קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב

סיכום

יצירת מיקרו-רקמות פונקציונליות בתוך מכשירים מיקרופלואידיים דורשת ייצוב של פנוטיפים של תאים על ידי התאמת טכניקות תרבית תאים מסורתיות לממדים המרחביים המוגבלים במיקרו-מכשירים. שינוי הקולגן מאפשר שקיעה שכבה אחר שכבה של מכלולי קולגן דקים במיוחד שיכולים לייצב תאים ראשוניים, כגון הפטוציטים, כמודלים של רקמות מיקרופלואידיות.

תקציר

למרות שמיקרופלואידיקה מספקת שליטה מעולה במיקרו-סביבה התאית, ניתן challenging. 3D תרבית תאים בתוך מכשירים מיקרופלואידיים מסייעת לייצב את המורפולוגיה והתפקוד של התאים, מה שהכרחי ליצירת מודלים של רקמות מיקרופלואידיות במיקרו-מכשירים. תרגום טכניקות תרבית תלת מימד מסורתיות עבור לוחות תרבית רקמות למכשירים מיקרופלואידיים הוא לרוב קשה בגלל ממדי הערוץ המוגבלים. בשיטה זו, אנו מתארים טכניקה לשינוי קולגן מקורי מסוג I ליצירת תמיסות קולגן פוליקטיוניות ופוליאניוניות שניתן להשתמש בהן עם תצהיר שכבה אחר שכבה ליצירת מכלולי קולגן דקים במיוחד על גבי תאים שגודלו במכשירים מיקרופלואידיים. שכבות הקולגן הדקות הללו מייצבות את המורפולוגיה והתפקוד של התא, כפי שמוצג באמצעות הפטוציטים ראשוניים כתא לדוגמה, מה שמאפשר תרבית ארוכת טווח של מיקרו-רקמות במכשירים מיקרופלואידיים.

מבוא

למרות שמיקרופלואידיקה מאפשרת שליטה מעולה במיקרו-סביבה התאית, תרבית תאים, במיוחד תאים ראשוניים, בתוך מכשירים מיקרופלואידיים יכולה להיות מאתגרת. טכניקות תרבית תאים מסורתיות רבות פותחו כדי לקיים ולייצב את תפקוד התא בתרבית בצלחות תרבית רקמה, אך לעתים קרובות קשה לתרגם טכניקות אלה למכשירים מיקרופלואידיים.

טכניקה אחת כזו היא תרבית תאים על ג'ל קולגן או דחוס ביניהם כמודל של סביבת התא התלת-ממדית הפיזיולוגית. ¹ קולגן סוג I הוא אחד החלבונים הנפוצים ביותר ליישומי ביו-חומרים בגלל הימצאותו בכל מקום במטריצה חוץ-תאית, שפע טבעי, אתרי הצמדה חזקים לתאים ותאימות ביולוגית. ² תאים רבים מפיקים תועלת מתרבית תלת-ממדית עם קולגן, כולל תאי סרטן^3,45, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים⁶ והפטוציטים⁷, בין היתר. בעוד שהשימוש בג'ל קולגן קל בפורמטים פתוחים, כגון לוחות תרבית רקמות, מידות התעלה המוגבלות והאופי הסגור של מכשירים מיקרופלואידיים הופכים את השימוש בנוזלים שהופכים את הג'ל לבלתי מעשי מבלי לחסום את כל הערוץ.

כדי להתגבר על בעיה זו, שילבנו את טכניקת השיקוע שכבה^{אחר שכבה 8} עם שינויים כימיים של תמיסות קולגן מקוריות ליצירת מכלולי קולגן דקים במיוחד על גבי תאים שגודלו במכשירים מיקרופלואידיים. שכבות אלו יכולות לייצב את המורפולוגיה של התאים ולתפקד בדומה לג'ל קולגן וניתן להפקיד אותן על תאים במכשירים מיקרופלואידיים מבלי לחסום את התעלות עם מטריצה פולימרית. מטרת שיטה זו היא לשנות קולגן מקומי ליצירת תמיסות קולגן פוליקטיוניות ופוליאניוניות ולייצב תאים בתרבית מיקרופלואידית על ידי הפקדת מכלולי מטריצת קולגן דקים על התאים. טכניקה זו שימשה לייצוב המורפולוגיה והתפקוד של הפטוציטים ראשוניים במכשירים מיקרופלואידיים. ⁹

למרות שדווח בעבר על שקיעה שכבה אחר שכבה עם פוליאלקטרוליטים טבעיים וסינתטיים¹⁰ לכיסוי הפטוציטים בתרבית צלחות^11,12 וכשכבת זריעה להפטוציטים במכשירים מיקרופלואידיים^13,14, שיטה זו מתארת שקיעה של שכבת קולגן טהורה על גבי הפטוציטים, המחקה את טכניקות תרבית הקולגן התלת מימדיות. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בהפטוציטים כתאים לדוגמה שניתן לתחזק באמצעות שכבות קולגן תלת מימדיות. גם סוגי התאים הרבים האחרים שיכולים להפיק תועלת מתרבית תלת-ממדית בקולגן עשויים להפיק תועלת מתרבית לאחר שקיעה שכבה אחר שכבה של מטריצת קולגן דקה במיוחד.

פרוטוקול

1. הכנת הפתרון המקומי מסיס קולגן

1. הכן או לרכוש 200 מ"ג של acidified, מסיס, סוג אני קולגן מזנבות עכברים ב1-3 מ"ג / מיליליטר באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים בידוד, כגון שדווח על ידי et al Piez. ¹⁵
2. קנה מידה של כמות חומר מוצא מבוסס על רצוי סוף הנפח של פתרונות קולגן שונה. כ לעשות 25-30 מיליליטר של מפוגל ו25-30 מיליליטר של פתרונות קולגן succinylated, כל 3 מ"ג / מיליליטר, 200 מ"ג משל קולגן ילידים המסיס.

2. מתילציה קולגן

1. לדלל של הפתרון המקומי, acidified (pH 2-3) קולגן 100 מ"ג לריכוז של 0.5 מ"ג / מיליליטר עם מים סטריליים קרים כקרח ולשמור על הפתרון על קרח כדי למנוע gelation.
2. התאם את ה- pH של תמיסת קולגן ל9-10 עם כמה טיפות של 1 N NaOH ומערבבים על RT למשך 30 דקות. שים לב למשקע קולגן, גורם פתרון להפך מעונן.
3. ספין למטה פתרון קולגן זירז ב3,000 × גרם במשך 25 דקות. משקע ברור, כמו ג'ל צריך להיות גלוי בחלק התחתון של הצינורות. לשאוב והשלכה נכונה של נוזל supernatant.
4. Resuspend קולגן זירז ב200 מיליליטר של מתנול עם 0.1 N HCl ולאפשר תגובת מתילציה להתרחש עם ערבוב על RT במשך 4 ימים. קולגן לא לפזר, אבל צריך להתפרק לחתיכות קטנות מאוד גלויות שיהפוך את פתרון מעונן.
5. לאחר מתילציה, צנטריפוגה הפתרון ב3,000 × גרם במשך 25 דקות עד גלולה קולגן מפוגל. לשאוב ולהיפטר supernatant מתנול acidified.
6. ממיסים את קולגן מפוגל ב 25 מיליליטר של PBS סטרילי, נותן ריכוז של כ 3 מ"ג / מיליליטר, עם pipetting החוזר והנשנה, ולסנן את הפתרון דרך מסננת תא 60 מיקרומטר. התאם את ה- pH של הפתרון ל7.3-7.4 באמצעות 20 μl מרווחים של 1 N NaOH.
7. להעריך את concentration של הפתרון באמצעות ערכת ELISA קולגן העכברוש המסחרי או ערכת assay hydroxyproline. לדלל את הפתרון עד 3 מ"ג / מיליליטר עם PBS סטרילי.
8. לעקר את פתרון קולגן מפוגל על ​​ידי העברתו לבקבוק זכוכית עם מכסה בורג, שכבות בזהירות 3 מיליליטר של כלורופורם בתחתית הבקבוק, לאפשר את הבקבוק להגדיר O / N ב 4 ° C, ולאחר מכן להסיר את הסביבה נקיה מחיידקים ולאחסן שכבה עליונה, שהוא קולגן מפוגל.
9. אחסן את הפתרון ב- C ° 4 לשימוש בתוך 1 חודש.

3. קולגן Succinylation

1. לדלל של הפתרון המקומי, acidified (pH 2-3) קולגן 100 מ"ג האחר לריכוז של 0.5 מ"ג / מיליליטר עם מים סטריליים קרים כקרח ולשמור על הפתרון על קרח כדי למנוע gelation.
2. התאם את ה- pH של תמיסת קולגן ל9-10 עם כמה טיפות של 1 N NaOH ומערבבים על RT למשך 30 דקות. קולגן צריך לזרז, גורם פתרון להפך מעונן.
3. Dissolve 40 מ"ג של sucאנהידריד cinic (0.4 מ"ג לכל מ"ג של קולגן) ב 10 מיליליטר של אצטון (1/20 ^ה הנפח של פתרון קולגן). לאט לאט (בכ 0.5 מיליליטר במרווחים) להוסיף את תערובת לפתרון קולגן עם ערבוב תוך מעקב pH ברציפות. לשמור על pH מעל 9.0 על ידי הוספת טיפות 1 או 2 של 1 N NaOH כpH 9.0 גישות.
4. ממשיך לבחוש בRT עבור 120 דקות לאחר הוספת כל אנהידריד succinic באצטון. שים לב לפתרון ליתברר כקולגן succinylated מתמוסס. מעת לעת לבדוק את ה- pH כדי להבטיח שהיא נשארת מעל 9.0.
5. התאם את ה- pH של התמיסה עד 4.0 עם 20 מרווחי μl של 1 N HCl. שים לב לפתרון מעונן שוב, כמו קולגן succinylated משקעים.
6. לאחר succinylation, צנטריפוגה הפתרון ב3,000 × גרם במשך 25 דקות עד גלולה קולגן succinylated. לשאוב ולהיפטר supernatant acidified עם אנהידריד succinic unreacted.
7. ממס את קולגן succinylatedב 25 מיליליטר של PBS סטרילי, נותן ריכוז של כ 3 מ"ג / מיליליטר, עם pipetting החוזר והנשנה, ולסנן את הפתרון דרך מסננת תא 60 מיקרומטר. התאם את ה- pH של הפתרון ל7.3-7.4 באמצעות 20 μl מרווחים של 1 N NaOH.
8. להעריך את הריכוז של הפתרון באמצעות ערכת ELISA עכברוש קולגן מסחרי או ערכת assay hydroxyproline. לדלל את הפתרון עד 3 מ"ג / מיליליטר עם PBS סטרילי.
9. לעקר את פתרון קולגן succinylated על ידי העברתו לבקבוק זכוכית עם מכסה בורג, שכבות בזהירות 3 מיליליטר של כלורופורם בתחתית הבקבוק, לאפשר את הבקבוק להגדיר O / N ב 4 ° C, ולאחר מכן להסיר את הסביבה נקיה מחיידקים ולאחסן שכבה עליונה, שהוא קולגן succinylated.
10. אחסן את הפתרון ב- C ° 4 לשימוש בתוך 1 חודש.

4. אימות של שינויי קולגן

1. הכן 1 מיליליטר דגימות מכל אחת מפתרוני קולגן ילידים, מפוגלים, וsuccinylated ולדלל לקונצרט כלשהוentration של 0.1 מ"ג / מיליליטר עם מים טהורים סטרילי לטיטרציה יון מימן. בהמשך לדלל החיץ לפחות 1,000 פי ידי דיאליזה נגד מים באמצעות 10 הפסקת membraneusing 3 שינויי פתרון kDa לפחות 4 שעות כל אחד.
2. התאם את ה- pH של הפתרונות ל7.3 עם כמויות קטנות של NaOH וHCl. באמצעות pH 7.3 כהתייחסות שרירותית, לבצע טיטרציה יון מימן על כל אחד מהדגימות כפי שתואר על ידי Tanford ¹⁶ כדי ליצור עקומות טיטרציה לפתרונות קולגן ילידים, מפוגלים, וsuccinylated.
3. עלילה השינוי ברמת חומציות לכל נפח של חומצה הוסיף לעומת המספר של H ⁺ יונים לכל מולקולה הקשורה. טווח "האמין" pH הגבוה צריך להראות שינוי בקולגן succinylated לעבר הנקודה הניטרלית (הפסד של קבוצות האמינים), והמגוון "carboxyl" pH הנמוך צריך להראות משמרת שמאלה בקולגן מפוגל (הפסד של קבוצות carboxyl ) ותזוזה ימינה בקולגן succinylated (רווח בקבוצת carboxylים), בהשוואה לקולגן הטבעי.
4. להעריך את היעילות של תגובת succinylation ידי קביעת% מקבוצות אמינו בקולגן הילידים הוחלף על ידי succinylation בשיטת חומצת 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic (TNBA) colorimetric, הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים ^17,18.

5. ייצור של מכשירי microfluidic וזריעת תאים

1. לפברק מכשירי microfluidic תוך שימוש בשיטות סטנדרטית ^9. השתמש בדפוס העתק של PDMS מSU-8 מאסטרים על סיליקון המוגדר באמצעות photolithography ליצור תאי תרבית תאי microfluidic עם 100 מיקרומטר גבוה, רחב .4-1.5 מ"מ, ו1-10 מ"מ ערוצים ארוכים לצמיחת תאים.
2. השתמש בשואב פלזמה לחמצן את המשטחים של המכשיר ושקופיות זכוכית, ולאחר מכן לחץ יחד כדי אג"ח. לאחר חיטוי המכשיר על ידי חשיפה לאור UV במשך לפחות 30 דקות, למלא את התא עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS סטרילי ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
3. זרעי המכשיר עם תאים, כגון חולדה ראשונית או hepatocytes אדם, אשר דורשים ג'ל קולגן לייצוב של פנוטיפ או מדינת בידול. אנו משתמשים 20 μl של hepatocytes מבודד טרי עכברוש עיקרי ^7,19 או hepatocytes האנושי הראשוני cryopreserved זמין מסחרי זרע בגיל 14 × 10 ⁶ תאים / מיליליטר למכשיר.
4. אפשר התאים לצרף במשך 4-6 שעות, ולאחר מכן לשטוף את התאים פנויים ולהחליף את התקשורת עם ציפוי תקשורת צמיחה. דגירה O / N כדי להבטיח תא מלא מתפשט וליצור monolayer ומחוברות של תאים.

6. שכבה אחר שכבה קולגן הפקדת

1. בשכונת תרביות רקמת זרימה למינרית, להכין כמויות מספיקות של פתרונות קולגן מפוגלים וsuccinylated במשך 10 יישומים של כל פתרון לכל מכשיר, כמו גם כמה MLS של תקשורת. שמור את הפתרונות על קרח. אנו משתמשים 20 μl (10-15 פעמים בסך הכל מכשיר נפח) של קולגן לכל שכבה לכל מכשיר.
2. להיותginning עם הפתרון מפוגל (polycationic), חלופי שטיפת המכשירים עם 20 μl של מפוגל ולאחר מכן succinylated פתרונות קולגן, מחכה דק '1 בין כל יישום. לשטוף את המכשיר בסך הכל 10 פעמים בפתרון, שאמורה לקחת כ -20 דקות. לעבוד במהירות כדי לצמצם את כמות הזמן שהתאים ללא תקשורת.
3. שים לב קולגן לצבור לאט בכניסה / היציאה בהתאם לגודלה. אם ההתנגדות לזרימת נוזל עליות, לשטוף את המכשיר פעם או פעמיים עם תקשורת, ולאחר מכן להמשיך שכבות.
4. לאחר החלת כל השכבות, לשטוף את המכשיר פעמיים עם תקשורת טרי ולחזור לחממה. בהתאם לסוג התא, השינויים תאיים הנגרמת המטריצה ​​מורפולוגיים, כמו קיטוב משופר בhepatocytes, צריכים להיות גלויים בתוך כמה שעות.
5. הכן מכשירי נציג למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים באמצעות שיטות סטנדרטי ⁹ כדי לאמת את הנוכחות של מטריצת קולגןהרכבה על גבי התאים בתרבית.

7. ייצוב של הפנוטיפ תא ותפקוד

1. תמונת מורפולוגיה תא, כדאיות, וקוטביות בשיטות סטנדרטית לסוג התא. לhepatocytes, לאסוף תמונות מעל 14 ימים באמצעות מיקרוסקופ שלב, מכתים חי / מת כדאיות, וצבע CMFDA לקיטוב הפסגה כדי להדגים את ההשפעות של תצהיר קולגן.
2. למורפולוגיה תא, לשטוף את המכשיר דרך הכניסה על ידי פיפטה עם 20 μl של PBS לשטוף, להזריק 20 μl של PBS, ותמונת המכשיר באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב.
3. עבור מכתים חי / מת, שטוף את המכשיר דרך הכניסה על ידי פיפטה עם 20 μl של PBS לשטוף, להזריק 20 μl של פתרון בשידור חי / מת מכתים עם DAPI הכין הבאים הוראות היצרן, דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף מכשיר שוב עם 20 μl של PBS, ותמונת המכשיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. לקנלי מרהצביעת culi, לשטוף את המכשיר דרך הכניסה על ידי פיפטה עם 20 μl של PBS לשטוף, להזריק 20 μl של 2 פתרון מכתים מיקרומטר CMFDA עם DAPI הכין הבאים הוראות היצרן, דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את המכשיר שוב עם 20 μl של PBS, ותמונת המכשיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
5. לאסוף את התקשורת בילתה ולמדוד מוצרי חילוף חומרים תאיים בנקודות זמן מתאימות על משך התרבות כדי לקבוע את תפקוד התא. לhepatocytes, למדוד את הכמות של אלבומין ואוריאה בתקשורת בילתה.
6. לבצע ניתוחים תפקודיים נקודות קצה בתאים עצמם, כגון רמות הערכת אנזים פעילות, מכתים נוגדן, או ניתוח RNA. לhepatocytes, לעורר ולמדוד את פעילות אנזים ציטוכרום P450 או שלב S-transferase גלוטתיון האנזים השני הצמידה.

תוצאות

קולגן ילידים יכול להיות שונה באמצעות מתילציה וsuccinylation ליצור פתרונות קולגן polycationic וpolyanionic לשימוש בתצהיר שכבה אחר שכבה. Succinylation משנה את קבוצות ε-אמינו של קולגן יליד עם קבוצות succinyl, ומתילציה משנה את קבוצות carboxyl של קולגן יליד עם קבוצה מתיל (איור 1 א). שינויים אלה לרשתות בצד חומצת אמינו חלבון קולגן לשנות את עקומות טיטרציה pH לפתרונות. Succinylation מפחית את מספר קבוצות אמינו ומגדיל את מספר קבוצות carboxyl, בעוד מתילציה אין כל השפעה על קבו...

דיון

ניתן להפקיד מכלולי קולגן הטהור Ultrathin על תאים טעונים או surfaces חומר באמצעות תצהיר שכבה אחר שכבה של collagens שונה. תוצאות מחקר זה מראות כי מתילציה וsuccinylation של קולגן ילידים ליצור פתרונות קולגן polycationic וpolyanionic טעון (איור 1) שניתן להשתמש בו עם טכניקת שכבה אחר שכבה להפקיד מכלולי מטריצת קולגן Ultrathin על תאים (איור 2) או אחר surfaces חומר. שכבות מטריצת Ultrathin כזה יכול לייצב את המורפולוגיה, כדאיות, והקיטוב של תאים כגון hepatocyt...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קולגן סוג I, זנב עכברוש	Life Technologies	A1048301	אפשרות לקולגן מרוכז זנב עכברוש
קולגן סוג I, זנב עכברוש	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	אופציה לקולגן מרוכז זנב עכברוש
קולגן סוג I, זנב עכברוש	EMD Millipore	08-115	אופציה לקולגן מרוכז זנב עכברוש
קולגן סוג I, זנב עכברוש	R%D Systems	3440-100-01	אפשרות לקולגן מרוכז זנב עכברוש
סוקסיני אנהידריד	סיגמא-אולדריץ'	239690-50G	מגיב סוקסינילציה
מתנול נטול מים	סיגמא-אולדריץ'	322415-100ML	מגיב מתילציה
נתרן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	S5881-500G	מגיב משקעים
pH חומצה הידרוכלורית	סיגמא-אולדריץ'	320331-500 מ"ל	מגיב משקעים pH
קולגן עכברוש סוג I ELISA	Chondrex	6013	אפשרות לאיתור תכולת קולגן
ערכת בדיקת הידרוקסיפרולין	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	אפשרות לאיתור תכולת קולגן
ערכת בדיקת הידרוקסיפרולין	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	אפשרות לזיהוי תכולת קולגן