השיטה המתוארת כאן משמשת לגרימת מפל האיתות האפופטוטי בשלבים מוגדרים על מנת לנתח את הפעילות של חלבון אפקטור חיידקי אנטי-אפופטוטי. שיטה זו יכולה לשמש גם לביטוי השראה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לניתוח הפרעות עם מסלולי איתות אחרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת לנתח שבצעד חלבון מטרה, או לחלופין מולקולה קטנה, אינטראקציה עם הרכיבים של מסלול איתות. השיטה מבוססת, מצד האחד, על הביטוי מושרה של חלבון ספציפי ליזום אירוע איתות בצעד שהוגדר מראש ובמפל האיתות נבחר. ביטוי בד בבד, ומצד שני, של הגן של עניין לאחר מכן מאפשר לחוקר להעריך אם הפעילות של חלבון המטרה הביע ממוקמת במעלה הזרם או במורד הזרם של אירוע איתות יזם, בהתאם את ההודעה של מסלול האיתות שמתקבל. הנה, המפל אפופטוטיים נבחר כמסלול איתות מוגדר להפגין פונקציונלי פרוטוקול. חיידקים פתוגניים, כגון burnetii Coxiella, translocate חלבוני מפעיל שמפריעים לאינדוקצית מות תא מארח בתא המארח כדי להבטיח את הישרדות חיידקים בתא ולקדמםהפצה באורגניזם. ג חלבון מפעיל burnetii CaeB מעכב ביעילות מוות של תאי מארח לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס עם UV-אור או עם staurosporine. כדי לצמצם את הצעד שבי CaeB מפריע להתפשטות של האות אפופטוטיים, חלבונים שנבחרו בפעילות פרו-אפופטוטיים מאופיינת היטב לידי ביטוי באופן זמני דוקסיציקלין והעין מתנהלת. אם CaeB פועל במעלה הזרם של חלבונים אלה, אפופטוזיס ימשיך ללא הפרעה. אם CaeB פועל במורד הזרם, מוות של תאים יהיה מעוכב. חלבוני הבדיקה שנבחרו היו באקס, הפועל ברמה של המיטוכונדריה, וcaspase 3, המהווה את פרוטאז התליין הגדול. CaeB מפריע למוות של תאים הנגרם על ידי ביטוי באקס, אך לא על ידי caspase 3 ביטוי. CaeB, ובכך, אינטראקציה עם המפל אפופטוטיים בין שני החלבונים האלה.
מבוא
האלימות של חיידקים פתוגנים גראם שלילי רבים תלויה במערכות הפרשה מיוחדות לחטוף תאי מארח האיקריוטים. חיידקים משתמשים במערכות הפרשה אלה להזריק חלבוני חיידקים ארסי (effectors) לתא המארח כדי לווסת את מגוון פעילויות סלולריות וביוכימיים. המחקר של חלבוני מפעיל לא רק סיפק תובנה מדהימה להיבטים בסיסיים של מארח / אינטראקציות הפתוגן אלא גם לביולוגיה הבסיסית של תאים האיקריוטים 1. אפנון של אפופטוזיס תא המארח הוכח להיות מנגנון ארסיות חשוב עבור רבים פתוגנים תאיים, ומספר חלבוני מפעיל ויסות אפופטוזיס זוהה 2-9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים פעילותם להישאר חמקמקים במקרים רבים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. דור של שורות תאי יציבות המבטאות את החלבון של ריבית
- הכן תקשורת על ידי הוספת FCS מומת חום ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין למסחרי Dulbecco's זמין השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת Glutamax-אני, פירובט, ו -4.5 ג '/ D-גלוקוז L.
- לטפח HEK293 תאים בתקשורת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. תת לטפח תאים בכל יום שלישי. הסר את המדיה וresuspend התאים 15 מיליליטר תקשורת טרי. פיפטה 1 מיליליטר לתוך בקבוק 2 תאים חדש 75 סנטימטרים תרבות ולהוסיף 14 מיליליטר תקשורת.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ראשית, קווי HEK293 תאי יציבות המבטאים את החלבון של העניין (CaeB) כחלבון ה- GFP-היתוך הוקמו. כביקורת, שורות תאי HEK293 ביציבות להביע GFP היו גם נוצרו. ביטוי של ה- GFP וGFP-CaeB אומת על ידי ניתוח immunoblot. Immunoblot הנציג (איור 4 א) מדגים ביטוי יציב וברור לזיהוי של ה- GFP וGFP-CaeB. עם זאת, assay זה לא יכול לקבוע אם כל התאים להביע GFP או GFP-CaeB. לכן, שורות תאי HEK293 transfected ביציבות נותחו גם על ידי cytometry זרימה. כפי שניתן לראות באיור 4, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חיידקים פתוגניים רבים נמל מערכות הפרשה להפריש או translocate חלבוני מפעיל חיידקים לתוך התא המארח. יש חלבוני מפעיל אלה את היכולת לווסת את התהליכים ומסלולים בתא המארח, ומאפשר לחיידקים לשרוד ולשכפל בתוך הנישה תאית שלהם. הבנת הפעילות ביוכימית והמנגנונים המולקולריים של חלבוני מפעיל תעזור להבנה טובה יותר של פתוגניות ועשויה לעזור לפתח כלים טיפוליים חדשים כדי להילחם במחלה. יתר על כן, כפי שחלבוני מפעיל לעתים קרובות להפעיל את תפקידם על ידי חיקוי פעולות תא מארח, הם יכולים לשמש גם כדי ללמוד ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) באמצעות יוזמת המחקר השיתופי 796 (SFB796) ל-A.L. ו-C.B., ובאמצעות הקריאההשלישית של ERA-NET PathoGenoMics ל-A.L.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| טכנולוגיות חיים | DMEM | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| טכנולוגיות חיים | עט/סטרפטוקוקוס | 15140-122 | |
| טכנולוגיות חיים | OptiMEM | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth CP11.3 | ||
| פוליאתילנימין | Polyscienes | 23966 | |
| דוקסיציקלין | סיגמא אולדריץ' | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD תא העברה חצי יבש | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler סולם חלבון צבוע | מראש Thermo Scientific | 26616 | |
| קרום | PVDFMillipore | IPVH00010 | |
| אנטי-GFP | Life Technologies | A6455 | |
| אנטי שסע PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| אנטי אקטין | סיגמא אולדריץ' | A2066 | |
| עכבר IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| ארנב IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| שחזור פלוס מאגר הפשטת כתמים מערביים | Thermo Scientific | 46428 |
מקורות
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death member....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
