מאמר שיטה

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני במבחנה דגם ניסיוני

DOI:

10.3791/53080

⸱

18 באוקטובר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering (DIBRIS), University of Genova, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Department of Cognitive Neuroscience, Radboud University Medical Center, 3Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia (IIT)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו, מודל ניסיוני חדשני שבו תרביות עצביות תלת-ממדיות מחוברות למערכי מיקרו-אלקטרודות מישוריים (MEAs) presented. 3D רשתות נבנות על ידי זריעת נוירונים בפיגום המורכב ממיקרו-חרוזי זכוכית שעליהם גדלים נוירונים ויוצרים מבנים תלת-ממדיים המחוברים זה לזה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נכון לעכשיו, רשתות בקנה מידה גדול שמקורן בנוירונים מנותקים הגדלים ומתפתחים במבחנה במכשירי מיקרו-מתמרים חוץ-תאיים הם המודל הניסויי הסטנדרטי לחקר מנגנונים נוירופיזיולוגיים בסיסיים המעורבים בהיווצרות ותחזוקה של מכלולי תאים עצביים. עם זאת, מחקרי מבחנה הוגבלו לרישום הפעילות האלקטרופיזיולוגית הנוצרת על ידי רשתות עצביות דו-ממדיות (2D). עם זאת, בהתחשב בקשר המורכב בין מבנה לדינמיקה, יש צורך בשיפור משמעותי כדי לחקור את היווצרותן והתפתחותן של רשתות תלת מימדיות (תלת מימד). בעבודה זו, מוצגת פלטפורמה ניסיונית חדשה שבה רשתות היפוקמפוס או קליפת המוח תלת מימדיות מחוברות למערכי מיקרו-אלקטרודות מישוריים (MEAs). רשתות תלת מימד מתממשות על ידי זריעת נוירונים בפיגום המורכב ממיקרו-חרוזי זכוכית (בקוטר 30-40 מיקרומטר) שעליהם נוירונים מסוגלים לגדול וליצור מכלולים תלת מימדיים מורכבים המחוברים זה לזה. באופן זה ניתן לתכנן רשתות תלת מימד מהונדסות המורכבות מ-5-8 שכבות עם צפיפות תאים סופית צפויה. המורכבות הגוברת בארגון המורפולוגי של מכלול התלת מימד גורמת לשיפור הדפוסים האלקטרופיזיולוגיים המוצגים על ידי רשתות מסוג זה. בהשוואה לרשתות הדו-ממדיות הסטנדרטיות, שבהן מופיעה פעילות התפרצות סטריאוטיפית מאוד, המבנה התלת-ממדי משנה את פעילות ההתפרצות מבחינת משך ותדירות, כמו גם מאפשר תצפית על פעילות זינוק אקראית יותר. במובן זה, מודל התלת מימד שפותח דומה יותר לרשתות עצביות in vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברשתות מבחנה דו-ממדיות (2D) עצביות מצמידים את מיקרו-אלקטרודה מערכים (MEAs) עלה יפה אימץ ללמוד את יחסי הגומלין בין דינמיקה העצבית והקישוריות הבסיסית מודל ניסיוני זהב סטנדרטי. במהלך הפיתוח, נוירונים לשחזר רשתות מורכבות המציגות גם פעילות definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (כלומר, התפרצויות, התפרצויות רשת, פעילות spiking אקראית). MEAs להקליט את פעילות אלקטרו מאתרים רבים (בין עשרות לאלפים microelectrodes), המאפשר חקירה מפורטת של הדינמיקה הביעה ברמת הרשת. בנוסף, השימוש בתרבויות ניתק עושה possibile לעצב מהונדסות-רשתות. זה קל יותר להבין בדרך זו את היחסים הפונקציונליים בין פעילות אלקטרו נרשמה והפרמטרים של ארגון הרשת כמו תא צפיפות 3, מידת המודולריות 4,5, נוכחות של פופ העצבי הטרוגנית6 ulations, וכו 'עם זאת, כל במבחנה בתאים בתרבית ניתקו מבוססת על רשתות עצביות 2D. גישה זו מובילה לפשטנותן ביחס למערכת בvivo (3 ממדים מהותי, 3D): (i) בקונוסים מודל, somata וצמיחת 2D הם שטוחים ותולדת האקסונים-דנדריטים לא יכול להתפשט לכל הכיוונים 7. (Ii) במבחנה תערוכת רשתות 2D סטריאוטיפית דינמיקת אלקטרו נשלטה על ידי מתפוצץ פעילות הכרוכה ברוב הנוירונים של הרשת 8.

לאחרונה, פתרונות שונים פותחו כדי לאפשר הבנייה של במבחנה 3D ניתק רשתות עצביות. הרעיון המשותף מורכב ביצירת פיגום שבו תאי עצב יכולים לגדול בצורה 3D. כגון פיגום יכול להתממש עם ג'לי פולימר ומטריצות נקבוביות מוצקות 9-13. על ידי ניצול התכונות מכאניות של הפולימרים, ניתן להטביע בתוך תאים thesמבני דואר על ידי הגדרת בלוק אחיד של תרבויות 3D של neurospheres 11. התכונה העיקרית של גישה זו היא הרכוש המכני הנוקשה של neurospheres 9,12. עם זאת, חומרים אלה נקבוביות מוגבלים, והם לא מבטיחים נדידת תאים בתוך המטריצה. כדי להתגבר על חסרון זה, פתרון אפשרי מורכב בחיתוך המטריצה ​​לתוך מודולים 'יחידה'. למרבה הצער, את מגוון הגודל וצורה של החלקיקים עלול להקשות על האריזה למבנים שכבתיים רגילים. ב -7, קאלן ועמיתים לעבודה שנועדו לבנות עצבי 3D מורכב מתאי עצב ו / או האסטרוציטים בתוך פיגום מבוסס מטריקס ביו. כגון רקמה עצבית מהונדסת אפשרה בחקירות מבחנה ללמוד ולתפעל תגובות נוירו-ביולוגיות בתוך מיקרו-סביבות 3D. מודל זה מורכב מתאי עצב וגליה מופצים ברחבי המטריצה ​​תאית (ECM) ו / או פיגומי הידרוג'ל (500-600 מיקרומטר עבה). בשיתוף זהndition, כדאיות אופטימלית תא (יותר מ 90%) נמצאה על ידי תאי ציפוי בצפיפות סופית של כ 3,750 - 5,000 תאים / מ"מ 3. יש לציין שערך כגון צפיפות נמוך בהרבה מזה שבמצב in vivo, שבו צפיפות התאים בקליפת מוח העכבר היא כ 90,000 תאים / מ"מ 3 14. כדי להתגבר על מגבלה זו Pautot ועמיתים לעבודה 15 הבינו במבחנה מערכת 3D שבו צפיפות תאים וקישוריות לרשת נשלטות להידמות בתנאי vivo תוך שהוא מאפשרים הדמיה של הרשת בזמן אמת. למעשה, שיטה זו מבוססת על הרעיון שניתק נוירונים בתרבית יכולים לגדול על microbeads סיליקה. חרוזים אלה מספקים משטח צמיחה גדול מספיק עבור גופי תא עצביים לדבוק ולarborizations לגדול, בוגר, להאריך, ולהגדיר קשרים סינפטיים לנוירונים אחרים. שיטה זו מנצלת את תכונות הרכבה הספונטניות של חרוזים פיזור מונו לFOrm 3D שכבתי מערכי משושים המכילים תת שונה של תאי עצב בשכבות שונות עם קישוריות מוגבלת, בין הנוירונים בחרוזים שונים. צפיפות התאים הושגו בשיטה זו הייתה על 75,000 תאים / מ"מ 3.

לאחרונה, יש לנו השיטה מותאמת של Pautot לMEAs 16: התוצאות שהתקבלו מראות כי פעילות אלקטרו 3D מציגה רפרטואר רחב יותר של פעילויות מזו באה לידי ביטוי על ידי רשתות 2D. תרבויות בוגרות 3D תערוכה דינמית משופר שבה שני פרץ הרשת ולהתקיים פעילות ספייק אקראית. באופן דומה, טאנג-Schomer ועמיתים לעבודה 17 הבינו פיגום נקבובי מבוסס חלבון משי אשר שומר תרבות בקליפת המוח עיקרי במבחנה במשך כמה חודשים, ורשמו את פעילות אלקטרו באמצעות אלקטרודה טונגסטן.

בעבודה זו, הפרוצדורות לבנות רשתות עצביות 3D מצמידים את MEAs יתואר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הטיפול בבעלי חיים האירופי החקיקה (2010/63 / האיחוד האירופי), על ידי משרד בריאות האיטלקי בהתאם לDL 116/1992 ובהנחיות של אוניברסיטת גנואה (Prot. נ 13,130, מאי 2011). כל המאמצים שנעשו כדי להפחית את מספר בעלי החיים לפרויקט וכדי למזער את סבלם.

1. הכנת חומרים ותומכים

  1. לבנות העובש לבנות PDMS האילוץ (פולי-דימתיל-siloxane) באמצעות מכונת כרסום CNC (מחשב נומרית בקרה). כגון עובש מתממש בפוליקרבונט עם הצילינדר המרכזי בpolytetrafluoroethylene (PTFE). חומר זה מאפשר מיצוי קל של המסכה פעם PDMS הקשיח.
    הערה: העיצוב של העובש שבוצעה על ידי בעזרת מחשב-עיצוב (CAD) ולאחר מכן מועברת למכונת כרסום CNC.
  2. הכן את אלסטומר PDMS. PDMS הוא פולימר אורגני. הוא מורכב משני אלמנטים, סוכן ריפוי ופולימר. לערבב אותם על ידי יחס נפח של 1:10, חלק אחד של סוכן ריפוי ותשעה חלקים של פולימר. לשים את שני המרכיבים בצלחת פטרי, לנער ולהכניס את התערובת בתא הוואקום במשך 10 דקות כדי למנוע בועות אוויר. 3 גרם של PDMS מספיקים לאילוץ אחד.
  3. לבנות את אילוץ PDMS. הכנס את חומר PDMS לתוך להרקב והכנסתי אותו לתנור למשך 30 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. יש אילוץ PDMS הצורה של גליל אידיאלי עם קוטר חיצוני ופנימי של 22.0 ו -3.0 מ"מ, בהתאמה וגובה של 650 מיקרומטר.
  4. היום לפני הציפוי, זוג המסכה לאזור הפעיל של מערכי מיקרו-אלקטרודה (MEAs) באמצעות פינצטה תחת סטראו ולעקר את מסכת PDMS בתנור על 120 מעלות צלזיוס.
  5. לעקר את microbeads הזכוכית (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע של 42.3 מוסמך ± 1.1 מיקרומטר) באתנול 70% לשעה 2 בבקבוקון חרוטי ולסובב EVery 30 דקות כדי לחשוף את כל microbeads.
  6. הסר את פתרון אתנול מהבקבוקון ולשטוף microbeads שתי פעמים עם מים מעוקרים.
  7. להתנות חלק משטח MEA המופרד על ידי מסכת PDMS (קוטר שווה ל 3.0 מ"מ) עם 24 μl של פתרון המעורב של פולי-D-ליזין וLaminin ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר המרכזי.
  8. מעיל microbeads עם חלבוני הדבקה, Laminin ופולי-D-ליזין ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר ולהשאיר אותם לילה בחממה על 37 מעלות צלזיוס, להשיג ברשת עצבית יציבה וארוכה טווח.
  9. הסר את גורמי ההידבקות הן ממשטח הזכוכית של MEA ומmicrobeads הזכוכית. לשאוב כ -95% מפתרון הציפוי עם טפטפת ולהחיל volume- קטן 24μl- של מים סטריליים על פני השטח MEA. לשאוב שוב יותר מ -95% מהמים ולתת יבשים MEA מתחת למכסת המנוע למינרית עבור שעה 1 לפני ציפוי התאים.
    הערה: במקרה של microbeads במקום, לשאוב את הציפויפתרון ולעשות כביסה ראשונה עם מים מעוקרים ואחד שני עם המדיום הבסיסי והתוספת שלה כגון B27, כדי להתנות את משטח הזכוכית שבו נוירונים יהיו מצופים. אל תתנו microbeads יבש. להשאיר אותם בהשעיה במדיום התרבות בתוך הבקבוקון.
  10. להפיץ, באמצעות פיפטה -200 μl-, ההשעיה של microbeads טופל (כ 32,000) על צלחת multiwell עם הוספת קרום (קוטר נקבובית 0.4 מיקרומטר) שבו הם יהיו עצמיים להרכיב יוצרי שכבה אחידה.
  11. מלא היטב בכל הקרום עם 0.5 מיליליטר של מדיום ולשים אותו בחממה (T = 37.0 מעלות צלזיוס, CO 2 = 5%) עד נוירונים מוכנים להיות מצופה (3.2).

2. Dissection של עוברים ודיסוציאציה של רקמות

  1. חולדות בוגרות בית נקבה (200-250 גרם) בטמפרטורה קבועה (C 22 ± 1 °) ולחות היחסית (50%) בלוח זמני אור הכהה רגיל (אור-על 07:00-19:00) במתקן בעלי חיים. ודא שמזון ומים זמינים באופן חופשי.
  2. הרדימי נקבת עכברוש הריון לאחר 18 ימים של פיתוח (E18) באמצעות 3% isoflurane. לאחר מכן, להקריב בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם.
  3. הסר hippocampi מכל עובר חולדה ולהכניס אותם לתוך הפתרון של קרח הקר האנק המאוזן מלח ללא Ca 2 + וMg 2 +. ביום 18 בהיפוקמפוס פיתוח ורקמות קליפה רכים מאוד ולא צריכים לחתוך לחתיכות קטנות. ניתן למצוא פרטים נוספים 18,19.
  4. לנתק את הרקמה ב0.125% מהפתרון של טריפסין / האנק מכיל 0.05% מDNAse ל18-20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. הסר את פתרון supernatant עם טפטפת פסטר ולעצור את העיכול אנזימטי על ידי הוספה בינונית עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) במשך 5 דקות.
  6. הסר את המדיום עם FBS ולשטוף פעם אחת עם המדיום עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר. הסר שוב בינוני עם PIP פסטרette ולמלא אותו שוב עם כמות קטנה (500 μl) של מדיום גידול עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
  7. לנתק את גלולה הרקמה מכאנית עם פיפטה פסטר צרה עד השעיה חלבית של תאים היא לכאורה. אין צורך לצנטריפוגה ההשעיה התא.
  8. לדלל את הנפח הקטן של השעיה תא עם מדיום הגידול להשיג נפח סופי של 2.0 מיליליטר. לספור את הריכוז הסלולרי שהושג עם תא hemocytometer. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי של 600-700 תאים / μl.

3. תא ציפוי

  1. תאי פלייט בצפיפות של כ -2,000 תאים / מ"מ 2 על האזור הפעיל של MEA, שהוגדרו על ידי אילוץ PDMS ליצור רשת עצבית 2D.
    הערה: כל ההיפוקמפוס מכיל כ 5 x 10 5 תאים, (1 x 10 6 לעובר יחיד). לנתח 6 עוברים כדי לקבל סכום כולל של 6 x 106 תאים 2 מיליליטר, וריכוז משוער של 3,000 תאים / μl. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי וצלחת על 600-700 תאים / μl. אם אזור MEA המופרד על ידי אילוץ PDMS הוא על 7.065 מ"מ 2, והמספר הכולל של תאים מצופים 600 תאים / μl x 24 μl = 14,400 תאים, הצפיפות הסופית של 2,038 תאים / מ"מ 2.
  2. הנח את מכשירי MEA לתוך החממה עם CO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס.
  3. הפץ 160 μl של ההשעיה עם ריכוז תא של 600-700 תאים / μl (כ -100,000 תאים) על פני השטח של monolayer microbeads ממוקם בתוך צלחות multiwell כדי להשלים את השלב המקדים לבניית התרבות תלת-ממדית. שים את צלחות multiwell בחממה עם CO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס.

בניית 4. רשת העצבית 3D

  1. 6-8 שעות לאחר הציפוי, להעביר את ההשעיה (microbeads עם הנוירונים) מהצלחות multiwell מאוד בזהירות בתוך השטח המופרד על ידי אילוץ PDMS באמצעות פיפטה נקבעה לנפח של כ 30-40 μl. לאחר כל העברה, לחכות כחצי דק, כדי לאפשר microbeads לעצמי להרכיב במבנה קומפקטי משושה.
  2. לאחר שכל השכבות מופקדות וספונטאניות התאספו, למלא עם ירידה גדולה של כ -300 μl של מדיום העליון של האזור המופרד על ידי אילוץ PDMS.
  3. שים את מבנה 3D מצמידים את MEA בחממה (T = 37.0 מעלות צלזיוס, CO 2 = 5%) למשך 48 שעות לפני הוספת נפח סופי (כ 1 מיליליטר) של תרבות מדיום גידול עם התוספת שלה.
    הערה: קחו למשל את המספר הכולל של חרוזים על צלחות multiwell עם הוספת הקרום (30,000) ומספר חרוזים בשכבה אחת על גבי מכשיר MEA (6000). מבנה 3D וכתוצאה מכך מורכב של 5 שכבות של מילcrobeads ותאים. אם ניקח בחשבון שהרשת העצבית 3D היא לא גיאומטרית מושלמת, מבנה 3D וכתוצאה מכך יכול להיות מורכב משכבות 5-8.
  4. היום לאחר ציפוי, להוסיף בזהירות את הנפח הסופי של המדיום (כ -900 μl) בתוך טבעת MEA. לשמור על תרבויות 3D בCO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס במשך 4-5 שבועות. להחליף מחצית בינוני פעם בשבוע.

5. מיקרוסקופיה confocal רכישה

  1. תקן את הדגימות הביולוגיות לשלב של מיקרוסקופ בבעל. הגדר את הלייזר (ארגון, 496-555 ננומטר), מהירות הסריקה (400 הרץ) שבו לרכוש את התמונה, רווח וקיזוז (0.3%) של PMT עבור כל תמונה כדי ללכוד את מסנן פליטת רוחב פס הנכון וכדי כדי למנוע הרוויה ולהגדיל את יחס האות לרעש. תוצאות סעיף מדווח הערכים שימשו לרכישת התמונות של איור 4.
  2. לרכישת z -stack רצף, האשוחרח 'בחר, הערך של עמדת z של החלק העליון והשכבה התחתונה של המדגם, ולאחר מכן בחר את גודל צעד כדי להפוך את הרכישה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. בהליך ניסיון זה, תפקיד רלוונטי הוא שיחק על ידי microbeads המגדירים את הפיגום המכני לצמיחה של הרשת העצבית 3D איורים תצוגת 1A ו- B ההסדר של microbeads (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע מוסמך של 42.3 ± 1.1 מיקרומטר) במטוס. הייחוד של מבנים כאלה הוא שmicrobeads באופן ספונטני עצמי להרכיב-הגדרת גיאומטריה קומפקטית משושה (איור 1 ו- C). הפיגום כך נוצר מבטיח משטח צמיחה עקבי לneurites ומרחב הבין מספיק גדול להחלפת חילוף החומרים של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו, ניסוי חדשני בפלטפורמת מבחנה המורכבת מ3D מהונדס תרבויות עצביות מצמידים את MEAs לאלקטרופיזיולוגיה רשת כבר הציג. השימוש בmicrobeads כפיגום לאפשר תולדת דלקת העצבים לאורך -axis z כבר מותאם להיות משולב עם MEA מישוריים. בדרך זו, תוצאות מיקרו-המערכת שהושגו במבחנת מודל 3D תקף ומהימן כדי ללמוד את דינמיקת אלקטרו מתהווה 16.

הגדרת הקלטת MEA

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים ג'ורג'יו Carlini לתמיכה הטכנית בפיתוח מבנה הכליאה וdott. Ornella LoBrutto לתיקון היסודי של כתב היד. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתכנית מסגרת ה -7 של האיחוד האירופי (ICT-FET FP7 / 2,007-2,013, FET צעיר מגלי ערכה) תחת 284,772 BOW BRAIN הסכם מענק (www.brainbowproject.eu).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
למיניןסיגמא-אולדריץ'L20200.05 ומיקרו; גרם/מ"ל
פולי-D-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P64070.05 ומיקרו; גרם/מ"ל
טריפסיןגיבקו25050-0140.125% מדולל 1:2 ב-HBSS w\o CA++, MG+++
DNAaseSigma-AldrichD50250.05% מדולל  בתמיסת הנקס
NeurobasalGibco Invitrogenמדיום תרבית
21103049 B27Gibco Invitrogen175040442% בינוני
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichF-244210%
Glutamax-I Gibco350500380.5 מ"מ
גנטמיציןסיגמא-אולדריץ'G.12725 מ"ג/ליטר
פולי-דימתיל-סילוקסן (PDMS)481939 קורנינג סיגמאוהפולימר
מערכי מיקרו-אלקטרודותמערכות רב-ערוציות (MCS)60MEA200/30-Ti-prMEA עם: רשת אלקטרודות 8x8; מרווח וקוטר אלקטרודות 200 ו-30 ומיקרו; מ', בהתאמה; טבעת פלסטיק ללא חוט
Microbead Distrilab-Duke Scientific9040  1 גרם חלק זכוכית. גודל סטנדרטי 40 ומיקרו; m
TranswellCostar SigmaCLS 3413לוחות מרובי בארות עם תוספת ממברנה (קוטר 6.5 מ"מ נקבובי 0.4 ומיקרו; m)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++ Gibco Invitrogen14175-052
Hanks Buffer Solution סיגמא H8264
טפלוןסיגמא430935-5Gפוליטטרפלואורואתילן
עכברושספראג דוליוויסטאר עכברוש
מיקרוסקופיה קונפוקלית זקוףLeicaTCS SP5 AOBS
20.0x0.50 מטרת מיםLeicaLeica HCX APO L U-V-I 
40.0x0.80 מטרת מיםLeicaLeica HCX APO L U-V-I 
25.0x0.95 מטרת מיםLeicaHCX IRAPO L
חומר ריפוי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
  2. Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
  3. Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
  4. Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
  5. Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
  6. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
  7. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
  8. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
  9. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
  10. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
  11. Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
  12. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
  13. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
  14. Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
  15. Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
  16. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
  17. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
  18. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
  19. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
  20. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
  21. Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
  22. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMSambleIn Vitro

מאמרים קשורים