א-סימטרי טיילת: רומן התנהגות Assay עבור לימוד אסימטרית תנועה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות דריכה מדויקת במכרסמים. אותות מחולל הדפוס המרכזי של קליפת המוח ועמוד השדרה נדרשים למיקום מדויק של כף הרגל במהלך תנועה חסומה. אנו מדווחים כאן על משימת ההליכה המוגבלת החדשה הבוחנת ישירות התנהגות צעד מדויקת.

תקציר

מבחני התנהגות משמשים בדרך כלל להערכת ירידת הערך הסנסורית במערכת העצבים המרכזית (CNS). השיטות המתוחכמות ביותר לכימות גירעונות של תנועה במכרסמים היא למדוד הפרעות דקות של הליכה עילית מאולצת (למשל., ציון מדריך לBBB או מסלול אוטומטי). עם זאת, תשומות בקליפת המוח אינן נדרשות עבור הדור של תנועה בסיסית המיוצרת על ידי גנרטור השדרה המרכזי הדפוס (CPG). כך, משימות הליכה בלתי מוגבלות לבדוק גירעונות של תנועה בשל ירידת ערך בקליפת המוח מוטורית רק בעקיפין. במחקר זה, אנו מציעים רומן, משימה של תנועה רגל-מיקום מדויקת שמעריך תשומות בקליפת המוח לCPG השדרה. וו-דרך instrumented שימשה להטיל משימות של תנועה סימטריות וא-סימטריים מחקה גירעונות תנועת לטרלית. אנו מראים כי משמרות מאורכים בין-צעד במרחק שווה של 20% שינויי תוצרת במאפייני שלב עמדת forelimb בזמן תנועה עם עדיפויותאורך צעד טעה. יתר על כן, אנו מציעים שביל א-סימטרי מאפשר למדידות של תוצאות התנהגותיות המיוצרות על ידי אותות בקרה בקליפת המוח. אמצעים אלה הם רלוונטיים להערכת ירידת הערך לאחר נזק בקליפת המוח.

מבוא

תחלואת שבץ הודעה באוכלוסייה ששרדה כוללת ליקויים מוטוריים גסים שמהווים אתגר להערכה כמותית בשני בני האדם לפרסם דגמי שבץ ובעלי החיים של ירידת ערך נוירולוגית ^1. במסגרת הקלינית, ליקויים המוטוריים אלה נמדדים תוך שימוש בקריטריונים סובייקטיביים אשר רגישים יותר לפגיעה קשה ולא מתונה הוצגה על ידי רוב החולים. באופן דומה, ערכות סובייקטיביות כזה של התנהגות מוטורית לאחר פציעה בבעלי חיים הן נפוצות, למשל., ^2,3 השיטה בקנה מידה של תנועה באסו, ביטי, וBresnahan (BBB). בעוד שיטות הערכה סובייקטיבית אלה עוזרות תרגום בין מחקרי שיקום הליכה במודלים של בעלי חיים ובני אדם על ארבעה, הפרטים של גירעונות מנוע הקשורים לפעילות של קבוצות שרירים נפרדות לא העריכו. יתר על כן, ההערכה של תרומה בקליפת המוח המוטורית לתנועה, כאשם המשוער של גירעון מוטורי בתאונת כלי דם במוח,ניתן להשיג רק באופן עקיף גם באמצעות השיטות כמותיות האוטומטיות הרומן ביותר ^4,5, כפי שהם מסתמכים על שטח פתוח או משימות הליכה ליניארי. משימות אלה אינם דורשות תרומת קליפת המוח ויכולות להתבצע על ידי המנגנונים העצביים של חוט השדרה, בעלי החיים, כלומר, גנרטור הדפוס המרכזי ברשת (CPG) שחסך ברוב המודלים של בעלי החיים של נזק עצבי, לדוגמא, spinalized ^{6 -.. 8} . תרומת קליפת המוח חיונית למנגנוני השדרה אלה היו מעורבות בניסוי במשימות שדורשות התאמות צפויות יציבה ⁹ והגיעו ^10, כמו גם מדויק דריכה ^10.

יתר על כן, רוב נזק נוירולוגים הוא א-סימטרי; למשל, שבץ גורם hemiparesis, כלומר, חולשה בצד אחד של הגוף, מה שגורם הליכה סימטרית ^{11 -. 14.} אסימטריה של הליכה משותקת מופקת על ידי spatiotempor סימטריהפעלת השרירים אל באה לידי ביטוי באופן משמעותי ביותר בקיצור שלב העמדה הקשורים פושטי וההתארכות של שלב הנדנדה הקשורים המכופף של מחזור הצעד בצד שתקונית ^15,16. מגמה זו עדיין לא נחקרה על פני מגוון של מהירויות של תנועה בבעלי חיים בריאים או שתקונית. במחקר הנוכחי, שהועסקנו הניתוח של מאפייני משך שלב ¹⁷ שמתאר את מערכת היחסים בין משך שלבי עמדת נדנדה או כפונקציה של משך מחזור בכל שלב. מודל רגרסיה ליניארית הושג תואר אז עוד יותר עם ניתוח של א-סימטריה בכל הגפיים.

אנו מדווחים על שיטת עלות נמוכה רומן להערכת הפעילות של תשומות יורדים בקליפת המוח במערכת המוטורית של בעלי חיים על ארבעה המבוססים על משימה של תנועה דריכה מדויקת. משימה זו נועדה לאתגר את הקורטקס המוטורי על ידי הטלת דרישות על מיקום רגל על ​​פני טווח טבעי של מהירויות הליכה. בנוסף, דרישות רגל-מיקום הן מניפולציה לקרוא תיגר על צד השמאל או ימין של המערכת המוטורית מועדף. במשימה של תנועה דומה, מץ וWhishaw (2009) בחן את שיעורי כישלון, את מספר צעדים שלא נענו על שביל שלב לא סדיר, בחולדות. השיטה שלנו היא ללא תשלום למחקר קודם זה, ומפרט את איכות בקרת פאזות ב" מוצלח "על שלבים ^18.

פרוטוקול

הפרדיגמה האימון הבאה מעסיקה הניתוח של התאמות שלב של עכברוש Sprague-Dawley הבוגר הממוצע. ודא שהפרוטוקול המתואר במסמך זה בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים המוסדיים שלך. כל הנהלים במחקר זה בוצעו בהתאם לועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) ומשרד למעבדת צער בעלי חיים (OLAW) בבית הספר לאוניברסיטת וירג'יניה המערבית לרפואה ופועל לפי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בניסוי בעלי חיים.

1. התקנת ציוד

1. לבנות את שביל סימטרי כמו קופסא פלסטיק פתוחה העליונה אימצה עם אלומיניום תומכת בכל פינת מדידה 155 סנטימטרים X 104 סנטימטר (איור 1). תתרגש הקצוות העליונים של התיבה עם ברים אלומיניום מחורץ משני הצדדים כדי לאפשר למיקום חלופי יתד, לאורך ההיקף של התיבה, כך שכל יתד ברציפות באותו הצד מגדירה את אורך הצעד.
2. מניחים 20 סנטימטרים X 20 סנטימטרים פלטפורמה בכל פינה (ארבעה בסך הכל) שהפרידה בין התנאים מיוצגים בכל צד. מרחק זה צריך להיות מספיק להכללת המרחק נחצים על ידי מחזור צעד חולדה אחת.
   1. השתמש ביתדות עשויות אלומיניום עם ממדים של 20 סנטימטר 1 ס"מ על 0.5 ס"מ. בנד החלק העליון של כל יתד 2.5 סנטימטר מהקצה כדי לייצר פלטפורמת מיקום רגל.
   2. אבטח את היתדות לברים מחורץ באמצעות הזזה סוגריים בתוך דרך חורים במכונה באותו המרחק, כדי להבטיח רמת מיקום אופקי. התאם את עמדות באמצעות מברג ושליט. השתמש ברוחב 1 סנטימטר יתד שמבטא בקירוב את גודל כף חולדה הממוצע; יתדות דקות יותר או רחבות יותר הם או לא נוחים או להגדיל את השתנות מיקום רגל.
3. מניפולציות מיקום היתד בכל צד כדי לייצר אחד משלושה תנאי אתגר דריכה מדויקים.
   1. לייצר משימה של תנועה סימטרית באורך 15 סנטימטר צעד (SL15) על ידי הגדרת השמאל אניnter-צעד אורך (ISL יב) ואורך נכון בין-צעד (ISL r) למחצית מאורך צעד (7.5 סנטימטרים).
   2. להטיל תנאי נוסף סימטרי (SL12) על ידי שינוי אורכי ISL אני וISL r 6.0 סנטימטר.
   3. לייצר משימות סימטריות על ידי שינוי המרחק בין יתדות בצדדים השמאל וימין, כינה את האורך בין-צעד. לאתגר את המערכת המוטורית סימטרי, לשנות את ISL אני וISL r ב -20% להטיל אורכים בין-מרחק קצר מכל צד (L9R6) על (מצב L6R9) עזב או מימין. 1.5 הפרעות סנטימטר להטיל ISL l של 6 סנטימטר וISL r של 9 סנטימטר למצב L6R9, או ISL l של 9 סנטימטר וISL r של 6 סנטימטר למצב L9R6
4. לחולדות, לשמור על אורך הצעד לכל התנאים למעט SL12 ב15 סנטימטר מועדף.
5. לנוחיותכם, להקצות לכל צד של שביל ארוך מצב א-סימטרי העדפת שמאל או rצד ight של הנושא, תוך שמירת שני הצדדים הקצרים למצב השליטה הסימטרי.
6. התקנת מצלמה בחדות גבוהה עם קצב דגימה של לפחות 60 הרץ, כך שהמיקום של גפיים ביתדות היא בלא הפרעה עם המצלמה מצביעה בניצב לשביל עם שדה הראייה ומכסה כ 7 שלבים. הצעדים הראשונים ואחרונים בסמוך לפלטפורמות הם התעלמו.

2. הדרכה על מכשירים

1. אנא השתמש במשאבי הדרכה סטנדרטיים, למשל., NIH ההדרכה ביסוד Biomethodology לחולדות מעבדה, לקראה עם אימון התנהגותי כללי של מכרסמים.
2. בתחילת אימון, להסתגל נושאים על ידי הצבת ומתגמל אותם על פלטפורמת סנטימטר 20 x 20 לפחות 5 דקות. לאחר מכן, להנחות את בעלי החיים על פני הסדר יתד עם אורך בין-צעד 1 סנטימטר לפלטפורמה הבאה על ידי ההצגה של גמול מזון. Reward חיות מילוליים ועם ליטוף להגיע הפלטפורמה.
3. Afte5 ריצות r הכשרה, מרחב יתדות 1 נוסף - מלבד 2 סנטימטר ולבצע 5 ריצות האימון הבאות. מספר החזרות מופיעים במסמך זה מספיק כדי לייצר גודל מדגם סטטיסטי מתאים (20 - 35 צעדים).
   1. אם בעלי החיים רוכש את המשימה יותר לאט כמו להישפט על ידי עקביות של דריכה (אין עצירה) ויציבה (קימר את גבה), ואז להתמקד באימוני חיזוק מיומנויות אלה באורכי מרחק הקצרים (S12) לפני חידוש אימונים בצעדים הארוכים ( S15) סופו של דבר מתקרב אורך הצעד הרצוי.
   2. אם המרווח החדש גורם חרדה או אי נוחות עם המשימה, להתקין מחדש את היתדות להגדרה הקודמת ולחזור על הפרדיגמה אימונים.
   3. להמשיך עם אימונים זה עד האורכים בין-הצעד המתאימים מושגות לארבעת תנאים וסטנדרטים של תנועה הם נפגשו. מניסיוננו, החולדות מגיבות היטב לעידוד קולני כרמזים לייזום משפט. הבדיקה יכולה להיעשות באותו היום כמו אימון בתנאיהנושאים מונעים לבצע את המשימה.
      הערה: הסטנדרטים של תנועה הם כדלקמן: ההליכה היא עקבית ואינו כרוכים בעצירות או משגים; ראש קיצוץ הוא מינימאלי; הגב הוא קמור והזנב מורם בזמן תנועה; כל איבר הוא ברור לעין ממבט מאונך של השביל בתחילת וקיזוז של שלב העמדה. תהליך בחירה זו הוא חיוני כמו המחקר הנוכחי מתמקד רק בהליכה ולא התנהגות gaiting אחרת.

3. בדיקה וניתוח נתונים

1. בעלי חיים מבחן על משימות S12, S15, L9R6, וL6R9 (שתוארו בסעיף 1.3) באמצעות עיצוב פגישה אקראי. השתמש בהפסקות כדי למנוע הסתגלות בתוך משימה.
2. שיא מפגשים עם מצלמה בחדות גבוהה עם קצב דגימה של לפחות 60 הרץ. יבוא וידאו הקלטות ללא דגימה חוזרת לתוכנת עריכת וידאו ובחר את התקפי הליכה בלבד לניתוח נוסף.
3. מארק onsets וקיזוז של שלבי kinematicבהקלטות וידאו מכל נושא.
4. הנה, להשתמש videoa נקרא התוכנה המותאמת אישית נכתב Matlab לזהות באופן ידני את זמן תחילת עמדה וקוזז לכל איבר על בסיס מסגרת לפי מסגרת, שבו תחילת עמדה מצויינים על ידי האובדן של תנועה לטשטש הקשורים למיקום האיבר ב יתד, ועמדה בקיזוז, המתרחשת בתחילת איבר ההמראה, הוא הצביע על ידי הראיות הראשונות של הצעה לטשטש.
5. חשב את משך הזמן של שלב תנופה כזמן שנותר בין שני onsets עמדת kinematic רצוף. תכלול כל התנהגות לא עולה בקנה אחד עם הליכה ארבע רגליים עיליות, למשל., כאשר הליכה מכילה שלב כפול נדנדה (שני forelimbs או hindlimbs מעל הקרקע), מהליך ניתוחי.
6. עלילה משך הזמן של כל שלב כפונקציה של משך מחזור הצעד המקביל. ללכוד את מערכת היחסים עם מודל רגרסיה ליניארית (Tphase = B1 + B2 * TC) התקבל לכל איבר, שבו TC הוא משך מחזור, Tphase הוא דוארעמדה הפכה למה טה-קשור פושטי או TF, שהיא הקשורה למכופף הנדנדה, וB1 ו- B2 הם קבועים אמפיריים (בקיזוז ושיפוע) של מודל רגרסיה.
   הערה: המדרון (B2) מייצג את סכום שינוי במשך שלב עם השינוי במהירות של תנועה.
7. השתמש במשוואות 1 ו -2 (איור 2 ג) לכל איבר לחישוב מדד סימטריה (AI). לשניהם יש משוואות אותה צורה של יחס פשוט שמנרמל את ההבדל של שני ערכים לסכום שלהם.
   1. שימוש במשוואה 1, לחשב את ההפרש האופקי _(h AI) שמשתמש בהבדל בין מורדות אפנון עמדת שמאל (L) ונכונים גפיים (r). באופן דומה, לחשב את הסימטריה האנכית (AI _v) באמצעות המדרונות מקדמיים / קדמי (א) ובחזרה / אחורי גפיים (עמ '). התוצאה של יישום שתי המשוואות הללו היא בסיס הנתונים של 4 נקודות XY המתאימות 1) סימטריה forelimb, _h AAI; 2) א-סימטריה hindlimb, _h פאי; 3) עזב את הסימטריה forelimb-hindlimb, Lai _נ; 4) חוסר סימטריה תקין forelimb-hindlimb, RAI _נ.
   2. עלילה ערכים אלה ככתם (איור 2) לייצוג החזותי של א-סימטריה בכל הגפיים.
8. חישוב מדדי אֲלַכסוֹנִיוּת (DI) כדי להעריך צימוד אלכסוני בין פרמטרים של forelimb וhindlimb הנגדית שלה (המשוואה 3, איור 2C).
9. בדוק את DI, כמו גם ההבדל של ארבעה AIS בין התנאים של התנגדות סימטריה (ΔAI = | AIL9R6 - AIL6R9 |) למובהקות סטטיסטיות באמצעות ANOVA חד כיווני עם ההשוואה פוסט-הוק של ניתוח אמצעי ¹⁹

תוצאות

איור 2 מציג את הניתוח של א-סימטריה במשימות של תנועה לנושא הנציג יחיד. הערכים חושבו לכל תנאי שימוש במשוואה 1 ו- 2 מכל הנושאים בנפרד (איור 2) ומנתונים מורכבים של חולדות נקבות 8 Sprague-Dawley (250-400 גר ', איור 3). בדרך כלל, האפנון של שלב עמדת forelimb היה פחותה לצד שמצב התנועה היה מועדף (ISL הקצר), עולה בקנה אחד עם הרעיון ששלב העמדה בצד המועדף (ISL הארוך) נטה לכבוש חלק גדול יותר של מחזור צעד בה...

דיון

הרציונל למחקר זה היה לפתח משימה התנהגותית המעריכה כמותית את השינויים בשליטה מדויקת בהתנהגויות תנועתיות אסימטריות. קיומו של ה-CPG בעמוד השדרה הוכח מבחינה תפקודית מזה זמן^{מה 20}, אך המאפיינים האנטומיים והתפקודיים המתארים את המנגנון שלו כמו גם את התשומות המווסתות שלו ממסלולי משוב יורדים או חושיים לא אופיינו עד העשור האחרון^6,21,22. הקונצנזוס הנוכחי הוא שהפקודות הפנימיות של עמוד השדרה, המשוב החושי והפקודות היורדות משולבות באופן הדוק ביצירת התנהגות תנועתית¹

משימת מיקום...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
MATLAB® R2013a	פלטפורמת עיצוב MathWorks		לתוכנת הערות וידאו מותאמת אישית
Sony HDR-CX380/B מצלמת Handycam בחדות גבוהה	Sony	27-HDRCX330/B	מכשיר רכישת וידאו.
חמאת בוטנים קרמית Jif - ללא גלוטן 454 גרם	J.M. Smucker Company	Food Reward Stimul
טבלית סוכרוז - שוקולד 1800 גרם	TestDiet	1811256	גירוי תגמול מזון.
מקלות כרסום עץ מנזניטה	BioServe	W0016	להצגת גירוי תגמול מזון.

.