נויטרופילים ממלאים תפקיד חשוב לא רק בהגנה על המארח מפני מיקרואורגניזמים פולשים, אלא גם מעורבים במעקב חיסוני אחר תאי גידול. כאן, אנו מתארים טכניקות הקשורות לבידוד נויטרופילים בעלי תכונות אנטי-גידוליות ושיטות לניטור תפקוד נויטרופילים נגד גידול במבחנה וב-vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים
במאמר זה
סיכום
תקציר
נויטרופילים, הנפוצים ביותר של כל תאי הדם הלבנים במחזור האדם, ממלאים תפקיד חשוב בהגנה המארחת נגד מיקרואורגניזמים פולשים. בנוסף, נויטרופילים לשחק תפקיד מרכזי במעקב חיסוני של תאים סרטניים. יש להם את היכולת לזהות תאים סרטניים ולגרום למוות של תאים סרטניים או באמצעות מנגנון מגע תלוי תא מעורב מי חמצן או באמצעות רעיל נוגדנים תלויים בתיווך תא (ADCC). נויטרופילים עם פעילות אנטי-סרטנית יכולים להיות מבודדים מהדם היקפי של חולי סרטן ושל עכברי נושאות גידולים. נויטרופילים אלה מכונים נויטרופילים-entrained גידול (TEN) כדי להבחין ביניהם הנויטרופילים של נבדקים בריאים או עכברים נאיביים שלא מראים פעילות ציטוטוקסיות גידול משמעותית. בהשוואה לתאי דם לבנים אחרים, נויטרופילים להראות ציפה שונה שהופכים אותו אפשרי על מנת להשיג> 98% מאוכלוסיית נויטרופילים הטהורים כאשר נתון שיפוע צפיפות. עם זאת, בתוספתלאוכלוסיית נויטרופילים בצפיפות גבוהה הנורמלית (HDN), בחולי סרטן, בעכברי נושאי גידול, כמו גם בתנאים דלקתיים כרוניים, אוכלוסיות מובחנות נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) מופיעות במחזור הדם. LDN שיתוף לטהר עם חלק mononuclear ויכול להיות מופרד מתאי mononuclear או באמצעות אסטרטגיות בחירה חיוביות או שליליות. ברגע שטוהר נויטרופילים המבודדים נקבע על ידי cytometry זרימה, הם יכולים לשמש במבחנה ובמבחנים פונקציונליים vivo. אנו מתארים טכניקות לניטור הפעילות אנטי-סרטנית של נויטרופילים, היכולת שלהם להעביר ולייצר מיני חמצן מגיבים, כמו גם ניטור קיבולת phagocytic vivo לשעבר. בנוסף, אנו מתארים טכניקות לתייג נויטרופילים למעקב in vivo, וכדי לקבוע את היכולת אנטי-גרורתי שלהם in vivo. כל הטכניקות האלה הן חיוניות להבנה כיצד להשיג ולאפיין נויטרופילים עם אנטי-סרטניפונקציה.
מבוא
נויטרופילים תחילה התאפיינו כתאים חיסוניים המולדים המשמשים כהגנה שורה הראשונה נגד מיקרואורגניזמים פולשים. היום ידוע שנויטרופילים יש יותר מרחיק לכת פונקציות, שהיה מעורב בהרכבת מערכת חיסונית אדפטיבית נגד אנטיגנים זרים 1,2, המסדיר hematopoiesis 3, אנגיוגנזה 4 וריפוי פצעי 5. בנוסף, נויטרופילים עשויים להשפיע גידול והתקדמות גרורתי מכוח הפעילות פרו ואנטי-סרטנית שלהם 6,7. נויטרופילים מתאפיינים בגרעין מפולח צורות (ומכאן נקרא polymorphonuclear (לויקוציטים PMN)) ומכיל לפחות שלושה subclasses השונה של גרגירים כמו גם שלפוחית הפרשה 8 (1A-C איור).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בעלי חיים: עכברים ישנים 5-7 שבועות / ג BALB נרכשים מהרלן (ישראל). כל הניסויים מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת עברית המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). דגימות אנושיות: אוסף של דם מחולי הסרטן ומתנדבים בריאים אושרו על ידי המרכז הרפואי הדסה Institutional Review Board (IRB).
1. אינדוקציה של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטנית in vivo שימוש סרטן שד עכבר דגם.
הערה: יש לבצע כל הפעולות המשתמשות בפתרוני סטרילי בזרימת האוויר למינרית (צבא לבנון) ביו-בטיחות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר שנערך לאחרונה זיהינו פונקציה אנטי-גרורתי לנויטרופילים 6. נויטרופילים מעכברי נושאי גידול לרכוש פנוטיפ ציטוטוקסיות ויש לו את היכולת להרוג תאים סרטניים 6. זאת בניגוד לנויטרופילים מעכברים נאיביים שאין להם השפעה אנטי-סרטנית משמעותית 6. כמה מהטכניקות המתוארות בסעיף הפרוטוקול שימש ללימוד פונקצית נויטרופילים אנטי-סרטני במבחנת in vivo 6.
ניתן להשיג נויטרופילים ציט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נויטרופילים הם הנפוצים ביותר של כל תאי הדם הלבנים ומגישי העזרה הראשונות במקרים של זיהום ודלקת. ככזה, הם רגישים מאוד לרמזים חיצוניים ומופעלים בקלות. בנוסף, יש לי נויטרופילים מחצית חיים קצרים מאוד ותחלופה מהירה. יחד, מאפיינים אלה מעלים מספר קשיים בעבודה עם נויטרופילים, כך שאסטרטגיות ניסיוניות ייחודיות נדרשות. לדוגמא, יש כמה אסטרטגיות טיהור נויטרופילים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות.
שלב קריטי בעבודה עם נויטרופילים הוא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
ZG נתמך על ידי מענקים מתכנית I-CORE של הקרן הלאומית למדע (מס '41/11 גרנט), הקרן אביש-פרנקל, נאמנות Rosetrees, למלחמה בסרטן קרן המחקר (ICRF - מחקר פיתוח קריירה פרס) ו בסיס לדאגה. ZGF נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית לחקר הסרטן (ICRF - מחקר פיתוח קריירה פרס), מדען הראשי של משרד בריאות הישראלי וישראל איגוד הריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קווי | |||
| עכבר 4T1 תאי קרצינומה של השד | ADCC | CRL-2539 | מדיום גידול: DMEM + 10% מומת חום FBS |
| PLASTIC WARES AND | |||
| 24 בארות צלחת תרבית רקמות | Falcon | 353047 | צלחת |
| תרבית רקמה סטרילית 100 מ"מ | קורנינג | 430167 | סטרילי |
| 25 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמות | Nunc | 156340 | צלחת |
| תרבית סטרילית 90 מ"מ בדרגת חיידקים | מיניפלסט, עין שמר, ישראל | 20090-01-017 | |
| שפופרת צנטריפוגה חרוטית סטרילית 15 מ"ל | מיניפלסט, עין שמר | 835015-40-111 | |
| צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי 50 מ"ל | מיניפלסט, עין שמר, ישראל | 835050-21-111 | סטרילי |
| 12 x 75 מ"מ צינור פוליסטירן עגול תחתון | Becton Dickinson | 352058 | |
| צלחת נדידה סטרילית Millicell 24 בגודל נקבוביות של 5μ מ | Merck Millipore | PSMT010R1 | |
| צלחת באר לבנה סטרילית 96 עם תחתית שטוחה | סטריליים | Costar | 3917 |
| (40 מ"מ) | BD Falcon | 352340 | סטרילי |
| 20 גרם x 1.5 אינץ' מחט | BD Microlance 3 | 301300 | סטרילית |
| 23G x 1 אינץ' | BD Microlance 4 | 300800 | מחט סטרילית |
| 25 גרם x 5/8 אינץ' | BD Microlance 5 | 300600 | סטרילי |
| 0.3 מ"ל עם מחט 30 גרם x 8 מ"מ | BD Micro-Fine Plus Demi | 320829 | |
| סטרילי 9 מ"מ קליפס | BD, AutoClip | 427631 | |
| מגנט סטרילי EasySep | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| MACS עמודת הפרדה LS | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| מגנט מפריד MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| שקופית זכוכית מיקרוסקופ | מנזל-גל&אומל; סר סופרפרוסט בתוספת שייקר אורביטלי | J1800AMNZ | |
| סקיי ליין, קורא צלחות ELMI | S-3.02.10L | ||
| TECAN | InfiniteF200Pro | ||
| אבקת | |||
| אלבומין בסרום בקר (BSA), שבר V | Sigma | A7906 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | BD Pharmingen | 550891 | סטרילי |
| (5-(ו-6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) | בדיקות מולקולריות | C1157 | |
| Dextran T500 | Sigma | 31392 | |
| מלח נתרן הפרין מרירית המעי של חזיר | Sigma | H3149 | |
| נתרן אזיד (NaN3) | Sigma | S8032 | רעיל במיוחד, יש לטפל בזהירות |
| באבקת תיוגליקולאט | Difco | 225650 | |
| Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
| מדיה ותוספי מזון | |||
| מדיום הנשר המותאם (DMEM) | Sigma | D5796 | Opti-MEM |
| ; הפחתתי את מדיום הסרום | Life Technologies | 31985062 | |
| מכון הזיכרון הסטרילי רוזוול פארק (RPMI) -1640 בינוני | סיגמא | R8758 | |
| סרום בקר עוברי סטרילי (FBS), | סיגמא | F9665 | תעשיות |
| L-גלוטמין | , בית העמק, ישראל | 03-020-1A | |
| סטריליות נתרן פירובאט | , בית העמק, ישראל | 03-042-1B | |
| תמיסת סטרפטומיצין סטרילית פניצילין x 1000 | תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל | 03-031-5 | |
| תמיסת מלח סטרילית פוספט בופר (PBS) ללא Mg2+ ו-Ca2+ | תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל | 02-023-1 | |
| PBS סטרילי x 10 ללא Ca2+ ו-Mg2+ | תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל | 02-023-5A | סטריליים |
| בדרגת HPLC | J.T. Baker | 4218-03 | פתרונות |
| ACK – אמוניום-כלוריד-אשלגן | טכנולוגיות חיים | A10492-01 | |
| תמיסת Bromodeoxyuridine (BrdU) (10 מ"ג/מ"ל) ב-PBS | ממיסים 10 מ"ג של BrdU ב-1 מ"ל PBS ובמסנן סטרילי. | ||
| CFSE, 5 מ"מ ב-DMSO | ממיסים 2.8 מ"ג CFSE ב-1 מ"ל DMSO. יש לחלק ל-10 מ"ל בשפופרות סטריליות של 200 מ"ל ולאחסן בחושך בטמפרטורה של -20oC. | ||
| תמיסת Eosin Y | Sigma | HT110-2-32 | |
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס | תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל | 02-016-1A | סטרילי |
| , 20 מ"ג/מ"ל ב-PBS | ממיסים 100 מ"ג הפרין ב-5 מ"ל PBS סטרילי, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ. | ||
| Histopaque-1119 | סיגמא | 11191 | פילטר סטרילי דרך פילטר 0.2 מ"מ. |
| Histopaque-1077 | סיגמא | 10771 | פילטר סטרילי דרך פילטר 0.2 מ"מ. |
| מאגר ליזה של תרבית תאי לוציפראז x5 | Promega | E153A | יש לדלל 1:5 במים סטריליים ממש לפני השימוש. |
| תמיסת בדיקת לוציפראז | Promega | E1501 | מכיל אבקת מצע לבדיקת לוציפראז (E151A) ומאגר בדיקת לוציפראז (E152A) |
| תמיסת המטוקסילין של מאייר | Sigma | MHS-32 | |
| PBS + 0.5% BSA | ממיסים 2.5 גרם BSA ב-500 מ"ל PBS, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ. | ||
| PBS + 1% BSA | ממיסים 1 גרם BSA ב-100 מ"ל PBS, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ. | ||
| 5x PBS עם 2.5% BSA | ממיסים 12.5 גרם BSA בתערובת של 250 מ"ל מים סטריליים בדרגת HPLC ו-250 מ"ל PBSx10, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ. | ||
| PBS המכיל 0.5% BSA ו-2 מ"מ EDTA | ממיסים 250 מ"ג BSA ב-50 מ"ל PBS סטרילי ומוסיפים 200 מ"ל של 0.5M EDTA pH 8.0, מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ. | ||
| מאגר FACS (PBS המכיל 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA ו-0.02% NaN3) | יש להמיס 250 מ"ג BSA ב-50 מ"ל PBS ולהוסיף 200 מ"ל של 0.5M EDTA pH 8.0 ו-500 מ"ל של 2% NaN3, מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ. | ||
| תמיסת מלח (0.9% NaCl) | ממיסים 9 גרם NaCl ב-1,000 מ"ל ddw, | ||
| NaCl 0.2% | ממיסים 2 גרם NaCl ב-1,000 מ"ל ddw, תמיסת | ||
| NaCl 1.6% | ממיסים 16 גרם NaCl ב-1,000 מ"ל ddw, אוטוקלאב | ||
| 2% נתרן אזיד | ממיסים 1 גרם נתרן אזיד ב-50 מ"ל ddw סטרילי, יש לשמור ב-4oC. רעיל מאוד. | ||
| 3% תמיסת | ממיסים 3 גרם אבקת תיוגליקולט ב-100 מ"ל ddw. מרתיחים עד שהתמיסה הופכת לצהובה וחיטוי. | ||
| תמיסה כחולה טריפאן (0.4%) | Sigma | T8154 | יש לדלל 1:10 ב-PBS כדי לקבל תמיסה של 0.04%. |
| תמיסת טריפסין B | תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל | 03-046-1 | סטרילי |
| 1 מ"ג/מ"ל Zymosan A | Resuspend 1 מ"ג Zymosan A ב-1 מ"ל PBS סטרילי בשפופרת Eppendorf. מערבולת נמרצת ודוגרת על הצינור בטמפרטורה של 37 oC למשך 30 דקות. אין לבצע חיטוי. הכן את התמיסה טרי לפני השימוש. | ||
| ערכות | |||
| ערכת בחירת EasySep PE | STEMCELL Technologies | 18557 | |
| קוקטייל בחירת EasySep PE | STEMCELL Technologies | 18151 | |
| ננו-חלקיקים מגנטיים EasySep | STEMCELL Technologies | 18150 | |
| ערכת מיקרו-חרוזים לעכבר Anti-Ly6G | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
| ערכת העשרת נויטרופילים לעכבר EasySep | STEMCELL Technologies | 19762 | |
| ערכת העשרת נויטרופילים אנושיים | EasySep STEMCELL Technologies | 19257 | |
| ערכת זרימה FITC BrdU | BD Pharmingen | ||
| ערכת בידוד נויטרופילים 559619 MACS | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
| ערכת בדיקת פגוציטוזיס | חברת קיימן כימיקלים | 500290 | |
| נוגדנים | |||
| נוגדנים חוסמי FCR | Biolegend | 101302 | |
| נוגדן נגד Ly6G לחולדות מטוהרות | BD Pharmingen | 551459 | שיבוט 1A8 |
| מצומד חולדה נגד עכבר נוגדן Ly6G | Biolegend | 127608 | שיבוט 1A8 |
| FITC מצומד חולדה אנטי עכבר Ly6G | BD Pharmingen | 551460 | שיבוט 1A8 |
| PerCP-Cy5.5 חולדה נגד עכבר Ly6G | TONBO Biosciences | 65-1276 | שיבוט 1A8 |
| סגולFluor 450-מצומד חולדה נגד עכבר Ly6G | TONBO Biosciences | 75-1276 | שיבוט 1A8 |
| FITC מצומד חולדה נגד עכבר CD11b | BD Pharmingen | 553310 | שיבוט M1/70 |
| מצומד עכברוש FITC נגד עכבר Ly-6G ו-Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen | 553127 | שיבוט RB6-8C5 |
| PE-מצומד חולדה נגד עכבר CD45 | BD Pharmingen | 553081 | שיבוט 30-F11 |
| מצומד FITC חולדה נגד עכבר F4/80 | Abcam | ab60343 | שיבוט BM8 |
| FITC מצומד עכבר אנטי אנושי CD66b | Biolegend | 305103 | Clone G10F5 |
| נוגדן בקרת איזוטיפ חולדה מטוהר (IgG2a, k) | BD Pharmingen | 553927 | שיבוט R35-95 |
| עלה מטוהר אוגר ארמני נגד עכבר CD3e נוגדן | BioLegend | 100314 | שיבוט 145-2C11 |
מקורות
- Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immun....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
