מאמר שיטה

ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי

DOI:

10.3791/52919

⸱

12 במאי 2015

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינדוקציה של קינאז phosphorylated מוסדר תאי (הטבה) היא קריאת נתונים מולקולריות אמינה של הפעלה עצבית למידה תלויה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה הטבה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. באופן ספציפי, אנחנו משמשים immunostaining ההטבה ללמוד הפעלה עצבית הבאות מבוך המים מוריס (MWM, משימת למידה בהיפוקמפוס תלוי קלסית) בEngrailed-2 נוקאאוט (En2 - / -) עכברים, מודל של הפרעות ספקטרום האוטיסטי (ASD). בהשוואה לפרא-סוג פקדים (WT), En2 - / - עכברים הראו גירעונות למידה מרחבית משמעותיים בMWM. לאחר MWM, הבדלים משמעותיים במספר תאי עצב הטבה חיובי אותרו בתת תחומים ספציפיים בהיפוקמפוס של En2 - / - עכברים, בהשוואה לבעלי החיים WT. כך, הפרוטוקול שלנו יכול וחסונה לזהות הבדלים בנוירונים הטבה חיוביים הקשורים לירידת ערך למידה בהיפוקמפוס תלוי במודל עכבר של ASD. באופן כללי יותר, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם לחקור את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בשני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות התפתחותיות כוללות קבוצה רחבה והטרוגני של הפרעות כגון תסמונת דאון, תסמונת X השביר (FXS), תסמונת רט, נוירופיברומטוזיס, טרשת גבשושית וASD, שבפיתוח וההבשלה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מופרעת מוקדם במהלך התקופה טרום לידה 1. תפקוד המוח התפתחותית אלה יכול לגרום לתופעות עמוקות, לכל החיים על תפקוד מוטורי, שפה, למידה ותהליך הזיכרון. שפע של גורמים גנטיים וסביבתיים היה מעורב בפתוגנזה של הפרעות התפתחותיות במהלך השנים האחרונות 2,3. גם אם המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפנוטיפ הקליני אינו ידועים, הממצאים הנ"ל אפשרו הפיתוח של מספר מודלים עכבר של הפרעות אלה. גירעונות למידה וזיכרון זוהו במספר המודלים האלה עכבר כגון Tsc1 +/-, Tsc2 +/-,NF1 +/- וEn2 - / - עכברים 2,4-7. אתגר חשוב בתחום של הפרעות התפתחותיות הוא זיהוי של תהליכים תאיים ומולקולריים שבבסיס זיכרון ולמידת תפקוד לקוי. מסלולי איתות נבחרים הופעלו במהלך למידה או זיכרון יכולים לגרום לשעתוק של גנים ספציפיים וסופו של דבר להוביל לדה נובו סינתזת חלבון. שינויים סינפטיים גנים מיידיים-מוקדם הפעלה (IEGs) וחלבון תלוי מושרים במהירות בתאי עצב במוח בתגובה לפעילות עצבית ואימון התנהגותי 8,9.

גירעונות במסלולי איתות מעורבים neurofibromin נקשרו עם למידה לקויה בהפרעות התפתחותיות. Neurofibromin הוא התוצר של גן NF1, מוטציה שגורם לסוג 1 נוירופיברומטוזיס, תסמונת גנטית מורכבת מאופיינת בגידולים של מערכת עצבים, עיכובים התנהגותיים ומוטוריים, וDisa קוגניטיביתbilities 10. הטרוזיגוטיים עכברים למחיקת NF1 המוגבלים לנוירונים מעכבים להראות גירעונות בשלב המוקדם של הגברה לטווח ארוך (LTP), כמו גם למידה מרחבית נפגעה בMWM 5,11,12. מעניין לציין, חוסר NF1 במודל עכבר זה מוביל להפעלת יתר של איתות ראס בinterneurons המעכבת במהלך למידה, וכתוצאה מכך זירחון ERK גדל ולבסוף בשיפור חריג של שחרור GABA מהנוירונים האלה 5.

בהתבסס על ממצאים אלה, להדמיה של פעילות עצבית לאחר משימות התנהגותיות מייצגת דרך לשחזר מעגלים ספציפיים מעורבים במחלות נוירו-התפתחותי. פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה המתואר כאן מטרה להעריך ולכמת רמות זירחון ERK היפוקמפוס הבאות MWM במודל עכבר ASD עם ליקויים קוגניטיביים. MWM נעשה שימוש נרחב לחקור למידה בהיפוקמפוס תלויה במרחב ובזיכרון במכרסמים 13,14 . אנחנו מחליטים להשתמש זירחון ERK כקריאת נתונים מולקולריים של למידה בהיפוקמפוס משימה תלויה, מאז ERK הוצג לי תפקיד חיוני בלמידה וזיכרון היווצרות 15. יתר על כן, מסלול ERK הוא הכרחי לפלסטיות ניסיון תלוי בפיתוח החזותית 16 הקליפה. לבסוף, עכברים חסרי אחד משני ERK isoforms (ERK2) בתכנית של מערכת העצבים המרכזית מסומנים חריגות בהתנהגות קוגניטיבית, רגשית וחברתית 17, מצביעים על כך שאיתות ERK עשויה לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של הפרעות התפתחותיות כגון אוטיזם.

השתמשנו Engrailed 2 נוקאאוט (En2 - / -) עכברים כמודל של הפרעות התפתחותיות. En2 - / - עכברים להראות תכונות אנטומיים והתנהגות "כמו-ASD", לרבות אובדן interneurons המוח הקדמי 18, ביטוי מופחת של גנים הקשורים-ASD 19, ירד חברותיות, וגמישות מחשבתית לקויה 6,7,20. learni מרחביng ופגמי זיכרון, כמו אלה שהתגלו בMWM, הם חזקים במיוחד בEn2 - / - עכברי 6,7 ועשוי להיות רלוונטי לליקויים קוגניטיביים שנצפו בחולי ASD 21. יתר על כן, הראתה שהלמידה מרחבית לקויה בMWM קשורה ביטוי neurofibromin מופחת ורמות גבוהות הטבה בhilus של En2 - / - עכברים בוגרים 7. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול מפורט לאפיון immunohistochemical של ההטבה הבאה MWM במודל עכבר ASD זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים נערכו בהתאם להוראה האירופית קהילת 2010/63 / האיחוד האירופי ואושרו על ידי משרד בריאות האיטלקי.

1. טיפול בבעלי חיים, שיכון וטיפול

  1. לבצע את כל פרוטוקולי הניסוי באמצעות עכברים בהתאם להנחיות של הטיפול בבעלי החיים המוסדי בהתאמה.
  2. לשמור על בעלי חיים בשעתי אור 12 / מחזור כהה עם אוכל וכרצונך מודעה זמין מים.
  3. בית העכברים בקבוצות של 2-4, בכלובי עכבר פוליקרבונט בגודל סטנדרטי עם נסורת וחומר מצעים מוחלפים מדי שבוע.
  4. השתמש גיל ועכברים בהתאמה מין, בגלל רגישות למחלה יכולה להשתנות עם גיל ומין במודלים של עכברים שונים של הפרעות התפתחותיות.
  5. בחר מספר מתאים של בעלי חיים הגיע למשמעות סטטיסטית (מינימום של 10 עכברים לכל גנוטיפ לחקר ההתנהגות ו4 עכברים לכל גנוטיפ לניסוי אימונוהיסטוכימיה).

2. מבוך מוריס מים (MWM)

  1. השתמש טנק חוזר (100 סנטימטרים קוטר, גובה 50 סנטימטרים).
    1. מניחים כמה רמזים חזותיים בחדר מחוגה סביב הטנק.
    2. מניחים פלטפורמת קוטר 10 סנטימטרים לתוך הטנק במיקום קבוע במרכזו של אחד מארבעה רביעים דמיוניים. שמור את הפלטפורמה מוסתרת באותו רביע לכל ניסויים בכל האימונים.
    3. מלא את הבריכה במים ברז עד לפלטפורמה היא 1 סנטימטר מעל פני מים. טמפרטורת מים לאזן צריכה להיות קרובה ל 22 מעלות צלזיוס; צעד זה עשוי להימשך מספר שעות. מוסיף מים חמים כדי לקצר את הזמן הנדרש כדי לאזן את טמפרטורת מים.
    4. להוסיף כ 1.5-2 ליטר של צבע לבן, שאינו רעיל כדי להפוך את המים אטומים.
  2. מסלול רכישת נוהל
    1. הגדר את מערכת המעקב של MWM עם מצלמות CCD סטנדרטיים ולוחות וידאו. בחר מערכת וידאו-מעקב למעקב וניתוח מספר משתנה כגון אורך דרך, escaחביון PE, ואת המשך זמן בכל רבע.
    2. מחלקים את הזירה בארבעה רביעים ולהתאים את הגדרות זיהוי כדי להבטיח ניגוד אופטימלי בין בעלי חיים ורקע למעקב בשידור חי.
    3. ציין את אזור הפלטפורמה.
    4. קבע את זמן משפט המרבי 60 שניות.
  3. MWM בדיקה
    1. לפני בדיקת התנהגות, תאפשר עכברי תקופת הסתגלות של 20-25 דקות באזור שבו הם לא יכולים לראות את הבריכה או רמזים מרחביים.
    2. לאמן את כל עכבר ל9 ימים (שני משפטים רצופים ביום, עם 20-30 דקות מרווח ביניהם).
    3. הפעל את המחשב ואת המצלמה ולהפעיל את תוכנת מערכת מעקב וידאו.
    4. קח את העכבר בזנבו ולמקם אותו לתוך מים, עם הראש שלה הצביע לעבר הצד של בריכה, החל מאחד מארבעת מיקומי ההתחלה (צפון, דרום, מזרח, מערב). לכל עכבר, את מיקום ההתחלה צריך להיות שונה וpseudorandomized פני ניסויים.
    5. בואו לשחות העכבר ולחפש platfORM למקסימום של 60 שניות. ברגע שבעלי החיים מגיעים לפלטפורמה, לאפשר לו להישאר על הפלטפורמה במשך 20 שניות.
    6. אם עכבר לא הצליח לאתר את הפלטפורמה בפרק זמן זה, בעדינות להנחות את העכבר לפלטפורמה, מחזיק אותו בזנבו ולתת לו להישאר שם במשך 20 שניות. ברגע שבעלי החיים השלים כל שני ניסויים, לייבש אותו במגבת והחזרת אותו לכלוב.
    7. כל יום בתקופת ההכשרה, לחזור על אותה הפרוצדורה (צעדי 2.3.4-2.3.6).
    8. בצע את בדיקת הבדיקה ביום 9 אחרי השביל האימונים האחרון.
    9. הסר את הפלטפורמה מהברכה.
    10. בואו לשחות העכבר ולחפש את הפלטפורמה למקסימום של 60 שניות.
    11. מעת לעת, לבדוק את טמפרטורת המים, כך שהוא צריך להיות זהה (22 מעלות צלזיוס) ולנקות את הבריכה.

3. הכנת סעיפים מבעלי חיים perfused

  1. להקריב את העכברים בסוף MWM. ארבעה עכברים לכל גנוטיפ חייבים להיות מורדמים לפני euthanizני על פי הנחיות בינלאומיות ומקומיות.
  2. Perfuse בעלי החיים transcardially (לחתוך את זכות auriclewith מספריים כדי לאפשר דימום ולהציג את צינורית פרפר לתוך החדר השמאלי לינקבו) עם מי מלח פוספט (PBS) במשך 4-5 דקות, ואחריו paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS במשך 10-15 22 דקות.
  3. לנתח ופוסט-לתקן את המוח paraformaldehyde 4% ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 12.
  4. מניחים את המוח בצינורות 50 מיליליטר חרוטי קלקר המכילים 15 מיליליטר של 0.02% נתרן יזיד 0.1 M PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד דרוש לחיתוך.
  5. לחתוך ולהסיר את המוח הקטן לפני vibratome חיתוך.
  6. מדביקים את המוח זקוף עם אתר החיתוך, באמצעות דבק מגע, על צלחת בעל vibratome.
  7. חותך את המוח ל20-40 מיקרומטר סעיפי עטרה עבה, כדי סידורי ברחבי ההיפוקמפוס הגב, על vibratome המתאים.
  8. לאסוף vibratome פרוסות עם מברשת צבע ולהעביר ל24 צלחת רב גם מכילה 1 מיליליטר של 0.1 מ 'PBS לכל אחד.
  9. חלקי חנות לטווח קצר בPBS או ארוך טווח ב0.02% נתרן יזיד PBS ב 4 מעלות צלזיוס (רקמה עשויות לשמש לעד שנה).

4. אימונוהיסטוכימיה

  1. העברה 3-5 חלקים הגבי בהיפוקמפוס לכל עכבר, ל -24 צלחת רב גם מכילה 500 μl של 0.1 מ 'PBS לכל אחד.
  2. שטוף את החלקים כלולים בכל טוב עם 500 μl של 0.1 מ 'PBS (5 דקות, 3 פעמים עם רעד עדין).
  3. להרוות פעילות peroxidase אנדוגני, על ידי דוגרים סעיפים ב 1% H 2 O 2 ב PBS במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה.
  4. לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
  5. Permeabilization של רקמה: דגירה סעיפים 5 דקות ב0.2% Triton X-100 ב PBS.
  6. במהלך השלבים לעיל (4.4; 4.5), לעשות מספיק חיץ חסימה (10% עיזים סרום ושל 0.1% Triton-X100 בPBS) לניסוי כולו (number סעיפים x 100 x μl 3 שלבים).
  7. הערה: השתמש בסרום מאותו המין שבי Ab המשני (מצומדת לביוטין) נעשה.
  8. למנוע שאינו ספציפי מחייב של הנוגדנים, על ידי דוגרים סעיפי חסימת חיץ (100 μl / סעיף) לשעה 1 בטמפרטורת חדר (RT) עם תסיסה עדינה.
  9. סעיפי דגירה בAb העיקרי (הטבה) בדילול בחסימת מאגר, הלילה ב 4 מעלות צלזיוס, עם תסיסה עדינה.
  10. לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
  11. דגירה עם Ab המשני מצומדות עם ביוטין (1: 250) בדילול בחסימת מאגר (זהה לשימוש בשלב 4.6) במשך שעה 1 ב RT עם תסיסה עדינה.
  12. הכן מגיב ABC באותו הזמן, כי avidin וביוטין דורשים לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר למתחם.
  13. הכן את הנפח הנדרש של מגיב ABC על פי הפרוטוקול של יצרנים.
  14. לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
  15. Incubatסעיפי דואר במשך 45 דקות ב RT עם ABC מגיב.
  16. לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
  17. הכן DAB עובד פתרון, כל צעד הכרוך בDAB חייב להיעשות במנדף כמו DAB הוא מסרטנת וטרטוגניות.
  18. העבר את פתרון DAB לצלחת חדשה על ידי פיפטה העברה פלסטיק.
  19. סעיפי מקום בצלחת המכילה DAB עובד פתרון וצלחת מערבולת לאט ביד, על מנת לאפשר חשיפה המרבית לחלקים.
  20. צג תגובת DAB במיקרוסקופ עד אות מספקת מתפתחת (2-5 דקות).
  21. לעצור את התגובה בעוצמת הצבע הרצויה על ידי שטיפה ברקמת 0.1 M PBS (3 x 5 דקות).
  22. להשתמש באקונומיקה כדי לבטל כל פתרון מצע DAB שנותר במנדף לילה ולהיפטר ממנו על פי הנחיות מעבדה.
  23. חלקי הר על ג'לטין מצופים שקופיות על ידי צף בPBS. לאחר מכן לייבש אותם בטמפרטורת חדר שעות לפחות 3-4.
  24. מייבש את רצף הקטעים ב -50%, 70%, 95%ואתנול 100% עבור 2 דקות כל אחד, וברור בקסילן 100% במשך 5 דקות.
  25. Coverslip באמצעות הרכבה בינונית ולהשאיר במנדף לייבוש למשך הלילה.

רוזן 5. סלולארי

  1. ספירת תאי הטבה חיובית, 04:57 חלקים ברמה של ההיפוקמפוס הגב צריכים להיות מנותחים לכל בעלי חיים.
  2. לרכוש תמונות בהירה שדה מרובים מכל חלק בהגדלה 200X באמצעות מיקרוסקופ מתאים, ולאחר מכן להרכיב אותם באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.
  3. לבצע ספירת תאים בתמונות פסיפס-יומר TIFF באמצעות התוכנה חופשית ImageJ.
  4. ספירת תאים צבעוניים הטבה בשכבת תאי hilus וגרגיר מעל 02:58 תיבות ספירה של 100 × 100 מיקרומטר כל אחד.
  5. צפיפות התא תבוא לידי ביטוי כמספר התאים שכותרתו לחלון ספירה (100 × 100 מיקרומטר).
  6. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים כדי להעריך הבדל משמעותי בין גנוטיפים. זה יכול להיות מושלם עם לא של הסטודנטיםבדיקה או ניתוח השונה ואחריו מבחן הפוסט הוק המתאים באמצעות תוכנות מסחריות. רמה שנקבעה סטטיסטית משמעות בp <0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן נועד להמחיש, על ידי אימונוהיסטוכימיה, הביטוי של סמן ספציפי של פעילות הנוירון היפוקמפוס לאחר MWM במודל עכבר של הפרעות התפתחותיות. כל נתוני הניסוי הראו זאת נלקחו מהעבודה האחרונה שלנו 7. WT זכר והנקבה וEn2 - / - המלטה באותו הגיל מבוגר (בן 3-5 חודשים; משקל = 25-35 ז) שהתקבלה מהזדווגויות הטרוזיגוטיים היו בשימוש. עשרים ושניים עכברים (11 לכל גנוטיפ) שמשו לMWM. שמונה עכברים (4 לכל גנוטיפ) הוקרבו בסוף משפט הבדיקה MWM ומשמשים לניסויי אימונוהיסטוכימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מספקים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה הטבה לחשיפת הפעלה עצבית הבאה MWM בEn2 - / - עכברים, מודל עכבר של הפרעות התפתחותיות. רמות ירידה של ההטבה אותרו בתת-תחום CA3 של En2 - / - מוטציות לעומת WT. באופן שונה ממה שנצפה בתת-תחום CA3, עלייה כללית של נוירונים הטבה חיוביים זוהה במקום בשני hilus וGCL של En2 - / - עכברים בהשוואה לWT. הסבר אפשרי של מגמה הפוכה זה ברמות זירחון ERK עשוי להסתמך על מנגנונים תת-תחום ספציפי של אינדוקציה ההטבה הבאה MWM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מבקשים להודות לצוות הניהולי של CIBIO (אוניברסיטת טרנטו) וCNR Neuroscience מכון לסיוע. ג'ובאני פרובנצאנו נתמך על ידי פוסט דוקטורט מFondazione Veronesi (מילאנו, איטליה). עבודה זו מומנה על ידי המשרד האיטלקי של אוניברסיטות ומחקר (PRIN 2008 מענק # 200894SYW2_002 וprin 2,010-2,011 מענק # 2010N8PBAA_002 לYB), אוניברסיטת טרנטו (מענק CIBIO הזנק לYB) וקרן Telethon (GGP13034 # מענק ל YB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
EthoVision XT 8Noldus טכנולוגייתפלטפורמת תוכנה זו אינה דרישה – ישנן תוכנות התנהגותיות רבות אחרות בשוק.
טמפרה צבעג'וטו - חברתלבן ונוזלי, לא רעיל. משמש להכנת מים אטומים במבוך המים של מוריס.
ניתן להשתמש בדגמים מקבילים שלVibratomeLeicaVT1200
צלחת 24 בארסיגמאCLS3524
100% אתנולפישר סיינטיפיקA406-20משמש לייצור שיפוע אתנול להתייבשות לפני הרכבת שקופיות.
קסילןVWR66004-950רעיל - לשימוש מתחת למכסה המנוע. החלף קסילן מדי חודש בהתאם לשימוש.
נתרן אזידסיגמא  S2002
PBSSigmaP3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100Sigma T-8787
מי חמצןSigmaH1009-100ML
סרום עיזים רגילAbcamG9023-10ML
ערכת ABC Vectastain מעבדות וקטורPK-6100מוסיפים נפח של 5 מ"ל PBS 2 טיפות מגיב A, מערבבים ולאחר מכן מוסיפים 2 טיפות מגיב B ומערבבים.
מצע DAB פרוקסידאזVector LaboratoriesSK-4100הוסף נפח של 5 מ"ל ddH2O: 2 טיפות של תמיסת מלאי חיץ וערבב; 4 טיפות DAB וערבב; 2 טיפות של H2O2 וערבב.
[header]
pERK antibodyCell Signaling Technologies 4370דילול 1:500
ביוטינילציה עז אנטי-ארנב IgG נוגדןוקטור מעבדותBA-1000 דילול 1:250
SuperFrost Slides קארל רוט1879
CoverslipsFisher12-548-B
DPXSigma317616אמצעי הרכבה למגלשות. ניתן להשתמש באמצעי הרכבה שווה ערך.
מיקרוסקופ  צייס ניתן להשתמש במיקרוסקופ שווה ערךשל Axio Imager.M2
Adobe PhotoshopAdobe Systems, סן חוזה, קליפורניהכדי להרכיב תמונות.
ניתן להוריד את תוכנת ImageJ המכוןהלאומי לבריאותתוכנה חינמית בכתובת http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0Systat Software Inc. (ארה"ב)ניתן להשתמש בתוכנות שוות ערך לניתוח סטטיסטי.
Prism 6GraphPad Software, Inc. (לה ג'ולה, קליפורניה, ארה"ב)ניתן להשתמש בתוכנות שוות ערך לניתוח סטטיסטי.
מידע קבוצת פילה של חברות אחרות..

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
  2. Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
  3. West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  4. Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
  5. Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
  6. Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914(2012).
  7. Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
  8. Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
  9. Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
  10. Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
  11. Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
  12. Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
  13. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  14. Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
  15. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
  16. Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
  17. Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
  18. Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
  19. Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51(2013).
  20. Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
  21. Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
  22. Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4(2009).
  24. Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

pERKEngrailed 2

מאמרים קשורים