תפקוד חלבון לימוד ותפקיד ביטוי חלבון לשנות על ידי הפרעת נוגדן שחזור תלת ממדי

סיכום

שליטה בביטוי החלבון היא לא רק חיונית לכל אורגניזם חי, אלא גם אסטרטגיה חשובה לחקירת תפקודי חלבונים במודלים תאיים. הפרוטוקול שהוצג מראה את היישום של הפרעות נוגדנים בתאי יונקים כולל נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ומדגים את השימוש בשחזורים תלת מימדיים בחקר תפקוד החלבון.

תקציר

ניהול קפדני של ביטוי חלבון הוא לא רק חיוני כל אורגניזם חי, אלא גם אסטרטגיה חשובה לחקור פונקציות חלבון במודלים הסלולר. לכן, מחקר שנעשה לאחרונה המציא כלים שונים למקד ביטוי חלבון בשורות תא יונקים או אפילו במודלים של בעלי חיים, כולל RNA והפרעת נוגדן. בעוד האסטרטגיה הראשונה אסף תשומת לב רבה במהלך שני העשורים האחרונים, פפטידים בתיווך טרנסלוקציה של מטעני נוגדן פני ממברנות הסלולר לתאים, השיגו עניין הרבה פחות. בפרסום זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כיצד לנצל נשאית פפטיד בשם המרכבה בתאי כליה עובריים אנושיים כמו גם נוירונים בהיפוקמפוס העיקרי לבצע ניסויים התערבות נוגדן ובהמשך להדגים את יישום שחזורים תלת מימדי בניתוח תפקוד החלבון. הממצאים שלנו מראים כי המרכבה הוא, ככל הנראה בשל אות לוקליזציה הגרעין שלה, particularly היטב מתאים למקד חלבונים המתגוררים סומה הגרעין. למרבה הפלא, כאשר פונים מרכבה לתרבויות בהיפוקמפוס עיקרית, מגיב התברר להתקבל באופן מפתיע גם על ידי נוירונים ניתקו.

מבוא

פיקוח הדוק של ביטוי החלבון חיוני בכל אורגניזם חי לפקד פיתוח משלה, כמו גם להגיב לאותות סביבתיים. לפיכך, מספר רב של מנגנונים הומצא במהלך האבולוציה כדי לווסת את רמת הביטוי בדיוק של כל חלבון המקודד על ידי היישום. 20,000 גנים קיימים בכל תא אוקריוטים בכל זמן נתון של החיים שלה. המתרחשים בשלבים שונים של ייצור חלבונים, מנגנוני ויסות נעים מניהול מבנה הכרומטין, שעתוק RNA טיפול לכיוון שינויי חלבון posttranslational, תחבורה ושפלה.

לכן זה לא מפתיע כי תקלות מנגנונים מולקולריים שבבסיס ורמות ביטוי חלבון שינה נקשרו עם מחלות שונות כגון סרטן או מוגבל שכלי. ואכן, הסתכלות על המורכבות הבלתי המסולקות של התפתחות עצבית ואת תפקוד מוח יונק, Sensitivity של מערכות מתוחכמות אלו שינויים בביטוי חלבון מתבטא בגירעונות אינטלקטואלי כמה ידועים כולל אלצהיימר ומחלת פרקינסון (AD ו- PD) וכן הפרעות הספקטרום האוטיסטי (ASD) כמו תסמונת ה- X השביר (FXS). המחלה האחרונה מתאפיינת misexpression נרחב של מגוון של חלבונים, אשר בשל האובדן של חלבון מווסת תרגום יחיד, FMRP (חלבון ה- X שביר נפש הפיגור) ^1-4. יתר על כן, rearrangements כרומוזומליות המשפיע על התשלום משתנה x חלבון צמוד (VCXA), חלבון, מנהלת יציבות mRNA ותרגום ידי שינוי mRNA מכסת ^5, נקשר לאחרונה עם גירעונות רוחניים, ואילו מוטציות נקודתיות לא מזוהות בחולים בעלי מוגבלויות קוגניטיביות נכון לעכשיו ^{6, 7,} הדבר המצביע על כך הליקויים הנפשיים ציינו מקורן ביטוי VCXA שינה וביטוי dysregulated של prote היעד שלהins. בקנה אחד עם ממצאים אלה, כך עולים ממחקר החוקר האם דה נובו וריאציות מספר עותק של גנים הקשורים ASD נקבע כי כפילויות ומחיקות גן ברומן הן גורמות סיכון משמעותי עבור ⁸ ASD, ובכך תומכות ברעיון כי רמות ביטוי חלבון גבוהות או פחתה עלולות לגרום גירעונות רוחניים.

למרבה הפלא, המחקרים האחרונים ספקו עוד ראיות כי רמת הביטוי של חלבון נתון מותאמת בדיוק כדי למנוע הצבירה שלה וכתוצאה מכך כמויות חלבון גבוהות עם כמעט ללא שולי בטיחות ^9. לפיכך הוצע כי גם במרווחים קטנים הם מספיק כדי לגרום מחלות כמו אלצהיימר PD ^9. למרות המגוון של מנגנונים מולקולריים תורמים לשליטת חלבון ביטוי מרמז תכנית תקנה מורכבת לאור ממצאים אלה, כך עולים ממחקר חוקר את רמת הביטוי של למעלה מ -5,000 גנים יונקים ¹⁰ הוכיח כיהטבע העדיף תכנית חסכנית יותר: השפע של החלבונים הוצג להיות מוסדרת בעיקר ברמה של תרגום ^10, ובכך הממחיש שהנהלת זמינות RNA המשמשת בעיקר מכוונני ביטוי חלבון.

לימוד המנה של חלבונים בעלי עניין (POI) לכן זה לא חשוב רק על ההבנה של הפונקציות אנדוגני של חלבון, אלא גם כדי החקירה של מחלות רבות בפיתוח שיטות ריפוי. לפיכך, בעשורים האחרונים ראו התקדמות מספר אסטרטגיות באמצעות התערבות RNA לתמרן מינון POI. למרות התערבות RNA נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד לתפקד חלבון ואף מוחל בניסויים קליניים לטיפול במחלות סרטן או עינית וכן להמשיך טיפולים אנטי בחולים ^11-13, קשיים עלולים להתעורר אשר עלול להפוך את האסטרטגיה בלתי אפשרי. לדוגמא, רצף הזרע, אשר מניע את המציאה על ידי הומולוגיה הוא comparaקצר ble, ומכאן קידום השפעות חוץ-היעד. מאז רצפים יעילים ביותר הם נדירים צריכים להימצא בין אלף אפשרויות (הנסקרת ב ^14), זיהוי הרצף הנכון יכולים להיות זמן רב ויקר, אך תוצאות עדיין עשויות להיות מאכזבות.

אסטרטגיה חלופית היא למקד את נקודת העניין ישירות על ידי נוגדנים. כאן, אנו ממחישים את השימוש המרכבה נושאת חלבון (מתוצרת Active Motif) כדי להפחית זמינות חלבון הסלולר, ואת העסקתם של שחזורים תלת מימדי ללמוד תפקוד החלבון הבאים עקום למטה.

המוטיב הפעיל של מרכבה, עצם פפטיד 2.8 kDa, משמש פפטידים הסעות, חלבונים ונוגדנים פני ממברנות של תאי יונקים ^15. מקורבי פפטיד עם אתרים מעניינים על ידי יצירת מתחמי macromolecular מצמידים הלא קוולנטית ניצול אינטראקציות הידרופוביות, שבעקבותיה מתחמי המרכבה-POI הן הפנימו לתוך התאים בתוך ind-אנדוזוםבאופן ependent. חשוב לציין, המרכבה צוינה כדי לא להשפיע על הלוקליזציה התאית של חלבונים דלגו, ולא להפעיל השפעות ציטוטוקסיות או להשפיע על הפעילות הביולוגית של מטענה ^15.

פרוטוקול

1. פתרונות מניות

1. Resuspend אבקת המוטיב הפעיל lyophilized ב סטרילי H ₂ O לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / μl. הקש בזהירות לערבוב.
2. הכן aliquots קטן (למשל, 12 μl כל, 2 μl נדרשים לכל תגובה) ולאחסן אותם ב -20 ° C.

2. הכנת תאים

1. בתאי יונקים זרע כגון HEK293 תאים או נוירונים העיקרי על צלחת 24 היטב 500 μl מדיום הגידול כולל אנטיביוטיקה.
   הערה: בעת שימוש נוירונים, זרע התאים בצפיפות נמוכה ולהשתמש רק בשתי השורות באמצע 24 את הצלחת היטב. כל טוב תצטרך ובכך גרסה מקבילה ריק נמל המדיום במהלך הדגירה (שלב 4.2). בעת טיפול נוירונים, תמיד לוודא כי התאים אינם נשמרים מחוץ בחממה במשך יותר מכמה דקות.
2. תרבות התאים בתנאים מתאימים (humidified, 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס) עד התאים הם אפליקציה. 50%ומחוברות.
   הערה: בעת שימוש נוירונים, תרבות התאים עד לשלב ההתפתחותי הרצוי הוא הגיע ולשנות אפליקציה. 25-50% של המדיום פעמיים בשבוע. בינוני: בינוני Neurobasal (המכיל 1x B27, 5 מ"מ L- גלוטמין ו 1x פניצילין סטרפטומיצין, להשוות עם נ"צ 16).

3. גיבוש קומפלקס מרכבה

1. לכל תגובה, לדלל 0.1-2 מיקרוגרם של POI או הנוגדן המקביל כמו גם חלבון בקרה, או נוגדן שליטה, בהתאמה, ב 50 μl של PBS.
   הערה: הטכניקה פועלת גם עם מתחמי macromolecular המורכב נוגדנים מראש הנכנס יסודי ותיכון (cp 'נציג תוצאות', איור 1.). מערבבים ספין.
2. עבור כל דגימה, לדלל פתרון מניות 2 μl המרכבה ב 50 μl של PBS באמצעות צינורות נפרדים כדי למנוע אסוציאציה עצמית של המרכבה. מערבבים ספין.
3. מעבירים את POI מדולל או נוגדן (שלב 3.1) כדי דילול המרכבה ידי pipetטינג. מערבבים ספין.
4. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (מתחמי המרכבה-POI יהוו).

4. Transfection של תאים

1. לדלל את מתחמי המרכבה (שלב 3.4) ב 100 μl מחומם מראש מדיום הגידול (37 ° C, ללא תוספים). הסר בינוני לשטוף את התאים פעם באמצעות מחומם מראש 1x PBS.
   הערה: בעת שימוש נוירונים, לא כדאי לזרוק את המדיום, זה יהיה לעשות בה שימוש חוזר. שמור את זה על 37 מעלות צלזיוס. לרחצה, השתמש PBS המכיל 0.5 מ"מ MgCl ₂ ו CaCl _2.
   הצעה: לשמור המדיום בבארות ריקות בעוד דוגרי הצלחת (שלב 4.5).
2. החל הפתרון מורכב המרכבה (שלב 4.1) אל התאים לטלטל את התאים בעדינות כדי להבטיח חלוקה שווה של הפתרון. לגדל את התאים בתנאים סטנדרטיים (שלב 2.2) במשך שעה 1. להוסיף סרום לריכוז סופי של 10%. בעת שימוש נוירונים, להוסיף את המדיום בשלב 4.1. לגדל את התאים במשך 1 עד 2 שעות יותר.
   הערה:זמן דגירה אופטימלי תלוי בגודל ומאפיינים של המטען ועשוי צריך להיות מותאם באופן אמפירי. ההצעות הבאות עשויות לשמש כקו מנחה: לקבלת פפטידים, hr 1 הוא בדרך כלל מספיק עבור חלבונים 1-2 שעות מומלצות עבור נוגדנים 2 hr, ועבור transfection של נוירונים עם נוגדנים 4 שעות.
3. תאי תהליך לניתוח כרגיל. שים לב: הטכניקה היא תואמת ניסויים תוך שימוש בפרוטוקולי קיבעון וכן הדמיה לחיות.

הדמיה 5.

1. באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר, לקחת Z- ערימות של תאים ו / או תאים תאים של עניין באמצעות כ 0.25-0.5 מיקרומטר המרחק. מרחק השכבה המדויק תלוי בגודל של המבנה להיות משוחזרים ועליו להיקבע בנפרד.

6. שחזור

1. בשלבים הבאים, השתמש התחתון Esc כדי לעבור בין בחירה וניווט, CNTR כדי לבחור מספר אובייקטים על ידי לחיצה on אותם משמרת מפתח לחתוך אובייקטים (CP. צעד 6.10).
2. פתח את הקובץ-LSM ב Imaris.
3. באמצעות התאמת תצוגה לכל ערוץ, בניגוד לתמונה עד המבנים המבריקים להגיע רוויה. יש לציין כי התאמה זו לא תשפיע על בניית השטח, היא משמשת רק כדי לסייע למנהל הניסוי thresholding התמונה.
4. הקש על סמל הוספת משטחים חדשים. אשף יפתח.
5. בחר: מגזר רק אזור של עניין. המשך לשלב הבא.
6. להתאים את השוליים של תיבת הבחירה כדי להתאים מושא ההתעניינות שלך. נא לזכור שהתמונה יש 3 ממדים וכי הבחירה צריכה להיות מותאמת על מטוס z גם כן. אם הצורה המלבנית של תיבת הבחירה לא צריכה להתאים את מושא העניין כהלכה, כבה את האובייקט ו / או להגדיל את התיבה עד שכל המבנים הדרושים מוטבעים. אובייקטים לא רצויים ניתן להסיר בהמשך (CP. צעד 6.10). לְהִתְקַדֵם.
7. בחר את ch המתאיםannel. רמת הפירוט של שטח פנים או קוטר כדור צריך להיות מוגדר כדי להתאים את המבנים משוחזרים. בהתאם למאפייני האות, או אינטנסיביות מוחלטת או ניגודיות מקומיות יכולה לשמש. באופן כללי, ניגודיות מקומי עובד טוב יותר עבור אותות מפוזרים. בכל מקרה, את ההגדרות צריכות להיות מותאמות בנפרד עבור כל אות או מבנה של עניין, בהתאמה.
8. שימוש באפשרות קביעת ערכי הסף, לשחזר את המבנה של עניין.
9. השלם את השחזור על ידי לחיצה על החלק התחתון החץ הירוק.
10. התאם את האובייקט עוד יותר על ידי שימוש באפשרות העיפרון כדי לחתוך ולהסיר משטחים כנדרש. אפשר רק לחתוך בכיוון צפון-דרום, ולכן, הטו את התמונה על מנת לחתוך את האובייקט הרצוי.
11. להשיג מדידות של נפח, שטח ועוצמות לכל משטח ידי סטטיסטיקות בחירה, סטטיסטיקות מפורטות, וערכים ממוצעים.
12. (שלב אופציונלי) כדי להתבונן הסטטיסטיקה בצבעים (CP. 2E איור ו- F), בחרו את כרטיסיית הצבע של פני השטח המקבילים ולסמן 'סטטיסטיקה מקודדת' במקום 'המאגר'. מספר אפשרויות יוצג.

תוצאות

בפסקאות הבאות, תוצאות למופת ממחישות מציאה תפקודית של POI (Simiate, לפרטים נוספים ראו ^{16, 17)} באמצעות ריאגנט מרכבת הפרעת נוגדן מוצג. הממצאים מלמדים כי ביטוי פחתה של Simiate פוגע פעילות תעתיק, ו, בצורת מינון תלויה, גורם לאפופטוזיס, שהגיע לשיאה בשיעורי תמותה של מעל 99% אם כמויות נוגדנים גבוהות (> 1 מיקרוגרם נוגדן) מוחלות (תגליות אלה פורסמו בעבר ^16). הנה, עכשיו אנחנו מציגים את הטכניקות ופרוטוקולים מועסקים בפירוט יתר להדגים כיצד מרכבה מגיב...

דיון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המשמעות של רמות ביטוי חלבון בשליטת תפקודים תאיים באופן מונע מינון. הפרוטוקול המתואר מאפשר מניפולציה מכוילת של ביטוי חלבון סוגי תאים יונקים שונים, כוללים נוירונים בהיפוקמפוס, ומכאן להקל מחקרים מפורטים של תפקוד חלבון ברמה התאית.

למרות התערבות RNA מייצגת אסטרטגיה ידועה למטה להסדיר אתרים מעניינים, יש בה החסרונות שלה (CP. ^14). לא רק זיהוי של רצף מסוים מאוד ויעיל יכול להיות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חנות Chariot	Active Motif	30025	ב-20 מעלות; C
טכנולוגיות חיים בינוניות נוירובזאליות		21103-049	מתחממות עד 37 מעלות; C לפני השימוש בטכנולוגיות
1x B27	Life	17504044	לאחסן ב-20 מעלות; C
L-גלוטמין	Life Technologies	25030-149	חנות ב-20 מעלות; C
פניצילין וסטרפטומיצין	טכנולוגיות חיים	15140-122	חנות ב -20 & deg; C
Imaris תוכנה	Bitplane	n.a.יקר	, אך ללא תחרות
מיקרוסקופ סריקת לייזר	Zeiss	n.a.