פרופיל הגנומי מבוסס NGS זה יכול להיות מיושמת גם כדי לזהות מטרות סלולריות של בדיקות כימיות. מבחינה הסטורית, שיטות משוחדת מרובות כבר משמשות לזיהוי המנגנונים התאיים של פעולה ומטרות של כימיקלים במשקל מולקולריים נמוכים עם פעילות ביולוגית, כוללים טיהור זיקה בשילוב עם פרוטאומיקה כמותית, שיטות הגנומי שמרים, הקרנת RNAi, ומסקנה חישובית גישות 40. כהרחבה להבהרת מנגנוני סמים התנגדות באמצעות פרופיל הגנומי או transcriptomic מבוסס NGS של אוכלוסיות תאי phenotypically עמידות, זיהוי של וריאציות ייחודיות חוזרות אחת נוקלאוטיד (SNVs) או שינויי ביטוי המאפשרים התנגדות יכולה להציע תובנות יעדים סלולריים פונקציונליים של תרכובות. Tשלו מבוסס על הרעיון שקבוצת משנה של מנגנוני התנגדות נצפו עשויה להיות כרוך מוטציות חוזרות ונשנות בגנים המקודדים את חלבון היעדים הישירים של המולקולה הקטנה. לאחרונה, כמה דיווחי תוקף השירות של הגישה, במיוחד על ידי שילוב עם גישות אחרות, כוללים פרופיל רגישות שורת תאי הסרטן בקנה מידה גדולה, לחשיפת היעדים הסלולריים של מולקולה קטנה בוחן 9,10.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עמלות פרסום לכתבה זו משולמות על ידי H3 ביו-רפואה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לעמיתינו ב-H3 Biomedicine על המשוב שלהם במהלך הכנת כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות 48 בארותפישר סיינטיפיק07-200-86 הרחבת שיבוטים
צלחות 96 בארותפישר סיינטיפיק07-200-588יצירת עקומות GI50
CellTiter-GloPromegaG7572בדיקת כדאיות
דיסקי שיבוט (3 מ"מ)שיבוטי SigmaZ374431קטיף
מלקחיים סטרילייםUnomedicalDF8088Sקטיף שיבוטים
RNeasy Plus ערכת מיצוי RNAQiagen74134בידוד RNA
דם ורקמות ערכת מיצוי DNeasyQiagen69581בידוד gDNA
GATKהמכוןIndel realigner
MuTectהמכוןהרחב כלי קריאה לוריאנט
מזווג Oncotatorביאור וריאנטהמכון
MutationAccessorהרחב כליחיזוי השפעה פונקציונלית
הרחב כלי הרחב של המכון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, W. R. A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy. Cell. 147 (1), 26-31 (2011).
  2. Housman, G., et al. Drug resistance in cancer: an overview. Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).
  3. Balbas, M. D., et al. Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design. Elife. 2, e00499(2013).
  4. Joseph, J. D., et al. A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509. Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).
  5. Korpal, M., et al. An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide). Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).
  6. Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
  7. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
  8. Whittaker, S. R., et al. A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition. Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).
  9. Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance. Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).
  10. Adams, D. J., et al. NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes. ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).
  11. Bhang, H. E., et al. Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding. Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).
  12. Boland, C. R., et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).
  13. Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein. Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).
  14. Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes. Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).
  15. Ahmed, D., et al. Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines. Oncogenesis. 2, e71(2013).
  16. GATK. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/gatk/guide (2015).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Picard. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: http://broadinstitute.github.io/picard (2015).
  20. McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).
  21. Cibulskis, K., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
  22. Larson, D. E., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
  23. Koboldt, D. C., et al. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
  24. Oncotator. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/oncotator (2015).
  25. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res. 38 (16), e164(2010).
  26. Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly. 6 (2), 80-92 (2012).
  27. Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
  28. Ng, P. C., Henikoff, S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).
  29. Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20(2013).
  30. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  31. Abaan, O. D., et al. The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology. Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).
  32. Forbes, S., et al. Cosmic 2005. Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).
  33. Shah, S. P., et al. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers. Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).
  34. Behjati, S., et al. Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma. Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).
  35. de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance. J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).
  36. Kotani, A., et al. A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells. Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).
  37. Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).
  38. Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase. Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).
  39. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  40. Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vitro SelectionWhole Exome SequencingGI 50Sanger Sequencing

מאמרים קשורים