מודל טנוטומיה אכילס ופציעת כוויות של אוסיפיקציה הטרוטופית מאפשר מחקר אמין של היווצרות עצם חוץ רחמית הנגרמת על ידי טראומה ללא יישום של גורמים אקסוגניים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ישירה עכבר טראומה / צרוב דגם של Heterotopic התאבנות
במאמר זה
סיכום
תקציר
התעצמות הטרוטופית (HO) היא היווצרות עצם מחוץ לשלד הנוצרת בעקבות טראומה גדולה, פציעות כוויות ופרוצדורות כירורגיות אורתופדיות. רוב המודלים של בעלי חיים המשמשים לחקר HO מסתמכים על יישום של חומרים אקסוגניים, כגון חלבון מורפוגנטי של עצם (BMP), מבני תאים אקסוגניים או מוטציות גנטיות באיתות BMP. בעוד שמודלים אלה שימושיים, הם אינם משחזרים במדויק את המצבים הדלקתיים הגורמים לרוב המקרים של HO. כאן אנו מתארים מודל צריבה/טנוטומיה בעכברים המייצר HO ממוקד באופן מהימן. פרוטוקול זה כולל יצירת כוויית מגע בעובי חלקי של 30% משטח הגוף הכולל על עור הגב וכן חלוקה של גיד אכילס בנקודת האמצע שלו. הסתמכות אך ורק על פציעה טראומטית כדי לגרום ל-HO במיקום צפוי מאפשרת מחקר מהלך זמן של היווצרות עצם הטרוטופית אנדוכונדרלית מתהליכים פיזיולוגיים פנימיים וסביבה בלבד. שיטה זו יכולה להיות חיונית בהבנת המסלולים הדלקתיים והאוסטאוגניים המעורבים ב-HO המושרה על ידי טראומה. יתר על כן, מכיוון ש-HO מתפתח במיקום ובמהלך זמן צפויים במודל זה, הוא מאפשר למחקר לשפר אסטרטגיות הדמיה מוקדמות ושיטות טיפול כדי למנוע היווצרות HO.
מבוא
התעצמות הטרוטופית (HO) היא היווצרות עצם חוץ רחמית שבה תאים אוסטאו-פוטנטיים מושרים באופן חריג ליצור עצם אנדוכונדרלית מחוץ לשלד. בעוד שהפרטים של מסלול היווצרות ה-HO עדיין לא ידועים ברובם, פרדיגמה מקובלת כוללת שלושה גורמים מרכזיים: אירוע מעורר דלקתי, נישה מתירנית ותאי גזע מזנכימליים המסוגלים ליצור עצם. 1-3 HO היא תחלואה נלווית שכיחה המסבכת למעלה מ-60% מפציעות הכוויות החמורות, 65% מפציעות הקשורות ללחימה ו-10% ממקרי הניתוחים האורתופדיים הפולשניים. 4,5 עם זאת, לעתים קרובות קשה לחזות היכן ייווצר HO מכיוון שהוא יכול להתרחש באתרים של פציעה מקומית או במקומות מרוחקים שעלולים להיות ללא פגיעה. שונות זו במיקום מקשה על התערבות מונעת כדי למנוע היווצרות עצם תגובתית באופן ממוקד מקומי. ישנן גם צורות מולדות של HO כגון פיברודיספלזיה ossificans progressiva (FOP) בהן חולים מועדים להתפתחות HO חזק בתגובה לטראומה קלה או עלבון דלקתי. מודלים רבי עוצמה של בעלי חיים המשתמשים בעכברים טרנסגניים שיחזרו את הפנוטיפ הזה וסיפקו תובנה לגבי המסלולים המולקולריים שעשויים להיות חשובים גם ב-HO המושרה על ידי טראומה.6-9 מחקר תרגומי על הפתוגנזה של HO לא מולד השתמש במגוון רחב של מבנים, החל מפציעה בלבד ועד להשתלה של חומרים ו/או תאים אוסטאו-אינדוקטיביים אקסוגניים. 10-13
בעבודתנו הקודמת אימתנו מודל פשוט ואמין של היווצרות HO בעכברים שאינו דורש מתן של חומר אקסוגני כלשהו. מודל זה יצר שני תנאים מרכזיים להתחלת HO: טראומה מקומית ודלקת גלובלית. זה הושג באמצעות שימוש בטנוטומיה אכילס (טראומה מקומית) בשילוב עם פציעת כוויה מרוחקת (דלקת גלובלית). עכברים קיבלו את שני הטיפולים במקביל ונמצא כי פיתחו כמות חזקה של HO שניתן לנתח באמצעים היסטולוגיים, רדיולוגיים ומולקולריים. מעניין שפציעת כוויות במקביל הגדילה משמעותית את כמות ה-HO שנוצרה והאיצה את מהלך הזמן ההתפתחותי שלה. 14-16 HO התפתח באתרים צפויים סביב הקלקנאוס, מפרק הקרסול והשוקה/פיבולה של הגפה שקיבלה את הטנטוטונומיה. האמינות של התפתחות HO במיקום ידוע אפשרה בחינה ממוקדת של תכונות מולקולריות והיסטולוגיות בשלבים המוקדמים של התעצמות חוץ רחמית. 14,17 עד כה, 100% מהעכברים (מעל 50 בעלי חיים) עם טנוטומיה ופגיעת כוויות במקביל פיתחו HO. בנוסף, נערכו הדמיה דו-ממדית ותלת-ממדית אורכית וניתוח ספקטרוסקופי כדי לבחון את דפוס הגדילה וההרכב הביוכימי של HO.15,16
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הצהרת אתיקה: נהלי כל החיה בוצעו בהתאם קפדן עם תרגול חיה טוב כפי שהוגדר בהנחיות המופיעות במדריך לשימוש וטיפול בחי מעבדה: המהדורה השמינית של המכון לחקר בעלי החיים מעבדה (ILAR, 2011) והיו אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת מישיגן (PRO0001553).
1. ניתוחי עכבר
הערה: C57BL הישן 8-10 השבוע השתמש / 6 עכברים. גם בגילים אחרים, רקעים, וזנים של עכברים יכולים לשמש כדי לבדוק תנאים שונים או איפור גנטי. עבור חלק tenotomy של ההליך, לשמור על תנאים סטריליים באמצעות מסיכת פנים, כובע שיער, ושמלת סטרילי, כפפות, ומכשירים. אתרי כירורגי צריכים להיות מוכנים סטרילי עם povidone- יוד וכורך סטרילי. הימנע היפותרמיה באמצעות כרית חימום וטרינרים והתחממות פתרונות החייאה עד 37 מעלות צלזיוס לפני ניהול כלליtion.
- להרדים את העכבר באמצעות 2.5% isoflurane בשאיפה. השתמש חרטום לעזוב את dorsum ואחורי-גפיים נגישים בקלות. התאם את שיעור ממשל isoflurane לשמור על קצב מתאים נשימה וצבע של קרומים ריריים ולהבטיח הרדמה על ידי בדיקת טונוס שרירים, קמצוץ הבוהן, ורפלקס מצמוץ. החל משחת עיניים תפל לעיניו של העכבר כדי למנוע פגיעה בעין יבשה במהלך ההליך. לשמור על טמפרטורת גוף מתאימה באמצעות כרית חימום וטרינרים או circulator מים חם מתחת לשדה הניתוח.
- לנהל עצירות, 0.1 מ"ג / קילוגרם, תת עורי מייד לפני הניתוח לשיכוך כאבים.
- מקרוב לגלח את האתר כירורגית על הכף האחורית השמאלית באמצעות קוצץ מהעקב עד הברך.
- מקרוב לגלח dorsum של העכבר, מתחיל מעל עמוד השדרה והארכת האזור המגולח בצד השמאל של קו האמצע הגב, ניקוי שטח לפחות 2 סנטימטרים X 3 סנטימטר כדי להתאים את פציעת הכווייה.
- הכן את האתר כירורגית, כולל הכף האחורית בברך באמצעות סקראבס povidone- יוד 3 לסירוגין.
- לבצע חתך אורכי לאורך ההיבט המדיאלי של גיד אכילס עזב. להאריך את החתך כך ניתן דמיין בקלות גיד אכילס; כ 0.5 סנטימטר.
- בצע tenotomy אכילס עם נתיחה חדה של הגיד באמצע עם מספריים חדים רקמה. הכנס להב אחד המספריים הרקמה במטוס הרקמה מתחת לגיד ולנתח יחד את המטוס עד שהלהב הוא באמצע הגיד. סגור את להבי המספריים לנתק את הגיד בצורה חדה.
הערה: ודא הכללה של כל הגידים האחוריים כוללים הגסטרוקנמיוס, soleus, וגידי Plantaris. - להשיג עצירת דימום על ידי הפעלת לחץ עם גזה סטרילית (לא אמור להיות דימום מינימאלי) ולסגור את החתך בעור עם תפר 5-0 vicryl.
- לבצע צריבת העובי החלקית הגב עם בלוק אלומיניום במשקל גרם 35 עם measuremen המשוערTS 2 סנטימטרים X 2 ס"מ על 3 סנטימטר מחומם ל -60 מעלות צלזיוס באמבט מים להחיל את dorsum המגולח של העכבר במשך 17 שניות.
הערה: השג את עומק הכווייה המתאים על ידי מנוחה הבלוק על גבי העכבר הרדים, להבטיח כי את כל פני השטח של הבלוק הוא במגע עם העכבר, לעומת זאת להימנע מהחלה כל לחץ נוסף לבלוק, כלומר, לאפשר את כוח משיכה כדי להיות הכוח היחיד שהחזיק את הגוש במקום. ידית פלסטיק דקיקה שצמודה אל צד אחד של הבלוק היא נוחה למניפולציה, ייצוב, ואחזור מאמבט המים החם. זו תיצור שטח גוף הכולל של כ -30% לשרוף בC57BL / 6 עכבר 8-10 בן שבוע. כווייה קשר זה נבחרה על פני שיטות אחרות (צריבת להבה או לחלוט) בשל האחידות של עומק כווייה על הפצע והשחזור בין בעלי החיים. - ייבש את אתר הכווייה בגזה ולהחיל הלבשה Tegaderm.
- לנהל נוזלי החייאה חיממו: פתרון מיליליטר 1 של Lactated רינגרזריקת intraperitoneal ו -0.5 הזרקה תת עורית מיליליטר. ממשל חד פעמי זה של החייאה הוא נאות להתאוששות מהפציעה הכווייה וtenotomy.
הערה: אל תחזור עכברים מורדמים לכלובי דיור עם עכברים אחרים, בית בנפרד בכלובים נקיים תחת ניטור עד עכברים הם התאוששו באופן מלא. התאוששות אופיינית מתרחשת בתוך 1-6 שעות. אתרי צריבה בדרך כלל לרפא בתוך 2-4 שבועות ומסובכים לעתים רחוקות על ידי זיהום פצע אם המשיכו בסביבות דיור נקיות. - לנהל 0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות הזרקה תת עורית בכל 12 שעות במשך 3 ימים לאחר ההליך. צג צמיחת HO עם סריקות μCT סידוריים במרווחים מתאימים. צמיחת עצם מחוץ לרחם היא ראשונה שלאחר ניתוח בסביבות 3 שבועות ניכרו על ידי μCT.
הערה: רוב פיתוח HO הושלם על ידי 9 שבועות לאחר ניתוח. אנחנו לא נצפו הבדל בנפח HO או מיקום עם μCT חזר סריקות דו שבועי במשך 15 שבועות בהשוואה לנקודת סיום אחת μCT לסרוק בגיל 15 שבועות.בסופו של הניסויים, להרדים את כל העכברים עם CO 2 משאיפת פי הנחיות מוסדיות ולאמת מוות עם נקע בצוואר הרחם לאחר 10 דקות.
2. μCT רכישה וניתוח
- אבטח את העכבר מורדם על מיטת הסורק במצב שכיבה. הדבק את הגפיים האחוריות היטב למיטה כדי למנוע נשימת חפץ תנועה. כלול את האוויר, מים, וhydroxyapatite מכיל פנטום מתחת לעכבר לכיול תמונה.
- פתח את תוכנת עצם ניתוח ולהגדיר אזור של העניין (ROI) המקיף את שני גפיים אחוריות ממפרק ירך proximally לקצה הכף האחורית distally. להשיג תמונה באמצעות הפרמטרים הבאים:. 80 קילו וולט, 500 מיקרו-אמפר ו1,300 חשיפה msec, גודל voxel 48 מיקרומטר 14,15
- לכייל את התמונה ליחידות Hounsfield (האוניברסיטה העברית) על ידי ציור את ההחזר על ההשקעה בכל אחת משלושת תאי הפנטום ומזין את הצפיפות הממוצעת בשדות המתאימים בהתוכנה.
- שימוש באפשרות "חוטף" בתוכנה, רי-אוריינט את התמונה כך השוקה של הגפיים האחורי השמאלי מקבילה לאורך ציר Z כדי לאפשר את התצוגה אנטומיים הברורה לתיחום של מבני orthotopic קליפת המוח עצם וHO.
- החל בברך, לגלול distally דרך פרוסות התמונה עד HO הוא נתקל. שימוש בכלי שגם במדריך, לעשות את ההחזר על ההשקעה סביב עצם חוץ רחמי על כל פרוסה -5 ממשיכה distally דרך הכפה או עד HO כבר עלה. השתמש בכלי להסיק להאריך ולתפור ROIs יחד להחזר על השקעה אחד שמכיל את כל HO.
- הפוך את ההחזר על השקעת 3D ולבחור את תפריט הניתוח. חשב את נפח העצם על ידי הגדרת ערכי הסף התחתונים ועליונים בצורה הטובה ביותר להציג את חלון העצם. השתמש באותם ערכי סף שנקבעו לכל הסריקות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר הנוכחי, את הפרוטוקול מתואר למודל העכבר שפורסם בעבר של טראומה / לשרוף מושרה HO. 14-17 זה כרוך ביצירה של פציעת שריר-שלד מקומי במקביל לtenotomy אכילס ועלבון דלקתי העולמי בעובי חלקי לשרוף פציעה. התוצאה היא היווצרות אמינה של עצם תגובה באתר tenotomy שניתן אחריו עם הדמיה סידורי. עד כה, כל העכברים (יותר מ -50) שספגו שתי tenotomy אכילס ולשרוף פציעה פיתחו סכום מדיד של HO באתר tenotomy. כדי לכמת את היווצרות העצם מחוץ לרחם, פרוטוקול μCT תמונה מכויל משמש בכל נקודת זמן רצויה. ה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אוסיפיקציה הטרוטופית מייצגת ליקוי תפקודי משמעותי העומד בפני חולים הסובלים מטראומה, כוויות והליכים פולשניים של שרירים ושלד. האוכלוסייה בסיכון הגבוה ביותר היא חיילים בסכסוכים מודרניים עם פציעות פיצוץ חמורות ממנגנונים כמו מטעני חבלה מאולתרים (IED). 18 שריון גוף משופר ויחידות רפואיות הממוקמות קדימה מאפשרים הישרדות משופרת של פציעות גפיים חמורות. לאחר ייצוב ראשוני ותיקון של הפגיעה בגפיים, חולים אלה נמצאים בסיכון גבוה לפתח HO.18 למרות השכיחות והעומס הרפואי, מעט יחסית ידוע על פרטי התפתחות HO. באופן ספצ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף
תודות
אנו מודים לאמנדה פייר, ל-CMI ולקתי סוויט ול-ORL ב-UM על הסיוע בהדמיה וניתוח של μCT. מימון: BL ממומן על ידי 1K08GM109105-01 ופרס הקרן הלאומית לכירורגיה פלסטית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 עכברים | מעבדת ג'קסון | 664 | בני 8-10 שבועות |
| איזופלורן – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | תמיסה של 0.3 מ"ג/מ"ל |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 תפרי Vicryl | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 ס"מ x 7 ס"מ | 3M | 1624W | חתוך לשניים כדי לכסות כראוי את אתר השריפה |
| ומיקרו; CT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare הדמיה פרה-קלינית, לונדון, אונטריו, קנדה | ||
| Microview 2.2 יישום ניתוח עצמות מתקדם | GE Healthcare הדמיה פרה-קלינית, לונדון, אונטריו, קנדה |
מקורות
- Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
- Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
- Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
- Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
- Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
- Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
- Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
- Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
- Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
- Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132(2014).
- Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
- Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
- Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
- Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
- Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
