Method Article

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

DOI:

10.3791/52903

⸱

June 25th, 2015

 ,  ,  , 
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת כאן משמשת לגרימת מפל האיתות האפופטוטי בשלבים מוגדרים על מנת לנתח את הפעילות של חלבון אפקטור חיידקי אנטי-אפופטוטי. שיטה זו יכולה לשמש גם לביטוי השראה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לניתוח הפרעות עם מסלולי איתות אחרים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת לנתח שבצעד חלבון מטרה, או לחלופין מולקולה קטנה, אינטראקציה עם הרכיבים של מסלול איתות. השיטה מבוססת, מצד האחד, על הביטוי מושרה של חלבון ספציפי ליזום אירוע איתות בצעד שהוגדר מראש ובמפל האיתות נבחר. ביטוי בד בבד, ומצד שני, של הגן של עניין לאחר מכן מאפשר לחוקר להעריך אם הפעילות של חלבון המטרה הביע ממוקמת במעלה הזרם או במורד הזרם של אירוע איתות יזם, בהתאם את ההודעה של מסלול האיתות שמתקבל. הנה, המפל אפופטוטיים נבחר כמסלול איתות מוגדר להפגין פונקציונלי פרוטוקול. חיידקים פתוגניים, כגון burnetii Coxiella, translocate חלבוני מפעיל שמפריעים לאינדוקצית מות תא מארח בתא המארח כדי להבטיח את הישרדות חיידקים בתא ולקדמםהפצה באורגניזם. ג חלבון מפעיל burnetii CaeB מעכב ביעילות מוות של תאי מארח לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס עם UV-אור או עם staurosporine. כדי לצמצם את הצעד שבי CaeB מפריע להתפשטות של האות אפופטוטיים, חלבונים שנבחרו בפעילות פרו-אפופטוטיים מאופיינת היטב לידי ביטוי באופן זמני דוקסיציקלין והעין מתנהלת. אם CaeB פועל במעלה הזרם של חלבונים אלה, אפופטוזיס ימשיך ללא הפרעה. אם CaeB פועל במורד הזרם, מוות של תאים יהיה מעוכב. חלבוני הבדיקה שנבחרו היו באקס, הפועל ברמה של המיטוכונדריה, וcaspase 3, המהווה את פרוטאז התליין הגדול. CaeB מפריע למוות של תאים הנגרם על ידי ביטוי באקס, אך לא על ידי caspase 3 ביטוי. CaeB, ובכך, אינטראקציה עם המפל אפופטוטיים בין שני החלבונים האלה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האלימות של חיידקים פתוגנים גראם שלילי רבים תלויה במערכות הפרשה מיוחדות לחטוף תאי מארח האיקריוטים. חיידקים משתמשים במערכות הפרשה אלה להזריק חלבוני חיידקים ארסי (effectors) לתא המארח כדי לווסת את מגוון פעילויות סלולריות וביוכימיים. המחקר של חלבוני מפעיל לא רק סיפק תובנה מדהימה להיבטים בסיסיים של מארח / אינטראקציות הפתוגן אלא גם לביולוגיה הבסיסית של תאים האיקריוטים 1. אפנון של אפופטוזיס תא המארח הוכח להיות מנגנון ארסיות חשוב עבור רבים פתוגנים תאיים, ומספר חלבוני מפעיל ויסות אפופטוזיס זוהה 2-9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים פעילותם להישאר חמקמקים במקרים רבים.

אפופטוזיס, צורה של מות תא, ממלא תפקיד חשוב בתגובה חיסונית לזיהום 10. יש שני מסלולים עיקריים שמוביל לאפופטוזיסזוהה: מיקוד מיטוכונדריה (אפופטוזיס הפנימי) או התמרה ישירה של האות באמצעות קולטני מוות של תאים בקרום הפלזמה (אפופטוזיס החיצוני). המסלול הפנימי או בתיווך מיטוכונדריה המוות של תאים מופעל על ידי אותות תאיים וכרוך בהפעלה של Bax ובק, שני חברים פרו-אפופטוטיים של משפחת Bcl-2. משפחה זה מורכב מחלבוני רגולטור בעד ונגד אפופטוטיים ששולטים תא מוות 11-14. הפעלה של אפופטוזיס מובילה לoligomerization של Bax ובק ואחריו permeabilization הבא של הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, וכתוצאה מכך שחרור ציטוכרום C לתוך הציטופלסמה. שחרור ציטוכרום C יוזם הפעלה של caspases מפעיל 3 ו -7 באמצעות הפעלה של caspase 9 בapoptosome 15. זה מוביל לproteolysis של מצעים נבחרו ש, בין יתר, בתוצאות החשיפה של phosphatidylserine על פני תא 16 ומשחרר DNase ייעודי שברי פרקromatin 17,18.

כדי לקבוע היכן בתוך המפל אפופטוטיים חלבון מפעיל בודד מפריע, מערכת ביטוי מושרה הועסקה 19. מערכות רגולטוריות לביטוי מותנה של transgenes היו כלי רב ערך בניתוח הפונקציה של חלבון בתוך התא או חשיבותו לרקמות, איברים ופיתוח גוף, כמו גם בייזום, התקדמות ותחזוקה של המחלה 20-23. בדרך כלל, מערכות בקרה מושרה, כגון מערכת ט '24 מועסקים כאן, יוצרות יחידת שעתוק מלאכותית (ראה איור 1). מרכיב אחד הוא גורם מהונדס באופן מלאכותי שעתוק נקרא TTA (activator תעתיק טטרציקלין תלוי), שהוקם על ידי מיזוג של מדכאי שעתוק חיידקי TetR 25 לתחום חלבון יונקים שמתווך הפעלת תעתיק או השתקת 24,26. המרכיב השני הוא היברידיאמרגן, כינה TRE (אלמנט טטרציקלין מגיב), בהיקף של אמרגן מינימאלי אוקריוטים, המכיל לפחות TATA-תיבה ואתר ייזום שעתוק, הצטרף לחזרות מרובות של אתר ה- DNA מחייבת אותו המקור לTetR, TETO 24,25. המרכיב השלישי הוא יגנד הטבעי של TetR, טטרציקלין או אחד מנגזרותיו, כגון anhydrotetracycline או דוקסיציקלין 25. עם בנוסף ליגנד למדיום התרבות, TetR מאבד זיקתה לTETO ומנתק מTRE. כתוצאה מכך, שעתוק של גן המטרה הוא בוטל. ביטוי transgene יכול, ובכך, להיות מבוקר היטב באופן זמן ותלוי-מינון בשתי תרבית התאים ובחיות 20,23,24. עם TTA, ביטוי transgene מתרחש constitutively, אלא בנוכחות של טטרציקלין. זה יכול להיות חסרון בחקר חלבונים רעילים לתאים סרטניים או בגלל טטרציקלין יש ראשון שהוסר מהמערכת, לפני שהשתקף transgenen מתרחש וניתן לנטר את ההשפעות של חלבון המטרה בתא. זה יכול להיות זמן רב ולא תמיד מלא, במיוחד בבעלי חיים מהונדסים 27. כדי לטפל במגבלה זו, מוטציה TetR עם תגובה הפוכה לנוכחות של דוקסיציקלין שימשה כדי ליצור גורם שעתוק חדש, rtTA (הפוך TTA) 28. זה רק נקשר לTRE ו, במקביל, מפעיל שעתוק בנוכחות דוקסיציקלין. דליפות שייר של המערכת, כלומר., ביטוי transgene בהעדר גורם שעתוק קשור-TRE, שמקורו גם (i) מהשפעות עמדה באתר אינטגרציה הגנומי, (ii) מTRE עצמו 29, או (iii) שמאינו -specific מחייב של TTA / 28 rtTA, היה ממוען על ידי החדרת משתיק תעתיק נוסף, כינה TTS (משתיק קול תעתיק טטרציקלין תלוי) 30 למערכת. הוא יוצר רשת רגולטור כפולה יחד עם rtTA (ראה איור 1).בהעדר דוקסיציקלין, TTS נקשר לTRE ופעיל כיבוי כל שעתוק שנותר. בנוכחות של דוקסיציקלין, TTS dissociates מTRE וrtTA נקשר בו זמנית גרימת ביטוי של גן המטרה. שכבה נוספת זו של החמרה לעתים קרובות יש צורך לבטא את החלבונים רעילים לתאים פעילים מאוד 31-34.

שימוש במערכת כפול רגולטור לפיקוח הדוק זה, המפל אפופטוטיים יכול להיות יזם בצעד שהוגדר מאפשר ניתוח של האם חלבון מפעיל נתון יכול להפריע אינדוקציה אפופטוזיס. שיטה זו יכולה לא רק לשמש כדי לחקור את הפעילות האנטי-אפופטוטיים של חלבוני מפעיל חיידקים, אלא גם לביטוי מושרה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לנתח הפרעה למסלולי איתות אחרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דור של שורות תאי יציבות המבטאות את החלבון של ריבית

  1. הכן תקשורת על ידי הוספת FCS מומת חום ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין למסחרי Dulbecco's זמין השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת Glutamax-אני, פירובט, ו -4.5 ג '/ D-גלוקוז L.
  2. לטפח HEK293 תאים בתקשורת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. תת לטפח תאים בכל יום שלישי. הסר את המדיה וresuspend התאים 15 מיליליטר תקשורת טרי. פיפטה 1 מיליליטר לתוך בקבוק 2 תאים חדש 75 סנטימטרים תרבות ולהוסיף 14 מיליליטר תקשורת.
  3. לנתח את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
  4. תאי זרע HEK293 בצלחת 6-גם בצפיפות של 2 x 10 5 תאים לכל היטב דגירה במשך 24 שעות.
  5. עבור transfection משתמש בפרוטוקול המסופק על ידי היצרן של מגיב transfection. Transfect תאים עם pEGFP-C2 או pEGFP-C2-CaeB באמצעות מגיב transfection. לפני שימוש, לחמם את reag transfectionאף אוזן גרון והתקשורת הנדרשת לRT. השתמש יחס 3: 1 של מגיב transfection ל- DNA.
    1. בפירוט, פיפטה 1.5 μl של מגיב transfection ישירות לתוך 50 μl של מדיום סרום ללא DMEM. ליצירה מורכבת, פיפטה 0.5 מיקרוגרם של ה- GFP DNA קידוד או GFP-CaeB לתערובת המכיל מגיב transfection דגירה במשך 15 דקות ב RT.
    2. Transfect תאים על ידי הוספת תערובת התגובה באופן טיפה חכמה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 24 שעות.
  6. להוסיף 1 מ"ג / מיליליטר geneticin לבחירה של שיבוטים GFP חיובי על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
  7. לאחר 6 ימים, בודד תאים בודדים על ידי cytometry זרימת מיון בצלחת 96-היטב מחסה בינונית וsupernatant HEK293 ביחס של 1: 1. צור supernatant HEK293 מתאי ומחוברות HEK293 תרבותיים שcentrifuged במשך 15 דקות ב4966 x גרם.
  8. ביום הבא, להחליף בינוני תרבות עם מדיום המכיל 1.50; מ"ג / מיליליטר geneticin. שינוי תקשורת פעם בשבוע. אם התאים בצורת monolayer ומחוברות, להעביר אותם לצלחת 24 גם. תת לטפח תאים פעמיים בשבוע ביחס של 1: 5 במדיה המכיל 1.5 מ"ג / מיליליטר geneticin. לבסוף, לנתח את אחוז תאי GFP החיובי על ידי ניתוח immunoblot וcytometry זרימה.

2. ניתוח של שורות תאי יציבות על ידי ניתוח immunoblot

  1. הסר את supernatant ולשטוף את התאים דבקו פעם עם PBS החם. Resuspend התאים של חיץ מדגם Laemmli 2x, חום 100 μl במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחסן ב -20 ° C.
  2. לטעון כ 4 x 10 4 תאים לדגימה על 12% ג'ל SDS-עמוד. בנוסף, עומס 6 μl של סולם חלבון מסחרי כסמן משקל מולקולרי. הפעל ג'לי במערכת ג'ל אלקטרופורזה תחת מתח קבוע של 180 V דקות 45-60 עם חיץ פועל 1x Laemmli.
  3. חלבונים למחוק על ממברנות PVDF (גודל נקבובית של 0.45 מיקרומטר) במתח קבוע של 16 V עבור 60 דקות באמצעות תא העברה חצי יבש SD חוצה כתם.
  4. קרומי בלוק ב 10 מיליליטר של חלב ללא שומן יבש 5% ב- PBS / Tween% 0.05 20 (MPT) במשך שעה 1 ב RT.
  5. לדלל 4 μl של נוגדן-GFP אנטי ב 4 מיליליטר של MPT דגירה קרומי O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. בצע שלושה שלבי כביסה 10 דקות עם 10 מיליליטר של PBS / 0.05% Tween 20.
  7. דגירה קרומים עם 0.8 μl של נוגדנים משני peroxidase מצומדות חזרת ב 4 מיליליטר של MPT.
  8. לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב2.6) ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון.

3. לנתח את התאים באמצעות Cytometer זרימה.

  1. Resuspend תאים בPBS. השתמש HEK293 תאים כביקורת שלילית להתאים קדימה scatter (FSC) וצד פיזור (SSC), כך שהתאים בקנה מידה. צייר שער על תאי חיים על ידי נטרול כפילויות תא, אגרגטים ופסולת תא.
  2. התאם את הצינור מכפיל רווח (PMT), כך שהתאים בלא כתם הם בשמאל הקיצוני של ההיסטוגרמה לערוץ FL1 (לייזר ארגון 488 ננומטר).
  3. כדי לנתח את עוצמת הקרינה של HEK293-GFP וHEK293-GFP-CaeB תאים לפתוח את היסטוגרמה של ערוץ FL1 ולרכוש 10,000 אירועים באוכלוסייה המגודר.
  4. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח FACS המסחרי.

4. Transfection של שורת תאים יציבה עם מערכת וקטור ביטוי העין מתנהלת

  1. תאי זרע HEK293 להביע ביציבות GFP או GFP-CaeB בצלחת 12 גם בצפיפות של 1 x 10 5 תאים / טוב.
  2. לאחר זריעה 19 שעות, שיתוף transfect התאים עם פלסמיד הרגולטור ופלסמיד תגובה או Bax קידוד או caspase הופעל 3.
    1. שיתוף transfect HEK293 התאים יציביםעם של פלסמיד רגולטור pWHE125-P 100 ng (איור 2) ושל פלסמידים תגובת pWHE655-hBax או pWHE655-revCasp3 (איור 3) ו -0.4 μl של polyethylenimine 100 ng.
    2. הכן את ה- DNA ומגיב transfection polyethylenimine כל 75 μl של מדיום Opti- ממ דגירה דקות בדיוק 5 ב RT. ליצירה מורכבת, דגירה שני התערובות יחד במשך 15 דקות ב RT.
  3. הוסף את הירידה מבחינת פתרון polyethylenimine / DNA לתאים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.

5. אינדוקציה של אפופטוזיס

  1. 5 שעות לאחר transfection, לגרום לביטוי של החלבונים פרו-אפופטוטיים על ידי תוספת של דוקסיציקלין / מיליליטר 1 מיקרוגרם למדיום התרבות. דגירה תאים במשך 18 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.

6. ניתוח של התא המארח אפופטוזיס על ידי ניתוח immunoblot

  1. בדוק תאים לפני שעותarvesting תחת מיקרוסקופ האור כדי לבדוק לזירוז מוות של תאים. תאים אפופטוטיים הם detectible על ידי הנוכחות של גופים אפופטוטיים המקיפים את התא למות.
  2. הסר את supernatant ולשטוף את התאים דבקו פעם עם PBS החם. Resuspend התאים של חיץ מדגם Laemmli 2x, חום 100 μl במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחסן ב -20 ° C.
  3. לטעון כ 4 x 10 4 תאים לדגימה על 12% ג'ל SDS-עמוד. בנוסף, עומס 6 μl של סולם חלבון מסחרי כסמן משקל מולקולרי. הפעל ג'לי במערכת ג'ל אלקטרופורזה תחת מתח קבוע של 180 V דקות 45-60 עם חיץ פועל 1x Laemmli.
  4. חלבונים למחוק על ממברנות PVDF (גודל נקבובית של 0.45 מיקרומטר) במתח קבוע של 16 V עבור 60 דקות באמצעות תא העברה חצי יבש חוצה הכתם SD.
  5. קרומי בלוק ב 10 מיליליטר של חלב ללא שומן יבש 5% ב- PBS / Tween% 0.05 20 (MPT) במשך שעה 1 ב RT.
  6. לדלל 4 μl של נוגדן פולי-ביקע אנטי פולימראז ADP-ribose (PARP) ב 4 מיליליטר של MPT דגירה O / N ב 4 ° C.
  7. בצע שלושה שלבי כביסה 10 דקות עם 10 מיליליטר של PBS / 0.05% Tween 20.
  8. דגירה קרומים עם 0.8 נוגדני μl חזרת peroxidase מצומדות משניים מדוללים ב 4 MPT מיליליטר.
  9. לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7) ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון.
  10. הסר נוגדנים מחויבים 30 דגירה דקות ב RT עם 7 מיליליטר מערבי כתם Stripping מאגר.
  11. לאחר שלושה שוטף עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7), לחקור את הקרומים עם 4 μl של נוגדן אנטי אקטין ב 4 מיליליטר של MPT O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
  12. לאחר שלושה שלבי כביסה עם MPT (כפי שמתואר ב6.7), דגירה הקרומים עם 0.8 μl של הונוגדנים משני peroxidase מצומדות rseradish מדולל ב 4 מיליליטר של MPT.
  13. לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7 ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון.
    הערה: כל שלבי הדגירה בוצעו על שייקר צלחת בפעם והטמפרטורה המצוינת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראשית, קווי HEK293 תאי יציבות המבטאים את החלבון של העניין (CaeB) כחלבון ה- GFP-היתוך הוקמו. כביקורת, שורות תאי HEK293 ביציבות להביע GFP היו גם נוצרו. ביטוי של ה- GFP וGFP-CaeB אומת על ידי ניתוח immunoblot. Immunoblot הנציג (איור 4 א) מדגים ביטוי יציב וברור לזיהוי של ה- GFP וGFP-CaeB. עם זאת, assay זה לא יכול לקבוע אם כל התאים להביע GFP או GFP-CaeB. לכן, שורות תאי HEK293 transfected ביציבות נותחו גם על ידי cytometry זרימה. כפי שניתן לראות באיור 4, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים פתוגניים רבים נמל מערכות הפרשה להפריש או translocate חלבוני מפעיל חיידקים לתוך התא המארח. יש חלבוני מפעיל אלה את היכולת לווסת את התהליכים ומסלולים בתא המארח, ומאפשר לחיידקים לשרוד ולשכפל בתוך הנישה תאית שלהם. הבנת הפעילות ביוכימית והמנגנונים המולקולריים של חלבוני מפעיל תעזור להבנה טובה יותר של פתוגניות ועשויה לעזור לפתח כלים טיפוליים חדשים כדי להילחם במחלה. יתר על כן, כפי שחלבוני מפעיל לעתים קרובות להפעיל את תפקידם על ידי חיקוי פעולות תא מארח, הם יכולים לשמש גם כדי ללמוד ע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) באמצעות יוזמת המחקר השיתופי 796 (SFB796) ל-A.L. ו-C.B., ובאמצעות הקריאההשלישית של ERA-NET PathoGenoMics ל-A.L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
טכנולוגיות חייםDMEM31966-021
FCSBiochromS0115
טכנולוגיות חייםעט/סטרפטוקוקוס15140-122
טכנולוגיות חייםOptiMEM51985
X-tremeGENE 9Roche6365752001
GeneticinRoth CP11.3
פוליאתילנימיןPolyscienes23966
דוקסיציקליןסיגמא אולדריץ'D9891
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-8000EDU
Trans-Blot SD תא העברה חצי יבשBio-Rad170-3940
PageRuler סולם חלבון צבועמראש Thermo Scientific26616
קרוםPVDFMilliporeIPVH00010
אנטי-GFP Life TechnologiesA6455
אנטי שסע PARPBD Bioscience611038
אנטי אקטיןסיגמא אולדריץ'A2066
עכבר IgG (H+L)-HRPODianova111-035-062
ארנב IgG (H+L)-HRPODianova111-035-045
ECL Western Blotting SubstrateThermo Scientific32106
שחזור פלוס מאגר הפשטת כתמים מערבייםThermo Scientific46428

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115(2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714(2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27(2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81(2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial Virulence FactorsIntracellular SignalingInducible Expression SystemApoptotic CascadeWestern BlottingFlow CytometryDoxycycline InductionCaspase 3Bax ProteinPARP Cleavage

Related Articles