הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

24.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52933

⸱

19 ביוני 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

במאמר זה

סיכום

נויטרופילים ממלאים תפקיד חשוב לא רק בהגנה על המארח מפני מיקרואורגניזמים פולשים, אלא גם מעורבים במעקב חיסוני אחר תאי גידול. כאן, אנו מתארים טכניקות הקשורות לבידוד נויטרופילים בעלי תכונות אנטי-גידוליות ושיטות לניטור תפקוד נויטרופילים נגד גידול במבחנה וב-vivo.

תקציר

נויטרופילים, הנפוצים ביותר של כל תאי הדם הלבנים במחזור האדם, ממלאים תפקיד חשוב בהגנה המארחת נגד מיקרואורגניזמים פולשים. בנוסף, נויטרופילים לשחק תפקיד מרכזי במעקב חיסוני של תאים סרטניים. יש להם את היכולת לזהות תאים סרטניים ולגרום למוות של תאים סרטניים או באמצעות מנגנון מגע תלוי תא מעורב מי חמצן או באמצעות רעיל נוגדנים תלויים בתיווך תא (ADCC). נויטרופילים עם פעילות אנטי-סרטנית יכולים להיות מבודדים מהדם היקפי של חולי סרטן ושל עכברי נושאות גידולים. נויטרופילים אלה מכונים נויטרופילים-entrained גידול (TEN) כדי להבחין ביניהם הנויטרופילים של נבדקים בריאים או עכברים נאיביים שלא מראים פעילות ציטוטוקסיות גידול משמעותית. בהשוואה לתאי דם לבנים אחרים, נויטרופילים להראות ציפה שונה שהופכים אותו אפשרי על מנת להשיג> 98% מאוכלוסיית נויטרופילים הטהורים כאשר נתון שיפוע צפיפות. עם זאת, בתוספתלאוכלוסיית נויטרופילים בצפיפות גבוהה הנורמלית (HDN), בחולי סרטן, בעכברי נושאי גידול, כמו גם בתנאים דלקתיים כרוניים, אוכלוסיות מובחנות נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) מופיעות במחזור הדם. LDN שיתוף לטהר עם חלק mononuclear ויכול להיות מופרד מתאי mononuclear או באמצעות אסטרטגיות בחירה חיוביות או שליליות. ברגע שטוהר נויטרופילים המבודדים נקבע על ידי cytometry זרימה, הם יכולים לשמש במבחנה ובמבחנים פונקציונליים vivo. אנו מתארים טכניקות לניטור הפעילות אנטי-סרטנית של נויטרופילים, היכולת שלהם להעביר ולייצר מיני חמצן מגיבים, כמו גם ניטור קיבולת phagocytic vivo לשעבר. בנוסף, אנו מתארים טכניקות לתייג נויטרופילים למעקב in vivo, וכדי לקבוע את היכולת אנטי-גרורתי שלהם in vivo. כל הטכניקות האלה הן חיוניות להבנה כיצד להשיג ולאפיין נויטרופילים עם אנטי-סרטניפונקציה.

מבוא

נויטרופילים תחילה התאפיינו כתאים חיסוניים המולדים המשמשים כהגנה שורה הראשונה נגד מיקרואורגניזמים פולשים. היום ידוע שנויטרופילים יש יותר מרחיק לכת פונקציות, שהיה מעורב בהרכבת מערכת חיסונית אדפטיבית נגד אנטיגנים זרים 1,2, המסדיר hematopoiesis 3, אנגיוגנזה 4 וריפוי פצעי 5. בנוסף, נויטרופילים עשויים להשפיע גידול והתקדמות גרורתי מכוח הפעילות פרו ואנטי-סרטנית שלהם 6,7. נויטרופילים מתאפיינים בגרעין מפולח צורות (ומכאן נקרא polymorphonuclear (לויקוציטים PMN)) ומכיל לפחות שלושה subclasses השונה של גרגירים כמו גם שלפוחית ​​הפרשה 8 (1A-C איור).

נויטרופילים יש יכולת phagocytic גבוהה ופעילות מונואמין הגבוה NADPH קריטי לחיסול חיידקים, ומפרישים מגוון רחב של כמוקינים חשובים במתיחה של נויטרופילים נוספים ותאים אחרים של מערכת חיסון לאתר של דלקת 8,9. נויטרופילים מאופיינים בביטוי של כמות גדולה של קולטני משטח כולל קולטני-כמו אגרה (TLRs), C-סוג הקטינים רצפטורים (CLRs), משלימים קולט 3 (CD11b / CD18) ומולקולות דבקות אחרות (למשל, L-selectin, LFA-1, VLA-4 ומולקולת carcinoembryonic הקשורים לאנטיגן הידבקות תא 3 (CEACAM3 / CD66b)), קולטני chemokine (למשל, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), קולטני chemoattractant (למשל, PAFR, LTB 4 R וC5aR) , קולטני ציטוקינים (למשל, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18r, TNFR), formyl-פפטיד קולטנים (למשל, FPR1-3), וקולטני Fc (למשל, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII), וCD64 (FcγRI) 10. בעכברים, נויטרופילים בדרך כלל מזוהים כCD11b + Ly6G +, ואילו נויטרופילים אדם מזוהים באמצעות סמני יקוציט CD11b, CD15, CD16 וCD66b. הוא גם מקובל להכתים לMyeloperoxidase חלבוני גרגיר (MPO) ואלסטט נויטרופילים (NE) לגילוי של נויטרופילים ברקמות.

זה עדיין לא ברור אם הפונקציות המגוונות של נויטרופילים מתווכות על ידי אותו התא או על ידי תת-אוכלוסיות תאים שונות. נתוני צבירה מציעים לנוכחותה של אוכלוסייה הטרוגנית נויטרופילים שמציגה רמה גבוהה של הגמישות מושפעת גירויים פרו-דלקתיים ומייקרו-הסביבה 11,12. Fridlender et al. 13 חילקו באופן בוטה את הנויטרופילים בסרטן לשתי תת-אוכלוסיות גדולות כינו N1 עם תכונות אנטי-סרטניים וN2 עם תכונות פרו-סרטנית. בסרטן, כמו גם בדלקת כרונית, יש תת-אוכלוסייה נוספת מורכבת מתאי granulocytic נגזר מיאלואידית מדכאת (G-MDSCs) המדכאים תגובות תא T 14. G-MDSCs נחשב לתאים בוגרים מיאלואידית מתאפיינים CD11b + Ly6Cפנוטיפ הנמוך Ly6G היי בעכברים 15, בזמן שיש CD15 + / CD16 פנוטיפ הנמוך ב -16 בני אדם. G-MDSCs להביע רמות גבוהות יותר של arginase וMyeloperoxidase, רמות נמוכות יותר של ציטוקינים בזמן וכמוקינים מ נויטרופילים במחזור נורמלים. הם פחות phagocytic ונודד, אך מייצרים רמות גבוהות יותר של ROS 15,17,18. בעבודה הנוכחית נתאר כמה שיטות בסיסיות לבידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטנית.

בעוד נויטרופילים מהווים את האוכלוסייה הגדולה ביותר של כל תאי הדם הלבנים במחזור האדם (45 - 70%; 1800 - 6000 / μl), בעכברים, בתנאים רגילים, הם די דלילים (10 - 15%; 300-500 / μl ). עליות ספירת נויטרופילים בעקביות על דלקת ולעתים בסרטן, המייצג את המדינה של דלקת כרונית 7. נויטרופילים לפתח ממבשר מיאלואידית הנפוצה multipotent לסה"נ (CMP)LLS במח העצם, בתהליך בידול עובר שלבי myeloblasts (MB), promyelocytes (PM), myelocytes (MC), metamyelocytes (MM) ותאי להקה (BC) 8. נויטרופילים הבוגרים, לאחר mitotic עשויים להישאר בתוך מח העצם עבור 4-7 ימים לפני שהם שוחררו למחזור 8. מחזור נויטרופילים בדם הוא בדרך כלל מהיר עם מחצית חיים ממוצע של 6 - 12 שעות, אשר עשוי להיות ממושכת בתנאים דלקתיים. נויטרופילים unstimulated מוגבלים פעילות אנטי-סרטנית, תכונה שניתן לרכוש על ידי חשיפת נויטרופילים הנאיביים כמוקינים IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 וCXCL5 6,19 או באופן מלאכותי, על ידי חשיפתם לphorbol אסתר phorbol 12 13-אצטט -myristate (PMA) 6.

זמן מחצית החיים הקצרים של נויטרופילים יחד דם עם המספר הנמוך של נויטרופילים (~ 3-5 x 10 5) השיגו מ1 מיליליטר דם של 6 נאיבי - עכבר בן 8 שבוע, הפכו אותוקשה לחקור את הפונקציה של מחזורי נויטרופילים עכבר במבחנה. כדי להתגבר על קושי זה, מקורות אחרים כבר בשימוש. לדוגמא, ניתן לקבל מספר גדול של נויטרופילים ממח עצם 20 או הצפק הבא האינדוקציה של דלקת סטרילית (למשל, לאחר הזרקת intraperitoneal של thioglycollate מרק או Zymosan). יש לציין כי נויטרופילים מתקבלים מחלל הצפק לא להפעיל כל פעילות אנטי-סרטנית (תצפית לא פורסם).

. גרנות ואח '6 ציינו כי עכברי BALB / ג מחוסן orthotopically עם קו תא קרצינומה 4T1 שד העכבר לפתח neutrophilia שמחריף עם התקדמות גידול 6 (איור 2 א), כך ש-20 - ניתן לבודד 40 מיליון נויטרופילים דם בקלות מהדם 1 מיליליטר 3 - 4 שבועות חיסון לאחר גידול. נויטרופילים אלה שרכשו את פעילות אנטי-סרטנית, והיה בהתאם coiנויטרופילים נד-entrained גידול (עשר), כדי להבדיל אותם מנויטרופילים נאיביים 6 (איור 2). בעוד נויטרופילים בצפיפות גבוהה (HDN, איור 1 א) הם מאוד אנטי-סרטניים, נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN, איור 1) שנוצרו בהקשר של הסרטן הם לא 21. כמו כן, יש לי נויטרופילים בצפיפות גבוהה ממח העצם והטחול של עכברי נושאי גידול פעילות אנטי-סרטני (נתונים שלא פורסמו). יש לציין כי עם התקדמות גידול הטחול המוגדל הופך בהדרגה (splenomegaly), עם הגדלת כמויות של נויטרופילים.

יש לציין כי עשר נוצרים גם בדגמים אחרים של סרטן, כולל שני (גידולי MMTV-PyMT וMMTV-Wnt1 החלב וגידולי ריאה מונעים k-ראס) ספונטניים ומוזרקים (AT-3 (MMTV-PyMT) וסרטן שד E0771 תאים, תאי LLC לואיס סרטן הריאות ותאים מלנומה B16-F10). עם זאת, היקף הגיוס נויטרופילים בקיבה אלהאו מודלים הוא הרבה פחות מעכברים מחוסן-4T1, הגיעו 5 - 10 x 10 6 נויטרופילים בדם מיליליטר 1 לאחר 3 שבועות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בעלי חיים: עכברים ישנים 5-7 שבועות / ג BALB נרכשים מהרלן (ישראל). כל הניסויים מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת עברית המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). דגימות אנושיות: אוסף של דם מחולי הסרטן ומתנדבים בריאים אושרו על ידי המרכז הרפואי הדסה Institutional Review Board (IRB).

1. אינדוקציה של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטנית in vivo שימוש סרטן שד עכבר דגם.

הערה: יש לבצע כל הפעולות המשתמשות בפתרוני סטרילי בזרימת האוויר למינרית (צבא לבנון) ביו-בטיחות.

  1. זרע 5 x 10 5 4T1 תאים בצלחת תרבית רקמת 100 מ"מ ב 10 מיליליטר של מדיום הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכיל 4.5 גר '/ D-גלוקוז L בתוספת 10% בסרום שור עוברי חום מומת (FBS), 2 מ"מ D- גלוטמין, פירובט נתרן 1 מ"מ, 100 U / פניצילין G מיליליטר ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר סולפט סטרפטומיצין. דגירה התאי דואר על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified המכילה 5% CO 2 למשך 3 עד 4 ימים. ודא שהתאים 50-100% ומחוברות ביום של הניסוי.
  2. כדי לנתק את תאי גידול מצלחת תרבית הרקמה, לשאוב את מדיום התרבות, לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר PBS, לשאוב PBS ולהוסיף 3 מיליליטר של פתרון טריפסין 2.5 g / L. דגירה התאים 2 - 3 דקות עם טריפסין על 37 מעלות צלזיוס.
  3. להוסיף 10 מיליליטר בינוני סרום המכיל לנטרל את טריפסין ופיפטה למעלה ולמטה עד שכל התאים הופרדו. מעבירים את ההשעיה תאים לצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר.
  4. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות על RT. לשאוב את המדיום עוזב 200 בינוני μl מעל התא גלולה. Resuspend התאים בהיקף השייר ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS. להפוך את הצינור 2-3 פעמים כדי לקבל השעיה תא הומוגנית ולהוציא 10 μl לספור את התאים בhemocytometer. השתמש trypan הכחול להבחין בין תאי חיים ומתים.
  5. צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 5 דקות ב 200 XG ב RT. לשאוב PBS וresuspend תאי PBS בריכוז סופי של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. ודא שיש לו את ההשעיה התא בודדת לא clumping.
  6. הזרק 1 x 10 6 תאים 4T1 או 4T1 תאים ב -50 μl PBS orthotopically לתוך כרית השמאל מפשעתי החלב השומן של עכברים / ג הנשיים BALB באמצעות מזרק 0.3 מיליליטר עם מחט 8mm x 30G להביע בלוציפראז.
    1. לפני ההזרקה, להרדים את העכברים בחדר אינדוקציה מקבלים קצב זרימה איטי של isoflurane (3-5%) ב100% חמצן.
    2. הנח את העכבר על משטח ניתוח סטרילי ולוודא הראש ממוקם כראוי בתוך חרטום isoflurane. אשר הרדמה תקינה על ידי צובט את הכף. השתמש משחה וטרינר בעיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לגלח את השיער באזור ההזרקה ולחטא עם EtOH 70%.
    3. כ שימוש בערכה סטרילית של כלים כירורגיים לעשות חתך אופקי קטן (5 מ"מ)במחצית הדרך בין imately מפשעתי ופטמות בטן, לחשוף את כרית השומן ולהזריק 1 x 10 6 תאים ב4T1 50 μl. סגור את החתכים עם קליפים 9 מ"מ שיש להסיר את שבוע לאחר מכן. הזרקה של תאים לבטא בלוציפראז מאפשרת ניטור של גודל גידול וגרור על ידי הדמיה פליטת אור.
      הערה: הליך פולשנית זו אינו דורש כל טיפול לאחר ניתוח והעכברים שהוזרקו להתאושש בתוך 2-3 דקות.
    4. צג העכברים עד שתחזרו להכרה, ולוודא שהם יחזרו להכרה מלאה לפני שהצטרף לחברה של עכברים אחרים.
  7. לאחר 3-4 שבועות, כאשר הגידול הראשוני הגיע נפח של 2 סנטימטר 3, להקריב את העכברים על ידי CO 2 זרם איטי, ומייד לאחר הנשימה האחרונה, להשיג דם על ידי לנקב לב באמצעות מחט 25G 5/8 x " מחובר למזרק טוברקולין 1 מיליליטר קודם לכן בהפרין. שמור את הפה של המחט כלפי מעלה בעת ההכנסהמזרק במצב אופקי דרך הסרעפת לכיוון הלב, ולאט ובהדרגה לצייר דם הימנעות לחץ עודף (איור 3).

2. בידוד נויטרופילים

  1. בידוד של נויטרופילים ציטוטוקסיות מהדם של עכברי נושאות גידולים.
    1. לדלל 1 מיליליטר דם שנלקח מעכבר גידול נושאות (ראה פרוטוקול 1.11) בPBS המכיל 0.5% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) לנפח סופי של 6 מיליליטר.
    2. חלוקה של דם מדולל בשיפוע סוכרוז רציף מוכן טרי:
      1. להוסיף 3 מיליליטר של סוכרוז-מסונן סטרילי 1.119 g / ml לתחתית צינור צנטריפוגות פוליפרופילן חרוטי 15 מיליליטר.
      2. לאט ובזהירות, שכבת 3 מיליליטר של סוכרוז-מסונן סטרילי 1.077 g / ml על גבי גרם / מיליליטר השכבה 1.119. לאחר מכן, להוסיף לאט ובזהירות 6 מיליליטר של דם מדולל (פרוטוקול 2.1.1) על גבי 1.077 g / ml השכבה (איור 4 א). מומלץ להחזיק השפופרת מוטה וdding הרכיבים השונים על ידי זרימה איטית, אבל רציפה, שמירה על הפה של פיפטה לעבר הקיר התחתון של הצינור, כך שאין מערבולת נוצר.
    3. צנטריפוגה הצינור המכיל הדם המדולל בשיפוע סוכרוז ב 700 XG במשך 30 דקות ב RT ללא בלם.
    4. מוציא בזהירות את הצינור מצנטריפוגות מבלי לגרום למערבולת. רוב אריתרוציטים יהיו בחלק התחתון של הצינור. נויטרופילים בצפיפות גבוהה (HDN) נמצאים כטבעת לבנה לאדום בממשק שבין 1.119 g / ml ו1.077 g / שכבות מיליליטר (כ 3 מיליליטר הסימן), ואילו כדוריות דם לבנות בצפיפות נמוכה נמצאות ב טבעת לבנה בממשק שבין 1.077g / שכבת מיליליטר וPBS BSA המכיל (סביב סימן 6 מיליליטר, ראה איור 4).
    5. לשאוב BSA PBS + 0.5% עד שמגיע 5 מ"מ מעל שכבת תאים בצפיפות נמוכה. פיפטה את התאים בצפיפות נמוכה על ידי שאיבה איטית לקצה מיליליטר 1 עד מתערבל באיטיות סביב התאים.להעביר את התאים לתוך 30 מיליליטר של PBS עם BSA 0.5%.
    6. לשאוב את השכבה העליונה באותו צינור השיפוע עד שמגיע 5 מ"מ מעל להקת התא בצפיפות גבוהה. פיפטה את התאים בצפיפות גבוהה, שהם בעיקר נויטרופילים בצפיפות גבוהה, ולהעביר את התאים לתוך 30 מיליליטר של PBS המכיל BSA 0.5%.
    7. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT.
    8. לשאוב אריתרוציטים supernatant וlyse ידי resuspending התאים ב -36 מיליליטר מים כיתה HPLC סטרילי במשך 30 שניות. Isotonicity צריך להיות משוחזר על ידי הוספת 9 מיליליטר של 5x מרוכז PBS בתוספת 2.5% (w / v) BSA.
    9. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT.
    10. לשאוב supernatant, וresuspend תאי PBS-BSA. לספור את מספר הנויטרופילים בhemocytometer ולהשתמש trypan הכחול להבחין בין תאי חיים ומתים.
    11. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT וresuspend נויטרופילים במדיום דגירה רצוי לצפיפות תא סופית. שימושנויטרופילים מייד.
    12. ואז, לאחר צנטריפוגה אחרת, resuspend נויטרופילים במדיום דגירה לצפיפות תא סופי. השתמש בנויטרופילים מייד.
  2. בידוד של מחזור נויטרופילים מחולי הסרטן.
    1. לערבב 10 מיליליטר של heparinized (20 U / ml) דם אדם עם נפח שווה של 3% T500 Dextran מלוחים ודגירה במשך 30 דקות ב RT. במהלך דגירה זה אריתרוציטים יהיו משקעים.
    2. הכן צינור פוליפרופילן חרוטי 50 מיליליטר עם ז 1.077 10 מיליליטר סוכרוז / מיליליטר ושכבה לאט supernatant יקוציט עשיר על גבי / מיליליטר שכבת 1.077 גרם סוכרוז (איור 4C).
    3. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות ב RT ללא בלם. נויטרופילים בצפיפות גבוהה (HDN) יופיעו בגלולה. נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) שיתוף לטהר עם מונוציטים וימפוציטים בממשק שבין 1.077 g / שכבת מיליליטר סוכרוז והפלזמה (איור 4D).
    4. Resuspend נויטרופילים ב 10 מיליליטר 0.2% NaCl למשך 30 שניות לlyse אריתרוציטים לזהם, ולשחזר isotonicity על ידי הוספת 10 מיליליטר של 1.6% NaCl ולהפוך פעם אחת.
    5. צנטריפוגה 5 דקות ב160 XG ב RT, ולשטוף שלוש פעמים ב 20 מיליליטר תמיסת מלח המאוזן "הנקס. צנטריפוגה לאחר כל שטיפה ולשאוב supernatant.
    6. ספירת הנויטרופילים וresuspend תאי RPMI-1640 בתוספת 2% FBS ב 2 x 10 6 נויטרופילים / מיליליטר או כרצויים.

3. העשרה של דם נויטרופילים באמצעות חרוזים מגנטיים

  1. סלקציה חיובית
    1. קח 1 מיליליטר של דם מעכבר כמתואר בפרוטוקול 1.8, עם מזרק heparinized.
    2. צנטריפוגה הדם בצינור חרוטי 15 מיליליטר ב 400 XG במשך 5 דקות על RT.
    3. לשאוב supernatant או לשמור על הפלזמה הדם למחקרים נוספים.
    4. Lyse אריתרוציטים ידי resuspending התאים במי HPLC כיתה 8 מיליליטר. לאחר 30 שניות לשחזר isotonicity על ידי הוספת 2 מיליליטר של conce 5xntrated PBS המכיל BSA 2.5%. ספירת התאים.
    5. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות על RT.
    6. Resuspend התא גלולה ב200 μl PBS המכיל BSA 0.5% ו -2 EDTA מ"מ לכל 10 8 תאים.
    7. הוסף 50 μl של נוגדן אנטי Ly6G biotinylated. מערבבים היטב ודגירה של 10 דקות במקרר (לא על קרח).
    8. להוסיף 150 μl PBS הקר המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA.
    9. וורטקס פתרון המניות אנטי-ביוטין המצופה microbead המגנטי. העבר את 100 μl להשעית התא. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר (לא על קרח).
    10. לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA, ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT.
    11. לשאוב supernatant לחלוטין, וגלול ב500 μl PBS הקר המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA.
    12. הכנס עמודת הפרדה מגנטית לבעל מגנט שמחובר לדוכן מגנטי, ולשטוף אותו עם PBS הקר 500 μl מכיל 0.BSA 5% ו -2 מ"מ EDTA.
    13. החל ההשעיה התא על הטור. הזרימה דרך מכיל תאי LyG6 שלילי ללא תווית.
    14. לשטוף את העמודה עם 500 μl PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA. תאים ללא תווית נוסף יהיו בזרימה דרך.
    15. חזור על שלב הכביסה עם עוד 500 μl PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA.
    16. הסר את העמודה מהמגנט ומניח אותו על צינור איסוף 15 מיליליטר. הוסף 1 מיליליטר של PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA, ולשטוף את התאים שכותרתו מגנטית בתוקף דוחף את הבוכנה לתוך הטור. הזרימה דרך מכילה נויטרופילים Ly6G +.
  2. סלקציה שלילית
    1. הכן לויקוציטים דם על פי צעדים 3.1.1 ל3.1.5.
    2. Resuspend 1 x 10 8 תאים ב 1 מיליליטר PBS המכילים BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA בצינור עגול תחתון-5 מיליליטר קלקר.
    3. הוסף 50 μl סרום חולדה נורמלי.
    4. הוסף 50 μl העשרת נויטרופילים גocktail (המכיל נוגדני biotinylated ספציפיים לתאי דם לבנים שאינם נויטרופילים), מערבב היטב ודגירה במשך 15 דקות במקרר.
    5. לשטוף את התאים על ידי הוספת 4 מיליליטר PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA, וXG 400 צנטריפוגות במשך 10 דקות.
    6. בטל supernatant וresuspend תאי מיליליטר 1 PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA.
    7. הוסף 50 μl של מתחמי נוגדן המכוונים נגד tetrameric ביוטין וdextran. מערבבים היטב ודגירה של 10 דקות במקרר.
    8. המערבולת גם הצינור המכיל חרוזים מגנטיים מצופה dextran לפני הוספת 150 μl להשעית התא. מערבבים היטב דגירה 10 דקות במקרר.
    9. להביא את ההשעיה תא בהיקף כולל של 2.5 מיליליטר על ידי הוספת PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA. מערבבים בעדינות כדי לקבל השעיה תא הומוגנית.
    10. הכנס את הצינור (ללא כובע) לתוך המגנט, ולתת לעמוד במשך 3 דקות.
    11. הפוך את המגנט עם הצינור באחד רציףתנועה כך שהתאים מאוגד בנוזל יועברו לצינור חדש. השאר את המגנט וצינור הפוך 2 - 3 שניות, ואז לחזור למצב זקוף. התאים לא רצויים שכותרתו מגנטית יישארו כבול לקיר של הצינור המקורי, תוך נויטרופילים מאוגד יהיו בנוזל שהועבר.

4. ציטולוגית הכתמה של נויטרופילים

  1. Resuspend 1x10 5 נויטרופילים ב -50 μl PBS ולהעביר את ההשעיה התא לתא מתאם הכנת שכבה דקה כגון Cytospin. צנטריפוגה המתאם ב XG 150 במשך 5 דקות. הפרד את שקופיות זכוכית שכותרתו מראש מהמתאם.
  2. תקן תאים על ידי טבילת שקופיות הזכוכית באתנול 70% למשך 2 דקות. לאפשר את ההכנות מהמתאם (ראה שלב 4.1) לייבוש על RT לפני הצביעה. טובלים את השקופיות 5 - 6 פעמים במים מזוקקים.
  3. כתם 1 - 2 דקות בתמיסה של מאיר Hematoxylin. יש לשטוף 1 דקות במים ברז. כתם 10 שניות בפתרון Eosin Y . לשטוף במים ברז. מייבש על ידי שטיפת השקופיות בהגדלת ריכוזי אתנול (70%, 96% ו -100%). בואו שקופיות זכוכית האוויר יבשות זמן קצר ולבדוק את השקופיות תחת מיקרוסקופ אור.
    הערה: יש Hematoxylin צבע כחול עמוק, סגול וכתמי חומצות גרעין, ואילו eosin הוא ורוד וכתמי חלבוני nonspecifically. גרגרי cytoplasmic של נויטרופילים יישארו בלא כתם על ידי צבעי חומצי או בסיסיים, המהווה את המקור לשם "אוהב להיות ניטראלי". בעוד כחול כהה basophilic כתם גרנולוציטים עם hematoxylin ו eosin וeosinophilc גרנולוציטים אדום בהיר, נויטרופילים מופיעים ורוד ניטראלי (ראה איור 1 א). נויטרופילים בוגרים מאופיינים בגרעין polymorphonuclear, שהוא באופן כללי גדול עם 2-5 'נויטרופילים מפולחים' האונות (איור 1 א ו1C). נויטרופילים בוגרים מאופיינים בגרעין מעוקל או בצורת טבעת-אונות אחד (איור 1).
ve_title "> 5. קביעת טוהר נויטרופילים ידי cytometry הזרימה.

  1. Resuspend 1x10 6 תאים במאגר של FACS 100 μl (PBS המכיל BSA 0.5%, 2 מ"מ EDTA ו0.02% NaN 3). לדגימות דם כל, נדרש המוליזה לפני הצביעה (השלבים 3.1.1 ל3.1.5). הוסף 10 μl של מגיב חסימת FCR למשך 5 דקות.
  2. הוסף 0.5 מיקרוגרם של נוגדן שכותרתו ניאון עם סגוליות לLy-6G לנויטרופילים עכבר או לCD11b וCD66b לנויטרופילים אנושיים, מערבב היטב ודגירה במשך 15 דקות ב RT.
  3. להתאים את עוצמת הקול עד 500 μl עם PBS המכיל BSA 0.5% ו- 2 מ"מ EDTA ולנתח הכתמה על ידי cytometry זרימה.

6. מעקב נויטרופילים שער in vivo

  1. בתיוג BrdU vivo של נויטרופילים
    1. הזרק של 10 מ"ג bromodeoxyuridine מיליליטר פתרון / (BrdU) ב PBS סטרילי 100 μl intraperitoneally לעכברי נושאות גידולים.
    2. לבודד נויטרופילים בדם 48 שעות לאחר הזרקהccording לפרוטוקול 2.1. כתם BrdU שכותרתו נויטרופילים באמצעות זרימת BrdU ערכה.
  2. תיוג CFSE של נויטרופילים
    1. Resuspend 10 7 נויטרופילים ב 1 מיליליטר של PBS מראש חימם.
    2. הוסף 2 μl של 5 מניות פתרון מ"מ CFSE לנויטרופילים מושעים לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. 5 מ"מ CFSE הוא הוכן על ידי המסת 2.8 מ"ג של CFSE (5 (ו 6 -) - diacetate Carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר) בDMSO 1 מיליליטר. המחלקים ל -10 aliquots μl בצינורות סטרילי 200 μl וחנות בחושך ב -20 ° C.
    3. לנטרל CFSE העודף על ידי הוספת נפח שווה של RPMI-1640 המכילים 10% FBS. דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה נויטרופילים ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT. שטוף את הנויטרופילים פעמיים ב 10 מיליליטר של RPMI-1640 המכיל 10% FBS.
    4. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות וגלולות בנפח מתאים של PBS. נויטרופילים (למשל, 1 x 10 7 תאים) יכולים עכשיו להיות מוזרקים לוריד או באמצעות הזרקת לב לעכברי נמען.

7. במבחנה לוציפראז Assay כדי לפקח על הפעילות אנטי-סרטנית של נויטרופילים המבודדים.

  1. לטפח תאים סרטניים שכותרתו לוציפראז כפי שתואר עבור 4T1 תאים בפרוטוקול 1.1-1.5, אבל resuspend התאים-ניתק טריפסין באופטימיזציה בינוני סרום מופחת בתוספת 2% FBS. התאם את צפיפות תאי 5 x 10 4 תאים לכל מיליליטר.
  2. 5,000 תאים סרטניים שכותרתו לוציפראז זרע ב100 μl מותאמים בינוני סרום מופחת המכיל 0.5% FBS בכל טוב של צלחת גם לבנה 96-שטוח תחתונה רקמות תרבות.
  3. 4 שעות לאחר זריעת התאים הסרטניים, להוסיף 1 x 10 5 נויטרופילים ב -50 μl מותאם בינוני סרום מופחת המכיל 0.5% FBS, ודגירת O / N. הכן השעיה תא נויטרופילים עם צפיפות של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. בארות בקרה צריכה לקבל 50 בינוניות μl ללא נויטרופילים. האםחזרות מרובות של כל הגדרה ניסיונית.
  4. בבוקר הבא, בעדינות לשאוב supernatant ולשטוף היטב עם כל 200 μl PBS. לשאוב PBS ולהוסיף 50 μl של חיץ תמוגה הפסיבי. לתאי ניתוק בקלות (כגון AT-3 תאים), לא לשטוף בPBS ולהוסיף למאגר תמוגה תרבית תאים מייד לאחר aspirating מדיום הגידול.
  5. מכסה את הצלחת בנייר אלומיניום ודגירה אותו על שייקר מסלולית ב 150 סל"ד במשך 20 דקות ב RT.
  6. מניחים את הצלחת בקורא צלחת הארה. הזרק 50-חכם גם פתרון assay בלוציפראז μl, ולקרוא את chemiluminescence במשך 10 שניות בכל טוב.
  7. לחשב את תמוגה גידול% על ידי הנוסחה הבאה: תמוגה גידול% = (1- [הארה של דגימות עם נויטרופילים] / [הארה של דגימות במדיום]) x 100%.

הערה: כדי להעריך את התרומה של נויטרופילים לזריעה גרורתי, נויטרופילים עשויים להיות מדולדלים כמתואר בפרוטוקול 8.1. לdepl היעילetion לנהל נוגדנים המדללים את נויטרופילים מתחילים ביום 7 engraftment הודעה גידולים.

פעילות 8. אנטי-גרורתי של נויטרופילים בסרטן שד עכבר דגם.

  1. בדלדול vivo של נויטרופילים.
    1. טרי להכין 12.5 מיקרוגרם של נוגדן אנטי Ly6G חולדה (נוגדן מדלדל נויטרופילים) או של נוגדן שליטת אלוטיפ חולדה (2a IgG, Κ) בתמיסת מלח בנפח סופי של כל עכבר 100 μl.
    2. החל ביום 3 engraftment הודעה גידולים להזריק יומי במינון intraperitoneal של נוגדן 12.5 מיקרוגרם עכברוש אנטי-Ly6G (100 μl). הזרק עכברי שליטה עם או 12.5 מיקרוגרם (100 μl) נוגדן שליטת אלוטיפ חולדה (2a IgG, Κ).
    3. החל ביום 14, לנהל את הנוגדנים פעמיים ביום, כקצב ייצור נויטרופילים מגדיל באופן דרמטי כאשר הגידול גדל 4T1.
    4. בכל יום אחר, להשיג דגימת דם (2-3 טיפות) על ידי שסחב את הזנב-הווריד לרוחב. לאסוף את הדם לתוך אנטיצינור -coagulant מכיל (הפרין, ציטראט או EDTA).
    5. ודא דלדול נויטרופילים באמצעות cytometry זרימה כפי שתואר בפרוטוקול 5.
  2. מבחן נטרול גידול (השתנה Winn Assay)
    1. לבודד נויטרופילים מעכברי נושאי גידול. לערבב 1 x 10 6 תאים סרטניים ו- 3 x 10 6 נויטרופילים מלוחים μl 50 (לכל עכבר).
    2. להזריק את התאים מתחת לעור לאגף של 6-8 שבועות עכברי BALB / ג נאיביים ישנים. לגלח את האגף לפני engraftment גידול לאפשר מדידות מדויקות של גודל גידול. למדוד התחלה יומית גודל גידול ביום 5 לאחר קליטתם.
  3. העברת המאמצת נויטרופילים
    1. להזריק 2 x 10 4 תאים סרטניים המבטא בלוציפראז ב200 μl PBS לוריד הזנב.
    2. העברת נויטרופילים יש לבצע 4 שעות לאחר הזרקת תאים סרטניים. לפיכך, להתחיל טיהור HDN מעכברי גידול נושאות (פרוטוקול 2.1) כ 2 שעות לפני מתוכנן שלהם בהעברת vivo. Resuspend נויטרופילים בPBS בריכוז סופי של 2.5 x 10 7 תאים / מיליליטר.
    3. 4 שעות לאחר החדרת תאי הגידול למקם את העכברים תחת מנורת חום במשך 5 דקות. מניחים את העכברים בעוצרים ולהזריק 5 x 10 6 HDN (200 μl) דרך וריד הזנב. עכברי בקרה מוזרקים עם רכב (PBS).
    4. צג ההיווצרות של גרורות ריאות בנקודות זמן שונות על ידי שימוש במערכת ההדמיה פליטת אור vivo או על ידי אימונוהיסטוכימיה.
  4. assay זריעה גרורתי ריאות
    1. הזרק 0.5-1 x 10 6 תאי 4T1 הורים orthotopically לתוך כרית שומן השמאל מפשעתי החלב כפי שתואר בפרוטוקול 1.
    2. ביום 10, resuspend 4T1 להביע תאים GFP בPBS בריכוז סופי של 5 x 10 5 תאים / מיליליטר. מניחים את העכברים תחת מנורת חום במשך 5 דקות.
    3. מניחים את העכברים בעוצרים ולהזריק 1x10 5 תאי 4T1 להביע GFP (200 μl) לוריד כדי 4T1 עכברי נושאי גידול או עכברים נאיביים.
    4. ביום הבא, להרדים את העכברים וינקבו ריאות עם 20 מיליליטר PBS להסיר RBCs שנותר.
    5. בלו הריאות לניתוח של תאי GFP חיובי על ידי אימונוהיסטוכימיה.
      הערה: כדי להעריך את התרומה של נויטרופילים לזריעה גרורתי, נויטרופילים עשויים להיות מדולדלים כמתואר בפרוטוקול 8.1. לדלדול יעיל לנהל נוגדנים המדללים את נויטרופילים מתחילים ביום 7 engraftment הודעה גידולים.

9. דיכוי של התפשטות תאי T על ידי נויטרופילים מעכברי נושאי גידול.

  1. הסר את הטחול מBALB / עכבר מורדמים נאיבי ג ומקום 10 מיליליטר PBS.
  2. מניחים את הטחול על מסננת תא 40 מיקרומטר שהוא בכושר על צלחת פטרי מלא בRPMI-1640. שימוש בסוף הבוכנה של המזרק, מועך את הטחול דרך תאי מסננת לתוך צלחת פטרי. יש לשטוף את מסננת התא עם RPMI 5 מיליליטר. מחק את המסננת.
  3. להעביר את תאי resuspended לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר וXG 400 צנטריפוגות במשך 10 דקות.
  4. בטל supernatant, וlyse אריתרוציטים ידי השעיית התאים לתוך 36 מיליליטר של מים טהורים למשך 20 שניות, ולהתאים לisotonicity ידי הוספת 4 מיליליטר של PBS מרוכז x 10. לחלופין, lyse אריתרוציטים ידי השעיית את התאים לתוך 5 מיליליטר של כדורית אדומה lysing חיץ (ACK), דגירה 5 דקות ב RT. לנטרל את ACK על ידי הוספת 10 מיליליטר של מדיום RPMI-1640. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT. Resuspend תאי 5 מיליליטר PBS ולספור את התאים.
  5. Resuspend splenocytes בPBS לצפיפות סופית של 4 × 10 7 תאים / 2 מיליליטר בשפופרת 15 מיליליטר. הוסף 2 מיליליטר של פתרון CFSE 2.5 מיקרומטר בPBS. במהירות להפוך את הצינור ודגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כאשר מדי פעם ערבוב (כל 2 דקות), מוגנות מפני אור.
  6. להרוות CFSE העודף על ידי הוספת 4 מיליליטר של FBS המחומם מראש (100%) ודגירת דקות 1 ב RT. הוסף 3 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10דקות.
  7. לשטוף את התאים עם 30 מיליליטר PBS, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות.
  8. סנן את התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר ולשטוף שוב עם PBS.
  9. Resuspend התאים בינוניים RPMI-1640 בתוספת 10% FBS לצפיפות סופית של 2 x 10 7 תאים / מיליליטר.
  10. זרע 2 x 10 6 / טוב (200 μl) בצלחת רקמות תרבות 24 גם.
  11. לעורר את התאים על ידי הוספת 1 מיקרוגרם של נוגדן אנטי העכבר CD3ε אוגר ארמני מטוהר ב500 μl RPMI-1640 עם 10% FBS.
  12. הוסף 2 x 10 6 HDN או LDN ב300 μl RPMI-1640 עם 10% FBS לsplenocytes כותרת CFSE, ודגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. ולס ללא נויטרופילים צריך לקבל 300 בינוני μl. נפח כולל של כל טוב צריך להיות 1 מיליליטר.
  13. לאסוף את התאים ולהכין אותם לcytometry זרימה. Resuspend תאי 100 μl FACS חיץ (פרוטוקול 5), ולהוסיף 10 μl של מגיב חסימת FCR. דגירה של 5 דקות על RT.
  14. הוסף 1 &# 956; L של נוגדן אנטי CD8α APC-מצומדות ודגירה במשך 15 דקות ב RT.
  15. לקבוע את עוצמת הקרינה CFSE על CD8 + T תאים על ידי cytometry זרימה (איור 5). עוצמת CFSE היא חצוי על כל חלוקת תא. לפיכך, מספר חלוקות תא ניתן לקבוע על ידי העצמה של מכתים CFSE.

10. נויטרופילים ההגירה Assay

  1. זרעי 5x10 5 4T1 תאים במ"ל 7 מותאמים בינוני סרום מופחת בתוספת 0.5% FBS בבקבוק תרבות 2 רקמה 25 סנטימטרים ודגירה 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  2. העבר את 800 μl של supernatant לתא התחתון של צלחת הגירה עם גודל נקבובית של 5 מיקרומטר.
  3. Resuspend 2 x 10 5 נויטרופילים ב400 μl של אופטימיזציה בינוני סרום מופחת בתוספת 0.5% FBS. החל ההשעיה התא לתא העליון ודגירה של 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  4. בסוף הדגירה, להסיר את התא העליון ולספור את מספר הנויטרופילים שהגרו לתא התחתון.

11. ניטור נויטרופילים ייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS).

  1. הכן 1.1 x 10 6 / מיליליטר נויטרופילים בתמיסת מלח המאוזן של האנק ללא פנול אדום. צלחת 180 μl המכיל 2 x 10 5 נויטרופילים בכל טוב של צלחת גם 96-שטוח תחתונה לבנה.
  2. מניחים את הצלחת בקורא צלחת הארה. הוסף 20 μl של פתרון לומינול 500 מיקרומטר ב PBS היטב כל אחד כדי לקבל ריכוז סופי של 50 מיקרומטר. קראו chemiluminescence הבסיס ל1sec במהלך זמן של 5 דקות עם 10 מרווחי שניות.
  3. הוסף ממריץ (למשל, PMA בריכוז של 10 ננומטר או 100 ננומטר או fMLP בריכוז של 10 מיקרומטר). הכן פתרון מרוכז 10x של כל סוכן בתמיסת מלח המאוזן של האנק ללא פנול האדום ולהוסיף 22 μl לבארות בהתאמה. בארות לשלוט להוסיף 22 רכב μl.
  4. Measuמחדש chemiluminescence בקורא הצלחת. לעשות את שניהם ארוכות (כל 10 שניות למשך 5 דקות) קצרות ו( כל דקה לשעה 1) כמובן זמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקר שנערך לאחרונה זיהינו פונקציה אנטי-גרורתי לנויטרופילים 6. נויטרופילים מעכברי נושאי גידול לרכוש פנוטיפ ציטוטוקסיות ויש לו את היכולת להרוג תאים סרטניים 6. זאת בניגוד לנויטרופילים מעכברים נאיביים שאין להם השפעה אנטי-סרטנית משמעותית 6. כמה מהטכניקות המתוארות בסעיף הפרוטוקול שימש ללימוד פונקצית נויטרופילים אנטי-סרטני במבחנת in vivo 6.

ניתן להשיג נויטרופילים ציט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

נויטרופילים הם הנפוצים ביותר של כל תאי הדם הלבנים ומגישי העזרה הראשונות במקרים של זיהום ודלקת. ככזה, הם רגישים מאוד לרמזים חיצוניים ומופעלים בקלות. בנוסף, יש לי נויטרופילים מחצית חיים קצרים מאוד ותחלופה מהירה. יחד, מאפיינים אלה מעלים מספר קשיים בעבודה עם נויטרופילים, כך שאסטרטגיות ניסיוניות ייחודיות נדרשות. לדוגמא, יש כמה אסטרטגיות טיהור נויטרופילים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות.

שלב קריטי בעבודה עם נויטרופילים הוא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ZG נתמך על ידי מענקים מתכנית I-CORE של הקרן הלאומית למדע (מס '41/11 גרנט), הקרן אביש-פרנקל, נאמנות Rosetrees, למלחמה בסרטן קרן המחקר (ICRF - מחקר פיתוח קריירה פרס) ו בסיס לדאגה. ZGF נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית לחקר הסרטן (ICRF - מחקר פיתוח קריירה פרס), מדען הראשי של משרד בריאות הישראלי וישראל איגוד הריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קווי
עכבר 4T1 תאי קרצינומה של השדADCCCRL-2539מדיום גידול: DMEM + 10% מומת חום FBS
PLASTIC WARES AND
24 בארות צלחת תרבית רקמות Falcon353047צלחת
תרבית רקמה סטרילית 100 מ"מ קורנינג430167סטרילי
25 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמותNunc156340צלחת
תרבית סטרילית 90 מ"מ בדרגת חיידקים מיניפלסט, עין שמר, ישראל20090-01-017
שפופרת צנטריפוגה חרוטית סטרילית 15 מ"ל מיניפלסט, עין שמר835015-40-111
צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי 50 מ"ל מיניפלסט, עין שמר, ישראל835050-21-111סטרילי
12 x 75 מ"מ צינור פוליסטירן עגול תחתון Becton Dickinson352058
צלחת נדידה סטרילית Millicell 24 בגודל נקבוביות של 5μ מ Merck MilliporePSMT010R1
צלחת באר לבנה סטרילית 96 עם תחתית שטוחה סטרילייםCostar3917
(40 מ"מ) BD Falcon352340סטרילי
20 גרם x 1.5 אינץ' מחטBD Microlance 3 301300סטרילית
23G x 1 אינץ' BD Microlance 4300800מחט סטרילית
25 גרם x 5/8 אינץ' BD Microlance 5300600סטרילי
0.3 מ"ל עם מחט 30 גרם x 8 מ"מBD Micro-Fine Plus Demi320829
סטרילי 9 מ"מ קליפס BD, AutoClip 427631
מגנט סטרילי EasySep STEMCELL Technologies18000
MACS עמודת הפרדה LS Miltenyi Biotech130-042-201
מגנט מפריד MidiMACSMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultiStandMiltenyi Biotech130-042-303
שקופית זכוכית מיקרוסקופ מנזל-גל&אומל; סר סופרפרוסט  בתוספת שייקר אורביטליJ1800AMNZ
 סקיי ליין, קורא צלחות ELMIS-3.02.10L
 TECANInfiniteF200Pro
אבקת
אלבומין בסרום בקר (BSA), שבר VSigmaA7906
Bromodeoxyuridine (BrdU) BD Pharmingen550891סטרילי
(5-(ו-6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)בדיקות מולקולריותC1157
Dextran T500Sigma31392
מלח נתרן הפרין מרירית המעי של חזיר SigmaH3149
נתרן אזיד (NaN3)SigmaS8032רעיל במיוחד, יש לטפל בזהירות
באבקת תיוגליקולאט Difco225650
Zymosan ASigmaZ4250
מדיה ותוספי מזון
מדיום הנשר המותאם (DMEM)SigmaD5796Opti-MEM
; הפחתתי את מדיום הסרום Life Technologies31985062
מכון הזיכרון הסטרילי רוזוול פארק (RPMI) -1640 בינוניסיגמאR8758
סרום בקר עוברי סטרילי (FBS),סיגמאF9665תעשיות
L-גלוטמין, בית העמק, ישראל03-020-1A
סטריליות נתרן פירובאט, בית העמק, ישראל03-042-1B
תמיסת סטרפטומיצין סטרילית פניצילין x 1000תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל03-031-5
תמיסת מלח סטרילית פוספט בופר (PBS) ללא Mg2+ ו-Ca2+ תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל02-023-1
PBS סטרילי x 10 ללא Ca2+ ו-Mg2+ תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל02-023-5Aסטריליים
בדרגת HPLC J.T. Baker4218-03פתרונות
ACK – אמוניום-כלוריד-אשלגןטכנולוגיות חיים A10492-01
תמיסת Bromodeoxyuridine (BrdU) (10 מ"ג/מ"ל) ב-PBSממיסים 10 מ"ג של BrdU ב-1 מ"ל PBS ובמסנן סטרילי.
CFSE, 5 מ"מ ב-DMSOממיסים 2.8 מ"ג CFSE ב-1 מ"ל DMSO. יש לחלק ל-10 מ"ל בשפופרות סטריליות של 200 מ"ל ולאחסן בחושך בטמפרטורה של -20oC.
תמיסת Eosin YSigmaHT110-2-32
תמיסת מלח מאוזנת של הנקסתעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל02-016-1Aסטרילי
, 20 מ"ג/מ"ל ב-PBSממיסים 100 מ"ג הפרין ב-5 מ"ל PBS סטרילי, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.
Histopaque-1119 סיגמא11191פילטר סטרילי דרך פילטר 0.2 מ"מ.
Histopaque-1077 סיגמא10771פילטר סטרילי דרך פילטר 0.2 מ"מ.
מאגר ליזה של תרבית תאי לוציפראז x5PromegaE153Aיש לדלל 1:5 במים סטריליים ממש לפני השימוש.
תמיסת בדיקת לוציפראזPromegaE1501מכיל אבקת מצע לבדיקת לוציפראז (E151A) ומאגר בדיקת לוציפראז (E152A)
תמיסת המטוקסילין של מאייר SigmaMHS-32
PBS + 0.5% BSAממיסים 2.5 גרם BSA ב-500 מ"ל PBS, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.
PBS + 1% BSAממיסים 1 גרם BSA ב-100 מ"ל PBS, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.
5x PBS עם 2.5% BSAממיסים 12.5 גרם BSA בתערובת של 250 מ"ל מים סטריליים בדרגת HPLC ו-250 מ"ל PBSx10, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.
PBS המכיל 0.5% BSA ו-2 מ"מ EDTAממיסים 250 מ"ג BSA ב-50 מ"ל PBS סטרילי ומוסיפים 200 מ"ל של 0.5M EDTA pH 8.0, מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.
מאגר FACS (PBS המכיל 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA ו-0.02% NaN3)יש להמיס 250 מ"ג BSA ב-50 מ"ל PBS  ולהוסיף 200 מ"ל של 0.5M EDTA pH 8.0 ו-500 מ"ל של 2% NaN3, מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.
תמיסת מלח (0.9% NaCl)ממיסים 9 גרם NaCl ב-1,000 מ"ל ddw,
NaCl 0.2%ממיסים 2 גרם NaCl ב-1,000 מ"ל ddw, תמיסת
NaCl 1.6%ממיסים 16 גרם NaCl ב-1,000 מ"ל ddw, אוטוקלאב
2% נתרן אזידממיסים 1 גרם נתרן אזיד ב-50 מ"ל ddw סטרילי, יש לשמור ב-4oC. רעיל מאוד.
3% תמיסת                                                                            ממיסים 3 גרם אבקת תיוגליקולט ב-100 מ"ל ddw.                                                                              מרתיחים עד שהתמיסה הופכת לצהובה וחיטוי.
תמיסה כחולה טריפאן (0.4%)SigmaT8154יש לדלל 1:10 ב-PBS כדי לקבל תמיסה של 0.04%.
תמיסת טריפסין B תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל03-046-1סטרילי
1 מ"ג/מ"ל Zymosan AResuspend 1 מ"ג Zymosan A ב-1 מ"ל PBS סטרילי בשפופרת Eppendorf. מערבולת נמרצת ודוגרת על הצינור בטמפרטורה של 37 oC למשך 30 דקות. אין לבצע חיטוי. הכן את התמיסה טרי לפני השימוש.
ערכות
ערכת בחירת EasySep PESTEMCELL Technologies18557
קוקטייל בחירת EasySep PE STEMCELL Technologies18151
ננו-חלקיקים מגנטיים EasySep STEMCELL Technologies18150
ערכת מיקרו-חרוזים לעכבר Anti-Ly6GMiltenyi Biotec130-092-332
ערכת העשרת נויטרופילים לעכבר EasySepSTEMCELL Technologies19762
ערכת העשרת נויטרופילים אנושייםEasySep STEMCELL Technologies19257
ערכת זרימה FITC BrdUBD Pharmingen 
ערכת בידוד נויטרופילים 559619 MACSMiltenyi Biotec130-097-658
ערכת בדיקת פגוציטוזיס חברת קיימן כימיקלים 500290
נוגדנים
נוגדנים חוסמי FCR Biolegend101302
נוגדן נגד Ly6G לחולדות מטוהרות BD Pharmingen 551459שיבוט 1A8
מצומד חולדה נגד עכבר נוגדן Ly6G Biolegend127608שיבוט 1A8
FITC מצומד חולדה אנטי עכבר Ly6GBD Pharmingen 551460שיבוט 1A8
PerCP-Cy5.5 חולדה נגד עכבר Ly6G TONBO Biosciences65-1276שיבוט 1A8
סגולFluor 450-מצומד חולדה נגד עכבר Ly6G TONBO Biosciences75-1276שיבוט 1A8
FITC מצומד חולדה נגד עכבר CD11bBD Pharmingen 553310שיבוט M1/70
מצומד עכברוש FITC נגד עכבר Ly-6G ו-Ly-6C (GR-1)BD Pharmingen 553127שיבוט RB6-8C5
PE-מצומד חולדה נגד עכבר CD45BD Pharmingen 553081שיבוט 30-F11
מצומד FITC חולדה נגד עכבר F4/80 Abcamab60343שיבוט BM8
FITC מצומד עכבר אנטי אנושי CD66b Biolegend305103Clone G10F5
נוגדן בקרת איזוטיפ חולדה מטוהר (IgG2a, k) BD Pharmingen 553927שיבוט R35-95
עלה מטוהר אוגר ארמני נגד עכבר CD3e נוגדןBioLegend100314שיבוט 145-2C11
תאיםEQUIPMENT בז מסננת תאים מחט מזרק סטרילי תרמו CFSE ® סטרילי של Dulbeccoביולוגיות סטריליות מומת בחוםתעשיות ביולוגיות מים חיטוי הפרין תמיסת אוטוקלאב אוטוקלאב תיוגליקולאט PE

מקורות

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613(2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524(2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.