מאמר שיטה

מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה ( Aeruginosa Microcystis) שימוש cytometry הזרימה

DOI:

10.3791/53036

⸱

29 בינואר 2016

 ,  , 
1Department of Life and Environmental Sciences, Faculty of Science and Technology, Bournemouth University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוכלוסיות חיידקים מכילות ההטרוגניות תא משמעותית, אשר יכול להכתיב התנהגות כוללת. ניתוח בדיקה מולקולרי באמצעות cytometry זרימה יכול לקבוע מדינות פיסיולוגיות של תאים, עם זאת היישום שלה משתנה בין מינים. מחקר זה מספק פרוטוקול לקבוע תמותת תאים בתוך אוכלוסיית cyanobacterium במדויק, בלי להמעיט או הקלטת תוצאות חיוביות שגויות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תת-אוכלוסיות חיידקים במחקרי שדה ומעבדה הוכחו להציג גבוהה ההטרוגניות בפרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים. קביעת המצב בזמן אמת של תא חיידקים חורג קטגוריות חיות או מתות, כחיידקים יכולים להתקיים במצב רדום, לפי חלוקת תאים ופעילות מטבולית מופחתות. בהתחשב בצורך באיתור וכימות של חיידקים, cytometry זרימה (FCM) עם בדיקות מולקולריות מספקת שיטה מהירה ומדויקת כדי לקבוע את הכדאיות אוכלוסייה כללית. באמצעות Sytox הירוק וSytox אורנג 'כבחוליות מודל Microcystis aeruginosa לזהות שלמות קרום, אנו מפתחים שיטה להעברה לאינדיקציה מהירה של תמותת תא בודדת. הבדיקות מולקולריות המשמשות בכתב עת זה תופנה לבדיקות חומצות גרעין ירוקות או כתומות כבהתאמה (אם כי יש מוצרים אחרים עם אורכי גל עירור ופליטה דומים שיש לי מצבים דומים כיצד תפעלn, אנו מתייחסים באופן ספציפי לקדמת הבמה ציינו בדיקות). פרוטוקולים באמצעות בדיקות מולקולריות להשתנות בין מינים, שונים בעיקר בזמני ריכוז ודגירה. בעקבות פרוטוקול זה יצא לM.aeruginosa הבדיקה חומצות גרעין הירוקה הייתה מותאמת בריכוזים של 0.5 מיקרומטר לאחר 30 דקות של דגירה והבדיקה הכתומה חומצות הגרעין במיקרומטר 1 לאחר 10 דקות. בשני ריכוזי הבדיקות פחות מאופטימלית האמור הוביל לתחת דיווח של תאים עם נזק קרום. לעומת זאת, 5 מיקרומטר ריכוזים וגבוהים בשתי הבדיקות הפגינו סוג של כתמים שאינם ספציפיים, לפיה תאים "חיים" המיוצרים על הקרינה יעד, שמוביל לייצוג יתר של מספרים סלולריים "שאינם בר-קיימא". הבקרות החיוביות (-נהרג חום) הניתנות ביומסה המתה הניתנת לבדיקה, אם כי ההתאמה של דור שליטה נשארת נושא לדיון. על ידי הוכחת רצף הגיוני של צעדים לייעול הבדיקות הירוקות וכתומות חומצות גרעין אנחנו דהmonstrate כיצד ליצור פרוטוקול שניתן להשתמש כדי לנתח מצב פיסיולוגי cyanobacterial ביעילות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התא הוא מערכת מורכבת, שמגיבה כל הזמן לסביבה על ידי שינוי פרמטרים פיסיולוגיים ולשנות את תפקודו. הדינמיקה של אוכלוסיות חיידקי אוכלוסיית isogenic הן בטבע והמעבדה מושפעות מההתפתחות של תת-אוכלוסיות, המתרחשת גם בתנאים סביבתיים קבועים יחסית 1 - 3. ההשתנות של קהילות חיידקים טבעיות מתעוררת בשל האופי משתנה מאוד של תנאים סביבתיים. תהליכים סטוכסטיים לפעמים אלה לאחר מכן לייצר תת-אוכלוסיות ששונות מאוד לממוצע האוכלוסייה. העדויות אחרונות גילו כי תת-אוכלוסיות הפיזיולוגיות אלה מגיבות באופן שונה לתנאי סביבה ויכולות לייצר תרכובות אות או מעכבים שלהשפיע באופן דרמטי ולהשפיע על 3,4 האוכלוסייה הכללית.

הקמת שיטה להגדיר ההטרוגניות באוכלוסייה היא מפתח להאו"םderstanding האקולוגיה של חיידקים בסביבות שונות וחיוני בעת בניית ידע של כחוליות מטרד, כגון Microcystis הרעיל, אשר משפיע במידה רבה על ביטחון מים אנושי. מין כגון Anabaena להציג ההטרוגניות מורפולוגיים בתגובה לתנודות סביבתיות, פיתוח תאים מיוחדים כמו heterocysts וakinetes 2. לעומת זאת, תאי Microcystis לא להציג ההטרוגניות מורפולוגיים ברורה בתגובה ללחץ. האפליה בין תאי קיימא ולא ברי-קיימא היא ההיבט החשוב ביותר של בידול פיסיולוגי ומאפשרת הבנה טובה יותר של דינמיקה של אוכלוסיות חיידקים. עם זאת, הבעיה הרעיונית של כדאיות חיידקים עצמו עדיין קשה ומאופיין 1,5,6 גרוע.

Cytometry זרימה (FCM) הוא שיטה אמינה ומהירה של ניתוח תאים בודדים. כדי להגביר את ההבנה של פיזיו תא הבודדמשעמם בFCM, בדיקות מולקולריות שימשו להבחין מספר חילוף החומרים והתהליכים ביוכימיים 7. זה הוביל לידע מוגבר של מינים ברמה תאית ואוכלוסייה בתורו עזר ניהול משאבי מים 8,9. עם זאת, אורגניזמים שונים במונחים של ספיגת בדיקה מולקולרית וזרימה בגלל הנקבוביות והמשאבות בקירות וקרומים תאיים, שהובילו למספר עיצוב בדיקה המולקולרי ויישום פרוטוקול 6,10,11. בדיקות מולקולריות זמינות למטרות מסחריות ומחקר לעתים קרובות מסופקות עם פרוטוקול גנרי אשר עשוי להיות רלוונטיות לסוג תאים שונה מאוד. אחד חייב להיות זהיר מאוד בהעברת פרוטוקולים שפותחו עבור סוג תא אחד עד 6 אחר, על כן משימה חיונית כדי לייעל את הבדיקות מולקולריות ביעילות לפני השימוש.

בדיקות חומצות גרעין הירוקות וכתומות להיקשר לשתי חומצות גרעין פעמיים התקועות ויחידות עם בסיס מינימאלי בחרivity ומשמש להעריך את שלמות קרום פלזמה של תאים. יש הבדיקה חומצות הגרעין הירוקה אות הקרינה תיוג התא השתפרה במידה ניכרת בהשוואה לבדיקות אחרות מולקולריות, כגון תרכובות המבוסס יודיד propidium 12, שיכול לשמש גם חיווי של כדאיות תא. "כדאיות התא" המונח כאן מניחה ששפלת DNA מתרחשת לאחר אובדן שלמות קרום פלזמה. בדיקות חומצות הגרעין הן צבעי cyanine סימטריים עם שלושה מטענים חיוביים ולא יכולות להיכנס לתאים וקרומים תחת ריכוזים מאופיינים, בשני 11,13 ופרוקריוטים 14,15 אורגניזמים האיקריוטים. הכריכה של בדיקה חומצת גרעין לחומצות גרעין יכולה לגרום לגידול של פי> 500 של פליטת הקרינה מאותות אנדוגני בתאים שיש להם שלמות הקרום בסכנה. למרות שבדיקות מולקולריות כגון הבדיקה חומצות גרעין הירוקה יכולות להיות אינדיקטור טוב של פיזיולוגיה של תא בודד, יש צורך לאo לייעל כל בדיקה עם אורגניזם המטרה המיועד, כפעמי דגירה שנעו בין 7 דק '- 30 דק' וטווחי ריכוז מ0.1 מיקרומטר - 0.5 מיקרומטר בניסויי Microcystis לבד 15-19.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לייעל את מבחני cytometric של ירוק ובדיקות החדשות יחסית כתומות חומצות הגרעין (שעד כה לא נבדקו על מיני cyanobacterial M.aeruginosa). מתודולוגיה המפותחת הבאה לאחר מכן ניתן להעביר למינים אחרים ומשמשת כפלטפורמה לייעול פרוטוקולים בבדיקות מולקולריות אחרות, ובכך להגדיל את ההבנה של חיידקים וההתנהגות האקולוגית שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה של החללית המולקולרית וcytometer הזרימה

  1. לדלל פתרונות מניות של בדיקות חומצות גרעין, אשר מסופקות כפתרון 5 מ"מ בdimethylsulfoxide (DMSO) לaliquots של ריכוזים הנדרשים בultrapure המסונן H 2 O.
  2. אחסן את בדיקות חומצות גרעין בתנאים חשוכים בין -5 מעלות צלזיוס ו-- 25 o C עד שימוש.
  3. הפעל את cytometer הזרימה וחבילת תוכנת עומס (ראה טבלה של חומרים / ציוד למפרטי FCM).
  4. מניחים צינור ריק haemolysis (12 x 75 מ"מ) בבדיקת הזרקת מדגם (SIP), לחץ על סתימה ולאחר מכן שטיפה כדי להתחיל את תהליך ניקוי FCM.
    הערה: חלק שלבים לדוגמה עבור SIP יכולים להכיל מספר סוגים של צינורות כוללים צינורות microcentrifuge. נוזל diluent הבדיקה והנדן המולקולרי המשמש במנגנון FCM הוא מכיתה אנליטיים "סוג 1" מקור מסונן 0.22 מיקרומטר קרום.
  5. מָקוֹםצינור haemolysis טרי עם 2 מיליליטר של H המסונן ultrapure 2 O על SIP, להגדיר מגבלת זמן עבור 10 - 15 דקות ומהירות fluidic לצום (או קצב זרימה של> 66 μl / min).
  6. בחר תא נתונים חדש, לשים על סף רלוונטי לקרינה וערוצי פיזור אור כדי להפחית את רעש רקע ולחץ על 'הפעלה'.
  7. אם האירועים הכולל לשנייה הם לא מתחת ההמלצה של היצרנים, ולאחר מכן להפעיל מדגם 2 מיליליטר של תמיסת חיטוי למשך 2 דקות במהירות ולאחר מכן חזור על השלבים 1.4 & 1.5.
    הערה: אנא בדוק ההמלצות של יצרנים לFCM הזנק ניקוי פרוטוקולים, כפי שהם יכולים להשתנות בין דגמים. בדיקות לסף מסוים גם צריכה להיות בקו אחד עם מודל FCM כחלק ציוד מאפשר למשתמש להפעיל את רווחי מתחים לצינורות מכפיל (PMTs) שיפור או ירידת האות החשמלי שנרשם מהגלאים האופטיים. מודל FCM משמש בהתנסות זוment יש קבוע PMTs מתח ומשמש סף של 80,000 פיזור אור קדימה (FSC-H) להוציא חלקיקים קטנים יותר מאשר 2.0 מיקרומטר ורעש אלקטרוני.

2. הכנת תרבויות וספירת תאים ראשונית

  1. 98 מיליליטר החיטוי של 2 O ו -2 מיליליטר ultrapure המסונן H של תקשורת אצות (ריכוז x50) בכוס 250 מיליליטר במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלסיוס
  2. מmonoculture הראשוני של M.aeruginosa (PCC 7806) במקום גבוה מצב יציב צפיפות 2 מיליליטר של המדגם לתוך צינור מתחת SIP. משורש כל הקמת מושבה על ידי vortexing או sonication 20 ולאשר תאים מפוזרים באופן שווה באמצעות מיקרוסקופ אור.
    הערה: חשיפה מוגזמת לגלים קוליים יכולה להוביל לתמוגה תא ויש להשתמש בזהירות. מאז sonication יכול להתמוטט שלפוחית ​​גז (כפי שנמצא במינים כמו M.aeruginosa) פלטים כגון פיזור צד אור (SSC-H) עוצמה יכולה להיות יותר sensitive.
  3. בתוך תוכנת FCM, בחר עלילת היסטוגרמה כדי להקליט נתונים מפיזור אור קדימה (FSC-H) ולהגדיר את מפרטי עלילה על ידי לחיצה על "יומן" כדי להציג בקנה מידת יומן על הציר.
  4. בפלט נפרד, בחר היסטוגרמה אחרת (יומן ציר) כדי להקליט הקרינה טבעית כגון phycocyanin אבזר פיגמנט הפוטוסינתזה (FL4-H, 675 ± 12.5 ננומטר), שנמצא בM.aeruginosa.
  5. השתמש במקור אור שיכול לרגש phycocyanin וגלאי שלסנן את הפליטות מהקרינה וכתוצאה מכך.
    הערה: פיגמנט פוטוסינתזה כמו כלורופיל יכול להיות נרגש עם הלייזר הכחול ננומטר 488 הנפוץ, ואילו phycocyanin הוא נרגש מעל 600 ננומטר ויזוהה רק עם מקור אור אדום 21. בדוק עם יצרן הזרימה cytometers למקורות אור העירור ואת הספקטרום של גלאי פליטה, כאן שני ננומטר 488 וליזר 640 ננומטר שימש יחד עםמסנן אופטי ננומטר 675 ± 12.5.
  6. להקלטה של ​​ההגדרות בחרו הרזולוציה הגבוהה ביותר הקרובות ביותר לגודל הליבה של האורגניזם היעד (10 מיקרומטר) וקצב זרימה איטי יחסית (14 μl / min).
    הערה: לדגימות הרזולוציה הטובות ביותר צריכה להיות מנוהלת על פי מייצר המלצה של אירועים בשניה.
  7. נתוני רכישה לפני להשתמש סף לשער מתוך פיזור אור ו / או אותות הקרינה הנגרמות על ידי רעש רקע אלקטרוני או מדגם פסולת תא.
  8. בחר תא נתונים חדש, ליצור עלילת צפיפות עם FSC-H ופרמטרי SSC-H בקנה מידת יומן ולחץ על הפעלה.
  9. אם צפיפות המדגם מובילה לשיעור אירוע מוגזם, צעדים שניתן לנקוט דילול כדי להגדיל את הדיוק ודיוק.
  10. על המגרש הצפיפות להחיל שערי תוכנה מהיסטוגרמה הקודמת להוציא אותות פיזור ברמה נמוכים, המיוצרים על ידי רעש רקע או פסולת (FSC <320,000). לעומת שער הקרינה היחסית גבוהה יותראותות phycocyanin מהתאים ולכלול רק את האירועים הללו (FL4, 56,000 - 1,950,000).
  11. השתמש במספר התאים שנרשמו באזורים המגודר ולחלק אותו על ידי הנפח הכולל של מדגם שעבר דרך FCM, לעבוד מתוך תאים כמה לכל מיליליטר.
    הערה: מודל FCM משמש כאן יש מערכת משאבת peristaltic המיקרו מבוקרת המאפשרת נפח דגימה שייקבע. ציוד FCM אחר עשוי לדרוש השעיה חרוז מכוילת או חישוב הבדלי 2 משקל O / נפח H לאמת מוחלט נפח דגימה.
  12. מוסיף את הנפח הנדרש של תאים לתקשורת מוכנה הטרי כדי להתחיל מחזור צמיחה אצווה (250,000 תאים / מיליליטר) של M.aeruginosa.
    הערה: מין יהיה שונה בשיעורי צמיחה בהתאם לפרמטרים שלהם באתר הסביבה וזמינות חומרי מזון, ולכן מחזור אצווה יש מוקלט מראש כדי לקבוע שלבי מחזור חיים.

3. Optimization של ספיגה המולקולרית של תא Probe

  1. מחצית יבול של תרבות M.aeruginosa מוכנה בשלב 2 משלב מעריכי ולהשתמש כביקורת "חי".
    הערה: דוגמאות מדוללות מתרבות צפיפות גבוהה ישר לשלב מעריכי עשויות להשפיע על תוצאות אופטימיזציה באמצעות התחלפות תאים מתים, בהשוואה לזה של תרבויות מחוסנת משלב פיגור / אינדוקציה ראשונית.
  2. הכן את החצי השני כביקורת "מת" על ידי שימוש בשיטות כגון אתנול 70%, דגימות חימום ב 60 מעלות צלסיוס במשך שעה 1, paraformaldehyde או פורמלין 4% למשך 30 דקות 6,11,22. בדקו וריאציות במייקרו-סביבת הדגימות (למשל., PH).
    הערה:, הביקורת החיובית, נהרג-החום 'המתה' בM.aeruginosa היא מכובדת ממדגם "חי" דרך ירידתו באותות phycocyanin. גרימת תמותה בשיטות אחרות לא תגרום לאותה התפוקה וvary במינים.
  3. הגדר את הדגימות מעורבות באמצעות יחסים שונים של "חי" ודגימות 'מתות' (לדוגמא, 0%, 25%, 50%, 100%).
  4. משורש הקמת מושבה על ידי vortexing או sonication ולבדוק pH.
  5. בחר לייזר 488 ננומטר צד גלאים שיכולים להקליט הקרינה מירוקה (FL1, 530 ± 15 ננומטר) וכתום (fl2, 585 ± 20 ננומטר) בדיקות חומצות גרעין וליזר 640 ננומטר להקליט אותות phycocyanin דרך הגלאים שלו בהתאמה.
    הערה: כאשר מחויב ל- DNA, יש הבדיקה חומצות גרעין הירוקה גל עירור הקרינה משוער של 504 ננומטר מקסימום ופליטה של 523 ננומטר, תוך הבדיקה חומצות גרעין הכתומה יש גל עירור של 547 ננומטר מקסימום והפליטה של 570 ננומטר. לייזר מצב מוצק יון ארגון 488 ננומטר יכול להיות מועסק על מנת לרגש את שני הבדיקות מולקולריות, לעומת זאת, לייזר ירוק (עד 547 ננומטר) יפיק הקרינה כתומה גבוהה יותר.
  6. כנקודת מוצא, להציגבדיקה מולקולרית עם יצרנים מומלצים ריכוז לתרבות 'המתה' 'החי' 50% ו- 50% ודגירה בחושך.
  7. בחר תא נתונים חדש, למקם את המדגם תחת SIP עם ספים וגורמים שיפחיתו רעשי רקע (FSC-H 80,000).
  8. צור עלילת צפיפות עם FSC-H ופרמטרי SSC-H, ושלוש היסטוגרמות. היסטוגרמה אחד באמצעות ערוץ בהתאמה הבדיקה מולקולרית גלאים אופטיים (FL1 או 2), אחד כדי לזהות את פליטת phycocyanin (FL4-H) וכל FSC-H האחר, בקנה מידת יומן.
  9. דגירה הדגימות של M.aeruginosa עם בדיקות חומצות גרעין בחושך עד 60 דקות, הקלטה בתאי נתונים נפרדים, במספר נקודות זמן (1, 5, 10, 15, 30 ו -60 דקות).
    הערה: כאשר התאמת פרמטרים כגון בדיקת pH עם מייצר לתגובות פוטנציאליות מכימיקלים מסוימים (לחומצות גרעין נבדקו בוחן חיץ לא יכול להכיל פוספטים או רמות גבוהות של חד ערכי או הדיווהקטיונים השאילו, כמחייב עם DNA יופחת).
  10. החל שער תוכנה לכלול את ההיסטוגרמה FSC-H (320,000 - 1,500,000) רק ליעד אורגניזמים גודל תא, להיסטוגרמה ערוץ בדיקה הקרינה בהתאמה.
    הערה: ריכוזי שימוש בפרוטוקול זה היו 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ו -100 מיקרומטר, אשר ניתן לשנות על ידי שני להגדיל או להקטין את עוצמת הקול של מדגם M.aeruginosa או פתרון מניות ראשוני של בדיקות גרעין.
  11. בערוץ הבדיקה הקרינה, יחול עוד שער תוכנה כולל לפסגה הגבוהה ביותר בהיסטוגרמה (FL1-H הירוק, 240,000 - 1,650,000, הכתום fl2-H, 30,000 - 165,000), ולאחר מכן השער שקרינת בדיקה חיובית לעלילת הצפיפות.
  12. הפעלת הצעדים 3.1-3.11 עם וכל דגימות 100% "חיים", 100% 'מתות' מעורבות התרבות, התאמת הריכוזים המולקולריים הבדיקה (למשל x 0.1 x 10 ל) ו / או טמפרטורה ורמות ה- pH במידת צורך.
  13. להשוות את מספר אותות הקרינה בדיקה המולקולרית חיוביים לצפיפות המקורית התא של תאים "מתים" (נלקחה ממחצית סך FSC-H או 100% תרבות 'מת') כדי למצוא את האחוז הכולל של תאים מוכתמים בחומצות הגרעין בדיקות.
  14. האם זה עבור כל תקופה בכל ריכוז כדי למצוא את הפרוטוקול האופטימלי לאחוז הגבוה ביותר של ספיגת בדיקה גרעין תא מבלי לייצר כתמים שאינם ספציפיים (להשתמש באמצעים בדרך אחת-ANOVA או ניתוח בכיוון אחד קרוסקל-ווליס של שונות, אם הנתונים אינם פרמטרי).

4. מולקולרי בדיקה הקרינה אפליה

  1. לבדיקה של הפרעות הקרינה / חפיפה ממכתים תא פנימי או שאינו ספציפי בחר את הנתונים "חיים" 50% ו -50% 'המתים' מעורבות התרבות ולקחת את כל השערים.
  2. החל שער תוכנה לכלול את ההיסטוגרמה FSC-H (320,000 - 1,500,000) רק ליעד אורגניזמים גודל תא, לphycocyaninהיסטוגרמה ערוץ.
  3. שער הפסגה הגבוהה ביותר phycocyanin ותווית כ" חי ", עם התוספת של השיא הנמוך ביותר שכותרתו" מת ".
  4. לבצע צעד שער נוסף לערוץ היסטוגרמה בהתאמה מולקולרי הקרינה בדיקה, באמצעות אחד בכל פעם, אותות phycocyanin 'המת' 'חי' ולאחר מכן (FL4), הקלטת שני אורכי גל ממוצעים.
    הערה: מצב גרימת תמותה בניסוי זה נעשתה על ידי טיפול בחום, שעל-פי פרוטוקול זה ברור יורד אותות phycocyanin. שיטות אחרות של אוכלוסיות ייצור של תאים 'מתים' עשויות להניב תפוקות שונות בריצות רכשו.
  5. יחס אורכי הגל הממוצע של הקרינה החיובית המולקולרית בדיקה ("המתה") והאות הפנימית / שאינו ספציפית ("החי") כדי לקבוע רגישות פרוטוקול.
    הערה: כדי לשפר את אפליית הקרינה של popul 'המת' 'חי' וations, להגדיל את מקור פחמן לספיגת כתם פעיל בתאים מזינים מדולדל או חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כדי לשפר את דופן תא חדירות ואותות הקרינה כתוצאה 6. פיצוי מוגבל בחלק מדגמי FCM לחפיפה ספקטרלית יכול להתבצע על ידי תיקון pairwise-מניפולציות משתמש במהלך רכישת מדגם (שינויי מתח PMT) או מתוכנה מיוחדת שלאחר אנליטיות.
  6. בחר את הפרוטוקול מותאם בי את הסכום הגבוה ביותר של תאים 'מתים' כבר מוכתם ללא הכתמת ההתרחשות שאינה ספציפית. אם יש לי מספר מבחן תוצאות דומות קיבלו את הפרוטוקול עם זמן הריכוז ודגירה הנמוך ביותר, יחד עם אפליית אות הקרינה טובה. מעקב מייצר הוראות להליך כיבוי cytometer.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיזור אור קדימה (FSC) ותפוקות צד פיזור אור (SSC) מתרבות אצווה M.aeruginosa בשלב מעריכי מספק מידע על גודל תא (קוטר) וגרעיניות פנימית בהתאמה (איור 1 א). FSC יכול להפלות תאים כי הם גדולים מדי ו / או קטנים להיות M.aeruginosa. אפליה או gating ניתן לעשות זאת על ידי נתונים זיקוק בין נקודות מסוימות של תפוקת FSC (איור 1 ג). Phycocyanin, חוקה עיקרית של מנגנון הפוטוסינתזה M.aeruginosa מייצרת אות חזק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המספרים מוגברים של פרסומים באמצעות בדיקות מולקולריות מציין שניתן להשיג נתונים אמינות ואינפורמטיבי 5,6,8 - 15,19,22,23. כמו של עוד אין כתם מושלם לכדאיויות תא שיכול להיות יעיל בכל המינים באותה עת ריכוז ודגירת 6,10. אפילו אותו הסוג של בדיקה עם פליטת הקרינה שינה מציג צורך בהקמה זמן ריכוז ודגירה הנכון (לוחות 1 ו -3). כפי שניתן לראות בעת השימוש בפרוטוקול זה, ריכוז ודגירת הזמן האופטימלי לבדיקת חומצת גרעין כתומה הוא 10 דקות במיק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להכיר דוקטורנט דייב הרטנל ואוניברסיטת בורנמות לתמיכה ומימון למחקר ומתקנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Cyanobacteria MediaSigma-AldrichC3061-500MLBG-11 תמיסה מרוכזת במים מתוקים (דילול x50)
נוזל טיהורBD Biosciences653155לפעול למשך 2 דקות כאשר התפוקות הן יותר מ-12 אירועים לשנייה במהירות או בקצב זרימה של 66 ומיקרו; ליטר/מינימום  לאחר מכן 2 דקות של נדן H2O.
ציטומטר זרימהBD Biosciencesלפי בקשהBD Accuri C6
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020כתם חומצת גרעין – תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSO
SYTOX OrangeLife TechnologiesS11368כתם חומצת גרעין – תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSO

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
  2. Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
  3. Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
  4. Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
  5. Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
  6. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
  7. Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
  8. Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
  9. Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
  10. Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
  11. Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
  13. Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
  14. Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
  15. Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
  16. Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
  17. Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
  18. Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
  19. Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
  20. Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
  21. Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).
  22. Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
  23. Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
  24. Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
  25. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
  26. Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
  27. Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
  28. Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Molecular ProbesSYTOX GreenSYTOX OrangeNucleic Acid ProbesFluorescence DetectionCyanobacterial Physiology

מאמרים קשורים