יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

האלימות של חיידקים פתוגנים גראם שלילי רבים תלויה במערכות הפרשה מיוחדות לחטוף תאי מארח האיקריוטים. חיידקים משתמשים במערכות הפרשה אלה להזריק חלבוני חיידקים ארסי (effectors) לתא המארח כדי לווסת את מגוון פעילויות סלולריות וביוכימיים. המחקר של חלבוני מפעיל לא רק סיפק תובנה מדהימה להיבטים בסיסיים של מארח / אינטראקציות הפתוגן אלא גם לביולוגיה הבסיסית של תאים האיקריוטים ^1. אפנון של אפופטוזיס תא המארח הוכח להיות מנגנון ארסיות חשוב עבור רבים פתוגנים תאיים, ומספר חלבוני מפעיל ויסות אפופטוזיס זוהה ^2-9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים פעילותם להישאר חמקמקים במקרים רבים.

אפופטוזיס, צורה של מות תא, ממלא תפקיד חשוב בתגובה חיסונית לזיהום ^10. יש שני מסלולים עיקריים שמוביל לאפופטוזיסזוהה: מיקוד מיטוכונדריה (אפופטוזיס הפנימי) או התמרה ישירה של האות באמצעות קולטני מוות של תאים בקרום הפלזמה (אפופטוזיס החיצוני). המסלול הפנימי או בתיווך מיטוכונדריה המוות של תאים מופעל על ידי אותות תאיים וכרוך בהפעלה של Bax ובק, שני חברים פרו-אפופטוטיים של משפחת Bcl-2. משפחה זה מורכב מחלבוני רגולטור בעד ונגד אפופטוטיים ששולטים תא מוות ^11-14. הפעלה של אפופטוזיס מובילה לoligomerization של Bax ובק ואחריו permeabilization הבא של הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, וכתוצאה מכך שחרור ציטוכרום C לתוך הציטופלסמה. שחרור ציטוכרום C יוזם הפעלה של caspases מפעיל 3 ו -7 באמצעות הפעלה של caspase 9 בapoptosome ^15. זה מוביל לproteolysis של מצעים נבחרו ש, בין יתר, בתוצאות החשיפה של phosphatidylserine על פני תא ¹⁶ ומשחרר DNase ייעודי שברי פרקromatin ^17,18.

כדי לקבוע היכן בתוך המפל אפופטוטיים חלבון מפעיל בודד מפריע, מערכת ביטוי מושרה הועסקה ^19. מערכות רגולטוריות לביטוי מותנה של transgenes היו כלי רב ערך בניתוח הפונקציה של חלבון בתוך התא או חשיבותו לרקמות, איברים ופיתוח גוף, כמו גם בייזום, התקדמות ותחזוקה של המחלה ^20-23. בדרך כלל, מערכות בקרה מושרה, כגון מערכת ט ^'24 מועסקים כאן, יוצרות יחידת שעתוק מלאכותית (ראה איור 1). מרכיב אחד הוא גורם מהונדס באופן מלאכותי שעתוק נקרא TTA (activator תעתיק טטרציקלין תלוי), שהוקם על ידי מיזוג של מדכאי שעתוק חיידקי TetR ²⁵ לתחום חלבון יונקים שמתווך הפעלת תעתיק או השתקת ^24,26. המרכיב השני הוא היברידיאמרגן, כינה TRE (אלמנט טטרציקלין מגיב), בהיקף של אמרגן מינימאלי אוקריוטים, המכיל לפחות TATA-תיבה ואתר ייזום שעתוק, הצטרף לחזרות מרובות של אתר ה- DNA מחייבת אותו המקור לTetR, TETO ^24,25. המרכיב השלישי הוא יגנד הטבעי של TetR, טטרציקלין או אחד מנגזרותיו, כגון anhydrotetracycline או דוקסיציקלין ^25. עם בנוסף ליגנד למדיום התרבות, TetR מאבד זיקתה לTETO ומנתק מTRE. כתוצאה מכך, שעתוק של גן המטרה הוא בוטל. ביטוי transgene יכול, ובכך, להיות מבוקר היטב באופן זמן ותלוי-מינון בשתי תרבית התאים ובחיות ^20,23,24. עם TTA, ביטוי transgene מתרחש constitutively, אלא בנוכחות של טטרציקלין. זה יכול להיות חסרון בחקר חלבונים רעילים לתאים סרטניים או בגלל טטרציקלין יש ראשון שהוסר מהמערכת, לפני שהשתקף transgenen מתרחש וניתן לנטר את ההשפעות של חלבון המטרה בתא. זה יכול להיות זמן רב ולא תמיד מלא, במיוחד בבעלי חיים מהונדסים ^27. כדי לטפל במגבלה זו, מוטציה TetR עם תגובה הפוכה לנוכחות של דוקסיציקלין שימשה כדי ליצור גורם שעתוק חדש, rtTA (הפוך TTA) ^28. זה רק נקשר לTRE ו, במקביל, מפעיל שעתוק בנוכחות דוקסיציקלין. דליפות שייר של המערכת, כלומר., ביטוי transgene בהעדר גורם שעתוק קשור-TRE, שמקורו גם (i) מהשפעות עמדה באתר אינטגרציה הגנומי, (ii) מTRE עצמו ^29, או (iii) שמאינו -specific מחייב של TTA / ²⁸ rtTA, היה ממוען על ידי החדרת משתיק תעתיק נוסף, כינה TTS (משתיק קול תעתיק טטרציקלין תלוי) ³⁰ למערכת. הוא יוצר רשת רגולטור כפולה יחד עם rtTA (ראה איור 1).בהעדר דוקסיציקלין, TTS נקשר לTRE ופעיל כיבוי כל שעתוק שנותר. בנוכחות של דוקסיציקלין, TTS dissociates מTRE וrtTA נקשר בו זמנית גרימת ביטוי של גן המטרה. שכבה נוספת זו של החמרה לעתים קרובות יש צורך לבטא את החלבונים רעילים לתאים פעילים מאוד ^31-34.

שימוש במערכת כפול רגולטור לפיקוח הדוק זה, המפל אפופטוטיים יכול להיות יזם בצעד שהוגדר מאפשר ניתוח של האם חלבון מפעיל נתון יכול להפריע אינדוקציה אפופטוזיס. שיטה זו יכולה לא רק לשמש כדי לחקור את הפעילות האנטי-אפופטוטיים של חלבוני מפעיל חיידקים, אלא גם לביטוי מושרה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לנתח הפרעה למסלולי איתות אחרים.

1. דור של שורות תאי יציבות המבטאות את החלבון של ריבית

1. הכן תקשורת על ידי הוספת FCS מומת חום ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין למסחרי Dulbecco's זמין השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת Glutamax-אני, פירובט, ו -4.5 ג '/ D-גלוקוז L.
2. לטפח HEK293 תאים בתקשורת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2. תת לטפח תאים בכל יום שלישי. הסר את המדיה וresuspend התאים 15 מיליליטר תקשורת טרי. פיפטה 1 מיליליטר לתוך בקבוק ² תאים חדש 75 סנטימטרים תרבות ולהוסיף 14 מיליליטר תקשורת.
3. לנתח את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
4. תאי זרע HEK293 בצלחת 6-גם בצפיפות של 2 x 10 ⁵ תאים לכל היטב דגירה במשך 24 שעות.
5. עבור transfection משתמש בפרוטוקול המסופק על ידי היצרן של מגיב transfection. Transfect תאים עם pEGFP-C2 או pEGFP-C2-CaeB באמצעות מגיב transfection. לפני שימוש, לחמם את reag transfectionאף אוזן גרון והתקשורת הנדרשת לRT. השתמש יחס 3: 1 של מגיב transfection ל- DNA.
   1. בפירוט, פיפטה 1.5 μl של מגיב transfection ישירות לתוך 50 μl של מדיום סרום ללא DMEM. ליצירה מורכבת, פיפטה 0.5 מיקרוגרם של ה- GFP DNA קידוד או GFP-CaeB לתערובת המכיל מגיב transfection דגירה במשך 15 דקות ב RT.
   2. Transfect תאים על ידי הוספת תערובת התגובה באופן טיפה חכמה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ למשך 24 שעות.
6. להוסיף 1 מ"ג / מיליליטר geneticin לבחירה של שיבוטים GFP חיובי על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.
7. לאחר 6 ימים, בודד תאים בודדים על ידי cytometry זרימת מיון בצלחת 96-היטב מחסה בינונית וsupernatant HEK293 ביחס של 1: 1. צור supernatant HEK293 מתאי ומחוברות HEK293 תרבותיים שcentrifuged במשך 15 דקות ב4966 x גרם.
8. ביום הבא, להחליף בינוני תרבות עם מדיום המכיל 1.50; מ"ג / מיליליטר geneticin. שינוי תקשורת פעם בשבוע. אם התאים בצורת monolayer ומחוברות, להעביר אותם לצלחת 24 גם. תת לטפח תאים פעמיים בשבוע ביחס של 1: 5 במדיה המכיל 1.5 מ"ג / מיליליטר geneticin. לבסוף, לנתח את אחוז תאי GFP החיובי על ידי ניתוח immunoblot וcytometry זרימה.

2. ניתוח של שורות תאי יציבות על ידי ניתוח immunoblot

1. הסר את supernatant ולשטוף את התאים דבקו פעם עם PBS החם. Resuspend התאים של חיץ מדגם Laemmli 2x, חום 100 μl במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחסן ב -20 ° C.
2. לטעון כ 4 x 10 ⁴ תאים לדגימה על 12% ג'ל SDS-עמוד. בנוסף, עומס 6 μl של סולם חלבון מסחרי כסמן משקל מולקולרי. הפעל ג'לי במערכת ג'ל אלקטרופורזה תחת מתח קבוע של 180 V דקות 45-60 עם חיץ פועל 1x Laemmli.
3. חלבונים למחוק על ממברנות PVDF (גודל נקבובית של 0.45 מיקרומטר) במתח קבוע של 16 V עבור 60 דקות באמצעות תא העברה חצי יבש SD חוצה כתם.
4. קרומי בלוק ב 10 מיליליטר של חלב ללא שומן יבש 5% ב- PBS / Tween% 0.05 20 (MPT) במשך שעה 1 ב RT.
5. לדלל 4 μl של נוגדן-GFP אנטי ב 4 מיליליטר של MPT דגירה קרומי O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
6. בצע שלושה שלבי כביסה 10 דקות עם 10 מיליליטר של PBS / 0.05% Tween 20.
7. דגירה קרומים עם 0.8 μl של נוגדנים משני peroxidase מצומדות חזרת ב 4 מיליליטר של MPT.
8. לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב2.6) ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון.

3. לנתח את התאים באמצעות Cytometer זרימה.

1. Resuspend תאים בPBS. השתמש HEK293 תאים כביקורת שלילית להתאים קדימה scatter (FSC) וצד פיזור (SSC), כך שהתאים בקנה מידה. צייר שער על תאי חיים על ידי נטרול כפילויות תא, אגרגטים ופסולת תא.
2. התאם את הצינור מכפיל רווח (PMT), כך שהתאים בלא כתם הם בשמאל הקיצוני של ההיסטוגרמה לערוץ FL1 (לייזר ארגון 488 ננומטר).
3. כדי לנתח את עוצמת הקרינה של HEK293-GFP וHEK293-GFP-CaeB תאים לפתוח את היסטוגרמה של ערוץ FL1 ולרכוש 10,000 אירועים באוכלוסייה המגודר.
4. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח FACS המסחרי.

4. Transfection של שורת תאים יציבה עם מערכת וקטור ביטוי העין מתנהלת

1. תאי זרע HEK293 להביע ביציבות GFP או GFP-CaeB בצלחת 12 גם בצפיפות של 1 x 10 ⁵ תאים / טוב.
2. לאחר זריעה 19 שעות, שיתוף transfect התאים עם פלסמיד הרגולטור ופלסמיד תגובה או Bax קידוד או caspase הופעל 3.
   1. שיתוף transfect HEK293 התאים יציביםעם של פלסמיד רגולטור pWHE125-P 100 ng (איור 2) ושל פלסמידים תגובת pWHE655-hBax או pWHE655-revCasp3 (איור 3) ו -0.4 μl של polyethylenimine 100 ng.
   2. הכן את ה- DNA ומגיב transfection polyethylenimine כל 75 μl של מדיום Opti- ממ דגירה דקות בדיוק 5 ב RT. ליצירה מורכבת, דגירה שני התערובות יחד במשך 15 דקות ב RT.
3. הוסף את הירידה מבחינת פתרון polyethylenimine / DNA לתאים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.

5. אינדוקציה של אפופטוזיס

1. 5 שעות לאחר transfection, לגרום לביטוי של החלבונים פרו-אפופטוטיים על ידי תוספת של דוקסיציקלין / מיליליטר 1 מיקרוגרם למדיום התרבות. דגירה תאים במשך 18 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.

6. ניתוח של התא המארח אפופטוזיס על ידי ניתוח immunoblot

1. בדוק תאים לפני שעותarvesting תחת מיקרוסקופ האור כדי לבדוק לזירוז מוות של תאים. תאים אפופטוטיים הם detectible על ידי הנוכחות של גופים אפופטוטיים המקיפים את התא למות.
2. הסר את supernatant ולשטוף את התאים דבקו פעם עם PBS החם. Resuspend התאים של חיץ מדגם Laemmli 2x, חום 100 μl במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחסן ב -20 ° C.
3. לטעון כ 4 x 10 ⁴ תאים לדגימה על 12% ג'ל SDS-עמוד. בנוסף, עומס 6 μl של סולם חלבון מסחרי כסמן משקל מולקולרי. הפעל ג'לי במערכת ג'ל אלקטרופורזה תחת מתח קבוע של 180 V דקות 45-60 עם חיץ פועל 1x Laemmli.
4. חלבונים למחוק על ממברנות PVDF (גודל נקבובית של 0.45 מיקרומטר) במתח קבוע של 16 V עבור 60 דקות באמצעות תא העברה חצי יבש חוצה הכתם SD.
5. קרומי בלוק ב 10 מיליליטר של חלב ללא שומן יבש 5% ב- PBS / Tween% 0.05 20 (MPT) במשך שעה 1 ב RT.
6. לדלל 4 μl של נוגדן פולי-ביקע אנטי פולימראז ADP-ribose (PARP) ב 4 מיליליטר של MPT דגירה O / N ב 4 ° C.
7. בצע שלושה שלבי כביסה 10 דקות עם 10 מיליליטר של PBS / 0.05% Tween 20.
8. דגירה קרומים עם 0.8 נוגדני μl חזרת peroxidase מצומדות משניים מדוללים ב 4 MPT מיליליטר.
9. לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7) ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון.
10. הסר נוגדנים מחויבים 30 דגירה דקות ב RT עם 7 מיליליטר מערבי כתם Stripping מאגר.
11. לאחר שלושה שוטף עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7), לחקור את הקרומים עם 4 μl של נוגדן אנטי אקטין ב 4 מיליליטר של MPT O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
12. לאחר שלושה שלבי כביסה עם MPT (כפי שמתואר ב6.7), דגירה הקרומים עם 0.8 μl של הונוגדנים משני peroxidase מצומדות rseradish מדולל ב 4 מיליליטר של MPT.
13. לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7 ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון.
    הערה: כל שלבי הדגירה בוצעו על שייקר צלחת בפעם והטמפרטורה המצוינת.

ראשית, קווי HEK293 תאי יציבות המבטאים את החלבון של העניין (CaeB) כחלבון ה- GFP-היתוך הוקמו. כביקורת, שורות תאי HEK293 ביציבות להביע GFP היו גם נוצרו. ביטוי של ה- GFP וGFP-CaeB אומת על ידי ניתוח immunoblot. Immunoblot הנציג (איור 4 א) מדגים ביטוי יציב וברור לזיהוי של ה- GFP וGFP-CaeB. עם זאת, assay זה לא יכול לקבוע אם כל התאים להביע GFP או GFP-CaeB. לכן, שורות תאי HEK293 transfected ביציבות נותחו גם על ידי cytometry זרימה. כפי שניתן לראות באיור 4, מעל 90% מהתאים בשתי שורות התאים הביעו GFP. כך, ניתן להשתמש בשורות תאי יציבות אלה כדי לנתח את הפונקציה של CaeB נוסף. בשלב הבא, הפעילות אנטי-אפופטוטיים של CaeB הייתה assayed על ידי ניתוח immunoblot באמצעות נוגדן נגד PARP ביקע. מחשוף מפרקי חלבונים של PARP הגרעיני מנטרל פעילות תיקון DNA והוא סמן אופייני termiשלבים סופיים של אפופטוזיס. מחשוף של PARP לא זוהה בHEK293-GFP או HEK293 תאים-GFP-CaeB, הוכחה כי לא הביטוי של ה- GFP, ולא של ה- GFP-CaeB הוא רעיל לתאים. עם זאת, כאשר טופלו התאים עם staurosporine, inducer חזק של אפופטוזיס הפנימי, מחשוף של PARP זוהה (איור 5). חשוב לציין, HEK293 תאים-GFP-CaeB יפגינו מופחתים מחשוף של PARP, המציינים את הפעילות האנטי-אפופטוטיים של חלבון Coxiella burnetii IV סוג מפעיל מערכת הפרשה 7 CaeB.

כדי לנתח שבשלב CaeB מפריע למסלול אפופטוטיים, מערכת ט-האון הועסקה. בפירוט, HEK293 תאים-GFP או HEK293-GFP-CaeB היו transfected עם פלסמיד רגולטור constitutively להביע מדכא כפול / התקנה בשליטת דוקסיציקלין activator (איור 2) וקידוד פלסמיד תגובת pTRE או באורך מלא באקס אנושי או הצורה פעילה של caspase אדם 3, מכונה revCasp 3 (איור 3). מערכת זו מוסדרת בחוזקה, כפי שהודגם על ידי חוסר מחשוף PARP בתנאי גרימה-עישון (איור 6). תוספת של דוקסיציקלין לתאי transfected הביאה את הביטוי של Bax או 3. revCasp אם CaeB מפריע למסלול אפופטוטיים במורד הזרם של Bax, אז האות אפופטוטיים שנוצרה על ידי ביטוי וההפעלה הבאה של Bax צריכה להיות חסום על ידי ביטוי CaeB. ואכן, HEK293 תאים ביציבות להביע GFP-CaeB עמוק לעכב אינדוקציה אפופטוזיס על ידי ביטוי בשליטת דוקסיציקלין Bax, בעוד תאי HEK293-GFP מוצגים מחשוף PARP ברור. תוצאה זו מצביעה על כך שאינדוקצית אפופטוזיס לוקי CaeB במורד הזרם של הפעלה באקס. בשלב הבא, זה נותח אם CaeB יכול להפריע caspase 3 הפעלה - אירוע בסוף המסלול אפופטוטיים. HEK293 תאים-GFP, כמו גם תאי HEK293-GFP-CaeB, מחשוף PARP התערוכה (איור 6), מצביעים על כך שפעם אחת caspase מפעיל 3 Activated, CaeB לא יכול למנוע אפופטוזיס התרחשות. יחד נלקח, נתונים אלה מראים כי CaeB פועל בין Bax וcaspase 3 הפעלה.

איור 1. סקירה סכמטי של מערכת הרגולציה טטרציקלין. מערכת ט-האון מורכב משני פלסמידים שונים, פלסמידים רגולציה ותגובה. פלסמיד הרגולציה מקודד transsilencer ט-התגובה (TTS; עיגול מלא) וtransactivator ההפוך ט-התגובה (rtTA, מעגל פתוח). שני החלבונים באים לידי ביטוי constitutively תחת השליטה של האמרגן החזק, המכונן התארכות גורם-1 אלפא (P EF-1a). TTS וrtTA גורמי שעתוק chimeric המורכב מתחום אוקריוטים תעתיק רגולציה (משתיק קול או activator, בהתאמה) ומדכאי טטרציקלין חיידקים (TetR). TetR מתווך DNA מחייב לשבעה ט ' (TETO) על פלסמיד התגובה. TETO ממוקם במעלה הזרם של אמרגן ציטומגלווירוס המינימלי מושרה (P CMV), ביחד ויוצרים אלמנט ט-התגובה (TRE). תחת ללא גרימת תנאים, TTS חייב TRE מניעת ביטוי. לאחר תוספת של דוקסיציקלין (Dox; יהלום מלא), rtTA אינטראקציה עם Dox מוביל לשינויים ולהפעלה קונפורמציה. rtTA הופעל מחליף TTS על פלסמיד התגובה, המאפשר שעתוק של גני המטרה המתאימה Bax וcaspase 3, ובכך מוביל לאפופטוזיס אינדוקציה ומוות של תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. סקירה סכמטי של pWHE125 פלסמיד הרגולציה. אלמנטים חיוניים להתפשטות בBacקפיטריה, כולל מקור של שכפול (אורי PBR) וקלטת עמידות לאנטיביוטיקה אמפיצילין נגד (Amp R), וביטוי של ט-transregulators, כגון האמרגן / משפר החזק, מכונן המיידית המוקדמת של ציטומגלווירוס האדם (P / E hCMV), אתר הריבוזום פנימי מחייב מפוליו-וירוס (PV-IRES) ופולה-אתר מהווירוס קופי 40 (SV40 פולה) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. סקירה סכמטי של פלסמיד התגובה. אלמנטים חיוניים להתפשטות חיידקים, כולל מקור של שכפול (אורי PBR) וקלטת עמידות לאנטיביוטיקה (Amp R), וביטוי מושרה באאוקריוטים, כגון expressi transgeneבקלטת עם האמרגן ט-התלוי המינימלי TREtight (P TREtight), הגן של אדם עניין באקס (hBax) ואתר פולה מוירוס קופי 40 (SV40 פולה), מתוארים. קלטת ביטוי transgene מוקפת חוזר ישיר טנדם של שני עותקים של רצף עוף HS4 הליבה מבודדת (ליבת HS4). בנוסף, קלטת התנגדות G418 בהיקף של אמרגן קינאז phosphoglycerate עכברי 1 (P mPGK), גן נאומיצין התנגדות (G418 R) ואתר פולה קינאז תימידין האנושי (TK פולה) הוא הווה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4. HEK293-GFP וHEK293-GFP-CaeB יציבות להביע חלבוני ניאון ירוקים. () Lysates שלמות התא של HEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB היו immunoblotted לGFP להראות ביטוי יציב. ניתוח (ב) cytometry זרימת נציג (FACS) של HEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB מוצג כדי להדגים את עוצמת הביטוי של GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. השפעות של הביטוי של ה- GFP-CaeB על אפופטוזיס המושרה staurosporine. HEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB טופלו עם 4 מיקרומטר staurosporine במשך 6 שעות כדי לגרום לאפופטוזיס הפנימי. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח immunoblot PARP ביקע. מחשוף PARP הופחת בHEK293 תאים-GFP-CaeB בהשוואה לתאי HEK293-GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותרשל נתון זה.

שימוש איור 6. במערכת טיטון כדי לצמצם את נקודת פעולה של CaeB. () אפופטוזיס היה מושרה על ידי ביטוי של Bax בHEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח immunoblot PARP ביקע. מחשוף PARP הופחת בHEK293 תאים-GFP-CaeB בהשוואה לתאי HEK293-GFP. (ב) אפופטוזיס היה מושרה על ידי ביטוי של revCasp 3 בHEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח immunoblot PARP ביקע. מחשוף PARP היה דומה בHEK293 תאים-GFP-CaeB וHEK293-GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

למחברים אין מה לחשוף.