תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; Ex Vivo</em

סיכום

במחקר זה, טכניקה מיקרוסקופית מפורטת של אור עברה אופטימיזציה לתצפית וניתוח בזמן אמת של התנועה של CPEC cilia ex vivo יחד עם שיטה מיקרוסקופית אלקטרונית לניתוח אולטרה-מבני.

תקציר

מקלעת הכורואיד ממוקמת בדופן החדר של המוח, שתפקידו העיקרי הוא ייצור נוזל מוחי שדרתי. תאי אפיתל מקלעת כורואיד (CPECs) המכסים את פני השטח של רקמת מקלעת הכורואיד מכילים מספר ריסים ייחודיים, אך רוב הפונקציות של ריסים אלה נותרו למחקר. כדי לחשוף את תפקודם של ריסי CPEC תוך התייחסות מיוחדת לתנועתיותם, פותחה מערכת תצפית ex vivo לניטור תנועתיות הריסים במהלך תקופות עובריות, סביב הלידה ואחרי הלידה. מקלעת הכורואיד נותחה מחדר המוח ונצפתה תחת מיקרוסקופ ניגודיות משופר וידאו המצויד באופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות. בתנאי זה, פותחה שיטה פשוטה וכמותית לניתוח הפרופילים הנעים של ריסי CPEC במשך מספר שעות ex vivo. לאחר מכן, השינויים המורפולוגיים של ריסים במהלך ההתפתחות נצפו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי להבהיר את הקשר בין הבשלות המורפולוגית של הריסים לתנועתיות. מעניין לציין ששיטה זו יכולה לתאר שינויים במספר ואורך הריסים, שהגיעו לשיא ביום שלאחר הלידה (P) 2, בעוד שתדירות הפעימות הגיעה למקסימום ב-P10, ואחריה הפסקה פתאומית ב-P14. טכניקות אלו יאפשרו הבהרת תפקודי הריסים ברקמות השונות. בעוד שטכניקות קשורות פורסמו בדוח קודם¹, המחקר הנוכחי מתמקד בטכניקות מפורטות להתבוננות בתנועתיות ובמורפולוגיה של CPEC cilia ex vivo.

מבוא

ריסים הם בליטות דמויות שיער על פני השטח של רוב תאי בעלי החוליות, שמשכו את תשומת הלב של חוקרים רפואיים בגלל סוג של מחלות הנקראות ריסים ^2-4. למרות הביטוי הנפוץ של האברון בכל מקום, דווח על מגוון רחב של תפקודים ריסניים, כולל תנועתיות וחישה ביולוגית. לדוגמא, ריסים תנועתיים על פני השטח הריריים מעבירים ריר⁵ ופסולת אפיתל ליציאת הדרך, ובכך מונעים מחלות על ידי ניקוי פני השטח של האפיתליה. יתר על כן, במהלך תקופות התפתחותיות מוקדמות ושלבי עובר, ריסים מווסתים את התפשטות תאי הגזע⁶, ומעורבים בקביעת אסימטריה שמאלה-ימין של גוף החולייתנים⁷.

תאי אפיתל מקלעת כורואיד (CPECs) הם נגזרות של תאים נוירו-אפיתל המכסים את פני השטח של רקמת מקלעת הכורואיד במוח, הממלאים תפקידים חשובים בשמירה על הומאוסטזיס של הסביבה התוך גולגולתית על ידי ייצור נוזל מוחי שדרתי (CSF). הוכח בעבר כי ל-CPECs יש מספר ריסים לא תנועתיים המווסתים את ייצור ה-CSF באמצעות קולטנים מצומדים לחלבון G המרוכזים במיוחד בריסים⁸. למרות שריסים אלה נחשבו לריסים שקטים ולא תנועתיים, התגלה שחלק מהריסים של CPEC מציגים תנועתיות חולפת במהלך תקופת היילוד¹. ממצא זה היה חשוב למדי מכיוון שהוא גילה כי מה שמכונה ריסים לא תנועתיים אינם בהכרח חסרי תנועה מתחילת ההתפתחות ועשויים להפגין תנועתיות חולפת במהלך חלונות זמן ספציפיים, אולי בתגובה לדרישות ותפקודים פיזיולוגיים ספציפיים⁹. כדי לתאר במדויק את האופי התנועה של ריסי CPEC, יש צורך לפתח מערכת תצפית ex vivo הכוללת ניתוח של הפרופילים הקינטיים הייחודיים לריסים של CPEC.

בכל הנוגע לתנועתיות, למרות שמספר דוחות טכניים תיארו תצפיות על הריסים הנעים של אפיתל קנה הנשימה^5,10, דגל חד-תאי נע¹¹, מה שנקרא ריסים נעותיים קונבנציונליים¹² וריסים צמתים¹³, שיטות אנליטיות מפורטות החלות על מבנים גליים יחסית כגון מקלעת הכורואיד לא תועדו היטב עד כה. יתר על כן, נדרשת רזולוציית זמן גבוהה כדי לנתח את התנועה הרירית של CPECs, שבהם מצלמות מהירות יקרות הן הכרחיות. כדי לעקוף את הצורך הזה ולפשט את ניטור התנועתיות הרירית של סוגי תאים שונים, הוצגה מצלמה בעלות נמוכה ומהירה,^ופותחה שיטה נגישה ונוחה לתיעוד התנועתיות של ריסים תנועתיים, במיוחד כדי לתאר את המהירות ואת דפוס התנועה של כל ריסים. יתר על כן, תוכנת ניתוח התמונות המקורית "TI Workbench" שימשה כאן כדי להקל על ניתוח מפורט של תנועתיות. באופן קולקטיבי, שיטה זו מספקת אסטרטגיה תמציתית חדשה לניתוח תנועה ריסנית יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מתאם (SEM), שניתן לאמץ במגוון רחב של מחקר סיליום.

פרוטוקול

הפרוטוקולים ושימוש בחיות ניסוי אושרו על ידי ועדות טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדיים באוניברסיטת של יאמאנאשי והאוניברסיטה ואסדה. טיפול בבעלי חיים בוצע בהתאם להנחיות מוסדיות.

1. הכנת CPEC

1. הכן את המנגנונים וחומרים הבאים: מיקרוסקופ סטריאו, מסוגל לשדר תאורה מלמטה רצוי; זוג המלקחיים שען (דומון # 3 או מס '4), מעוקר להבה, מספריים הפעלה ישר, מעוקר להבה; שתי מנות 10 סנטימטרים פלסטיק סטרילית המכילות 20 בינוני ליבוביץ L-15 מיליליטר קר כקרח; זכוכית תחתונה מנות 35 מ"מ המכילות 2 מיליליטר RT ליבוביץ בינונית L-15; כוס 100 מיליליטר המכילה 70% אתנול; גורי עכבר יילודים.
2. בקצרה לטבול עכבר בילוד באתנול 70% ולהרדים במהירות על ידי עריפת ראש באמצעות המספריים ההפעלה.
3. מניחים את הראש מייד במדיום ליבוביץ L-15 קר כקרח בdi 10 סנטימטרים סטריליsh.
4. הסר את העור ממִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת באמצעות זוג המלקחיים שען, לחתוך לפתוח את הגולגולת כדי לחשוף את המוח, ולאחר מכן לחתוך את עצבי גולגולת כדי לבודד את המוח כולו.
5. העבר את המוח למנה חדשה המכילה בינוני ליבוביץ L-15 קר כקרח ולהתבונן תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולוודא כי המוח הוא שקוע לחלוטין במדיום.
6. הגדר את היבט הגב של המוח פונה כלפי מעלה, ולכוון את המוח כך שנורות חוש הריח מתגוררות במיקום השעה שלוש (לאנשים בידיים הנכונים). החזק את המוח בעדינות עם המלקחיים ביד השמאל.
7. שימוש במלקחיים לנתיחה הקנס (דומון # 3 או מס '4) ביד ימין, חתך את כפיס המוח ומתחת parenchyma חיבור אונות המוח, לאורך בקע האורך של המוח הגדול.
8. דחף בעדינות את אונות המוח משם לצדדים לרוחב ולחשוף את סדק המוח הרוחבי.
9. הפרד את ההמיספרות על ידי צובט את הparenchyma דואר בין חצי הכדור והתלמוס.
10. משוך בעדינות את מקלעת דמית העין חדרית הרוחב שמחוברת לצד לרוחב של ההיפוקמפוס ידי affixa lamina.
11. העבר את מקלעת דמית העין המבודדת לצלחת הזכוכית תחתונה 35 מ"מ המכילה בינוני ליבוביץ L-15 טריים, וכיסוי במשקל (חומרי רשימה) בעדינות להחזיק את הרקמות במקום.

2. הדמית חיה של CPEC צילה

1. לאשר אולטרה סגול נכון (UV) ומסנן לחתוך להסיק (IR) (ים) כדי לחסום אור קצר יותר מ -400 ננומטר ועוד מ 700 ננומטר, ושצפיפות ניטראלית (ND) מסננים (25% ו -6%) מוכנס בנתיב האור של מיקרוסקופ ההפוכה.
2. התאם את המיקוד של העדשה האובייקטיבית בערך לפי העין, ולאחר מכן להתאים את הקבל כך שהמרכז והמוקד כדי להתאים את תאורת קוהלר. פריזמה הכנס התערבות ההפרש לעומת זאת מתאימה (DIC), אלמנט דסק"ש, כמו גם אלמנטי מנתח והמקטב בliדרך להילחם כדי להתאים אופטיקה דסק"ש.
3. כוון את הניגודיות של תצוגה על ידי עמדת פריזמה דסק"ש, כך שהמבנה של פני השטח הרקמה הוא מוכר ביותר. אם כל cilia של תאי המטרה הוא ניעתי, לא ניתן לקבל תצוגה ברורה של cilia ניע לפי העין בגלל התנועה שלהם.
4. לשנות את נתיב האור למצלמת וידאו, והסר את מסנני ND להגדיל את כוח האור.
5. השתמש במצלמה בהתמקדות מצב כדי להתאים את שדה הראייה והמיקוד. במהלך התמקדות, שבתמונות וידאו מוצגות בזמן אמת על המסך, תצוגה ברורה של cilia ניע אינה זמינה.
6. השתמש במצלמה ב 200 הרץ עם זמן חשיפה של 0.1 מילים-שני לתקופה הרצויה (שניות עד דקות). לאחר רכישת מחסנית התמונה, מסגרות בודדות יציגו מבני הריסים ברורים. אם קצות הריסים הם מטושטשים, להגדיל את מסגרת הדולר או להשתמש זמן חשיפה קצר יותר.
7. רשום את התנועה של cilia CPEC בתוך 25-60 דק 'לאחר המתת חסד בליבוביץL-15 בינוני.

3. ניתוח של ריסי Motion

1. ידני לעקוב אחר להכות דפוסים של כל cilium על צג המחשב. עמדות קצה ריסי מארק בכל מסגרת עם סמן העכבר, אשר התאסף למידע מסלול של כל cilium. או לנתח את מידע המסלול תוך שימוש באותה תוכנה או לייצא ליישומים כלליים יותר אחרים לניתוח נוסף. היעילות של צעד ניתוח זה מתואר בדיון.
2. לסווג את המסלולים לשני מצבים של תנועה, גב ו-ושוב או סיבובי, לפי העין.
3. לחשב את תדירות פעימות הריסים (CBF) באמצעות הנוסחא הבאה: [CBF = (מספר הפריימים לשניה) / (מספר הפריימים ממוצע לפעימה אחת)] ^14, שניתן להשיג מתרשים תנועת קצה הריסים (איור 3 ). חזור על חישוב זה למחזורי מכות הריסים מרובים, כי cilia האחר באותו התא יכול להפריע לתנועה של כל ciliuמ ', וכתוצאה מכך אי סדירות.
4. כדי לנתח את האחידות הזוויתית של ריסי מכות צירים בתוך תא בודד, להגדיר את זווית θ מכות לכל מסלול (איור 4). למסלולי גב ו-ושוב, שיתאים לעמדות של קצה הריסים לקו ישר, ולהגדיר θ כזווית הקו עושה עם x -axis. למסלולים סיבוביים, שיתאים לעמדות לאליפסה, ולהגדיר θ כמו זווית הציר המרכזי של האליפסה עושה עם x -axis. פרטים של ההולם מתוארים בסעיף נציגי תוצאות.
5. לתיאור כמותי של כל מסלול, לחשב AR יחס היבט הכללי. בקצרה, לסובב את המסלול על ידי - θ ולהגדיר AR כיחס בין הרוחב של ההפצה לאורך x - ו-axes y (איור 4). פרטים מוצגים בסעיף נציג תוצאות, והפרשנות, משמעות, וההגבלה של הפרמטר מתוארות בדיון.

לדוגמא הכנה 4. לSEM

הערה: SEM הוא שיטה חשובה להעריך את המצב של cilia על CPECs באופן מקיף. כדי להכין דגימות לSEM, הליך סטנדרטי שדווח בעבר ¹⁵ מועסקים בשינויים קלים.

1. לפני לנתח את הרקמה מהמוח, להכין מקבע בבקבוקון זכוכית 5 מיליליטר עם מכסה פוליאתילן. מקבע מורכב paraformaldehyde 2%, glutaraldehyde 2.5% (הפתרון של Karnovsky מחצית ¹⁶⁾ במאגר M 0.1 פוספט, pH 7.4.
2. לנתח את הרקמה מהמוח כמתואר בשלב 1.
3. בקצרה לשטוף את הרקמה המבודדת עם הפתרון של האנק המאוזן מלח (HBSS) בצלחת חדשה ולאחר מכן לתקן את הרקמות במקבעות בבקבוקון הזכוכית עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. השתמש טפטפות העברה חד פעמית ולטפל דגימות GEntly. לאחר השטיפה בHBSS, הרקמה הופכת דביקה.
   1. כדי להעביר את הדגימות לפתרון מקבע, לגרש לאט כמות קטנה של תמיסה המכילה רקמה מפיפטה ההעברה כטיפה ומוסיף למקבעים.
4. לאחר קיבוע, לבטל את מקבע ולשטוף את הרקמה עם חיץ פוספט שלוש פעמים.
5. לטבול את הרקמה בתמיסת סוכרוז 10% לשטוף את אלדהידים שנותרו. כדי להבטיח חיסול אלדהידים מלא, לטבול את הדגימות בפתרון עבור 10 דקות ולאחר מכן לחזור פעמיים עם סוכרוז 10% טריים. שלב זה חשוב כדי להשיג פוסט קיבעון-נכון בשלבים הבאים.
6. לטבול את הרקמה בתמיסה של 1% tetroxide אוסמיום בחיץ פוספט למשך 30 דקות ולאחר מכן למקם על קרח להודעה קיבעון. לשפוט את מידת osmification על ידי צבע המדגם: כאשר אלדהידים יוסרו לחלוטין, המדגם הוא שחור.
7. שטוף את דגימות רקמה קבועות פוסט נרחב עם distille הכפולכמה פעמים מים ד.
8. מייבש את הדגימות על ידי טבילה בריכוזים מדורגים של אתנול, בדרך כלל 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, ו -100%, במשך 10 דקות כל אחד. להשיג אתנול נטול מים על ידי הצבת הנפות מולקולריות ל99.5% אתנול מבקבוק חדש שרכש. חזור על התייבשות עם שלוש פעמים אתנול נטול מים.
9. מניחים את הדגימות המיובשים לתוך אצטט isoamyl, מגיב חילוף לייבוש נקודה קריטי, במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. מגיב זה מתאדה במהירות והמדגם יכול להיות יבש, וכתוצאה מכך הרס על ידי מתח פנים. לכן, לא לייבש את המדגם לחלוטין.
10. לאחר חילופי הסופיים של אצטט isoamyl, להסיר את רוב הממס, מייד לעטוף את בקבוקון הזכוכית הפתוח בנייר אלומיניום, ומניח את הבקבוקון על קרח יבש. באמצעות מחט או מלקחיים בסדר, לעשות כמה חורים בנייר הכסף המכסה את הפה של הבקבוקון, כך שנוזל פחמן דו חמצני זורם בקלות לתוך הבקבוקון במייבש הנקודה הקריטי. להמשיך לשלב הבאמהר ככל האפשר.
11. בשלב זה, למזער את שריד של אצטט isoamyl לתוך התא של מייבש, אבל אל תנתנו לי המדגם להתייבש לפני ייבוש נקודה קריטי לחלוטין. בנוסף, אל תשאיר את המדגם על קרח יבש לזמן ארוך שלא לצורך, כדי למנוע היווצרות של כפור על הבקבוקון.
12. העבר את בקבוקוני זכוכית עטוף בנייר האלומיניום המכילים דגימות הרקמה למייבש הנקודה הקריטית שמבטיח את המבנה של רקמות המשטח נותר בשלמותה בזמן שהכילו מים הסרת ברקמה. ניתן להשיג מידע מפורט על הפעלת מייבש הנקודה הקריטית מהוראות היצרן.
13. ידית הדגימות באמצעות זהירות קיסם כדי למזער את הנזק מכאני. דגימות רקמה מיובשות וכתוצאה מכך הן שבירות. הר הדגימות של ספחי מתכת ומעיל עם זהב-פלדיום באמצעות גמגום יון.

5. תצפית על ידי SEM

1. שים לב על ידי SEM ולהקליט תמונות עם מצלמה דיגיטליתמצויד למיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
2. העבר את נתוני תמונה דיגיטליים למחשב לניתוח.

תוצאות

סקירה של העבודה מוצגת באיור 1, כולל תמונות של המכשירים.

תצפיות תנועה חיים של CPECs

סרט 1 מציג סרט של CPECs מבודד מעכבר סביב הלידה, וסרט 2 מראה תצוגה מורחבת של התמונות בסרט 1. יש לציין כי טיפים הריסים בודדים הם פחות ברורים בתמונות סטילס בהשוואה לאלו בסרטים. איור 2

דיון

פרספקטיבות של שיטה זו

למרות שהטכניקה המתוארת כאן אינה מספקת ניתוח מפורט יותר של ריסים מאשר שיטות שפורסמו בעבר, את המשמעות של טכניקה זו מתגוררת בפשטות של המערכת ועלות האפקטיביות, אשר ניתן ליישם בקלות להקרנה בכל סוג של תנועתיות ריסי vivo לשעבר. בפרט, TI Workbench מספק ממשק פשוט וידידותי למשתמש המאפשר לחוקרים לבחון ולנתח תנועתיות הריסים בקלות רבה יותר. שיטות מעקב יעילות אוטומטיות לא פותחו עבור אובייקטי ניגו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים נדרשים<
אתנול	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
להכנת SEM
אתנול	Wako Chemicals	057-00456
תמיסת המלח המאוזנת של האנק	Life Technologies	14170112
פרפורמלדהיד	Merck	1040051000
glutaraldehyde	מסננת	17003-05
איזואמיל אצטט	נקלאי טסק	02710-95
מסננות מולקולריות 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	אתנול פוספט נטול מים
(PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
מאגר פוספט, 0.1 מ'			להכנת 100 מ"ל, מערבבים 19.0 מ"ל של 0.1  M NaH2PO4 ו-81.0 מ"ל של 0.1  M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
דיסודיום פוספט (נטול מים)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
אוסמיום טטרוקסיד	Nisshin EM	300
קרח
[header]
כלים וחומרים לדיסקציה
<חזק>הן להדמיה חיה והן להכנת SEM
	Olympus	SZX7
מגבת
Φ צלחת
מ 100 מ"ל
מספריים הפעלה ישרה	Sansyo	S-2B
מלקחיים שענים	Dumont	No.DU-3 או -4, INOX
<חזק>להדמיית תאים חיים
תחתונה	Matsunami Glass	D110300
<חזק>להכנת SEM
			אלמינום
בקבוקון זכוכית 5 מ"ל עם מכסה פוליאתילן	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
פיפטת העברה	Samco Scientific	SM251-1S	לקיסם
			להעברת דגימה
מקרטע יונים עם זהב-פלדיום	היטאצ'י	E-1030
מייבש נקודה קריטית	Hitachi	HCP-2
[header]
ציוד וחומרים מיקרוסקופיים
<חזק>להדמיית תאים חיים
	אולימפוס	IX81
100 W בית גוש כספית וספק כוח	אולימפוס	ניתן להשתמש במנורת כספית U-ULH ו-BH2-RFL-T3
100 W	מעבה Ushio	USH103D
DIC, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
ניתן להשתמש בתריס ידני		Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 ו-VMM-D1
מסנן פס פס (400-700  nm, Φ 45  מ"מ)	מסנן Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND (Φ 45 מ"מ)	אולימפוס	45ND6, 45ND25	שילוב של 25% ו-6% מסנני ND משמשים
עדשה אובייקטיבית (טבילה במים) עם אלמנט DIC	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 עם מצלמת וידאו מהירה IX-DPAO40
	Allied Vision Technologies	GE680	≥ קצב מסגרות של 200 הרץ וזמן חשיפה של 1 msec
תוכנה לרכישה/ניתוח תמונות	בתוכנת	TI Workbench	המסוגלת לרכוש בקצבי פריימים גבוהים.
מחשב לשליטה / ניתוח מצלמה	Apple	Mac Pro
שולחן בידוד רטט	Meiritsu Seiki	AD0806
משקל לרקמות	ערכות עיגון פרוסות	וורנר אינסטרומנטס	ניתן להכין אותו עם רשת ניילון מודבקת למעוך בצורת U Φ 0.5  חוט פלטינה מ"מ.
זכוכית כיסוי (משקל חלופי לרקמה)	מטסונאמי	עשוי לפי הזמנה	זכוכית כיסוי יכולה לשמש כמשקל רקמה.
<חזק>עבור SEM
מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס	IX81
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק	JEOL	JSM-6510

td colspan="4"><חזק>להדמיית תאים חיים להכנת מאגר יבש נייר שטוחהפלסטיק 10 ס" חזקה>זכוכית חזק> העברת דגימה הפוך .