הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל התרבות 3D-תגובת הורמון של האפיתל בלוטת חלב האדם

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53098

⸱

7 בפברואר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Physiology and Pathobiology, Tufts University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים מודל תרבית תלת מימדי של אפיתל השד האנושי המתאים לחקר פעולת ההורמונים.

תקציר

תהליך המורפוגנזה של אפיתל החלב מושפע מהורמונים. חקר פעולת ההורמונים על אפיתל השד באמצעות תרביות דו-ממדיות מוגבל לשגשוג תאים ונקודות קצה של ביטוי גנים. עם זאת, באורגניזם, מורפוגנזה של חלב מתרחשת בסביבה תלת מימדית. מערכות תרבית תלת מימד עוזרות לגשר על הפער בין תרבית תאים חד-שכבתית (2D) למורכבות האורגניזם. כאן, אנו מתארים מודל תרבית תלת מימדי של אפיתל השד האנושי המתאים לחקר פעולת ההורמונים. הוא משתמש בקו תאי האפיתל של השד האנושי המגיב להורמונים הזמין מסחרית, T47D וקולגן זנב עכברוש סוג 1 כמטריצה. מודל תרבית תלת מימד זה מגיב להורמונים הממוטרופיים העיקריים: אסטרדיול, פרוגסטינים ופרולקטין. ניתן לראות את השפעת ההורמונים הללו על מורפוגנזה אפיתל לאחר טיפול של שבוע או שבועיים בהתאם לנקודת הקצה. ניתן לקצור את התרביות התלת מימדיות לניתוח מורפוגנזה אפיתלית, התפשטות תאים וביטוי גנים.

מבוא

בניגוד לתרבויות 2D רגיל, מודלים פונדקאית תרבית תאים 3D לאפשר לחקר התנהגות תא אפיתל בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, אחד הדומה רקמות. תרבויות 3D של בלוטת החלב סייעו להבהיר היבטים רבים של התפתחות בלוטת חלב וגידולים. עם זאת, רוב דגמי תרבות 3D הזמינים כרגע אינם מתאימים ללמוד פעולת הורמון משום שורות התאים אנושי אפיתל המשמשים את המשימה חסרות ביטוי קולטן הורמון 6,7,9.

בזאת, אנו מתארות מודל התרבות 3D של האפיתל השד האנושי כי הוא מתאים ללמוד פעולת הורמון 12. מודל זה עושה שימוש שורת תאי אפיתל שד אדם הורמון מגיבים הזמין המסחרית, T47D 3,11,13, אשר הופקו במקור מתוך תפליט פלאורלי המתקבל מטופלת בת 54 עם קרצינומה ductal הסתננות של שד. אנו משתמשים קולגן זנב חולדה סוג 1 כמטריצה. פולחן 3D זהמודל יור מתאים לחקר הפעולה של שלושה הורמונים mammotropic הראשי (אסטרדיול, promegestone (אנלוגי של פרוגסטרון), ופרולקטין) על תאי אפיתל שד אנושיים. הורמון נגרם מורפולוגיה אפיתל ניתן להעריך כמותית לאורך זמן על ידי ניתוח morphometric 12.

צפיפות זריעה מתאימה מאפשרת תרבויות 3D אלה כדי להישמר במשך 2 שבועות. בשלב זה, את הפיתוח של מבנים מספיק הערכה כמותית חזקה פעולת הורמון על מורפולוגיה אפיתל. ג'לים ניתן לקצור גם בנקודות זמן קודמות עבור התפשטות תאים ביטוי גנים מנתח. בנוסף, מודל זה מתאים כדי לבחון את ההשפעה של טיפול הורמונלי רציף; למשל, לאחר הטיפול עם אסטרדיול בשבוע והחלפת הראשון עם / שילוב הורמונים אחרים של הורמונים במהלך השבוע הבא. השפעת תרכובות antiestrogens אסטרוגניים, כגון ICI 182,780, יכול גם להיות סטומת באמצעות מודל התרבות 3D זה 12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים

  1. ממס את promegestone progestagen הסינטטי (R5020) ו -17 β-אסטרדיול (E2) באתנול לעשות 10 פתרונות מניות -3 M. ממיסים פרולקטין מים ללא יונים מזוקקים כדי להפוך פתרון מניות 1 מ"ג / מ"ל. ממיסים את antiestrogen ICI 182,780 ב DMSO להכין פתרון המניה 10 -2 M. אחסן הפתרונות הללו ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  2. dextran הפחם (CD) הפשיט בסרום ובינוני CDFBS:
    1. מחממים להשבית בסרום שור העובר (FBS) באמבט מים 57 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
      הערה: השתמש רק זכוכית חומצת שטף לשארית בפרוטוקול זה.
    2. לחשב את כמות פחם צורך. תוך שימוש בנפח 10% יותר מהסכום של בסרום כדי לפצות על עקירה הנגרמת על ידי פחם, לשקול wt / כרך 5% מופעל אבקת פחם.
    3. לשטוף פחם פעמיים עם מים מזוקקים deionized קר באמצעות באותו נפח כסכום בסרום. עבור כל ג לשטוףentrifuge ב 50 XG במשך 2 דקות עד גלולת הפחם. הסר את המים בין שוטף. הוסף 0.5% wt / כרך Dextran T-70 של גלולת הפחם האחרון. Re- להשעות עם מזוקקים, מים ללא יונים צנטריפוגות ב 100 XG במשך 5 דקות. לשאוב את המים.
    4. להוסיף נפח מתאים של סרום על גלולה מחדש להשעות גלולה dextran פחם לתוך בסרום. דגירה, תוך גלגול (6 סל"ד), ב 37 ºC למשך 60 דקות. צנטריפוגה XG ב 2000 עבור 20 דקות. אם supernatant מופיע מעונן, חזור צנטריפוגה; עם זאת, סרום לא יכול להיות ברור לחלוטין בשלב זה, אך ינוקו במהלך סינון.
    5. סינון דרך מסנן 0.80 מיקרון ואז שוב דרך פילטר 0.45 מיקרון להסיר חומר חלקיקים גדולים. לבסוף, לסנן לעקר עם מסנן 0.20 מיקרון. חנות מסוננת CDFBS במבחנות או T-25 צלוחיות תרבות ב -20 ºC.
    6. פחם Dextran Stripped שור עוברי המכיל תקשורת (מדיה CDFBS): לערבב 375 מיליליטר של DMEM האדום ללא פנול 125 מיליליטר של DMEM/ F-12. הסר 37.5 מ"ל ולהחליפה נפח זהה של בסרום שור עוברית Stripped פחם Dextran. הוסף 10 6 U / ml פניצילין L- גלוטמין לריכוז 2 מ"מ הסופי. התקשורת וכתוצאה מכך הוא 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7.5% פחם dextran הפשיטו FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו -10 6 U / פניצילין מ"ל.
  3. כן PBS 10X, 1N NaOH ומי deionized מזוקקים. הכינו מספיק נפח של כל בהתאם להיקף של פתרון קולגן הצורך. לעקר את כל הפתרונות על ידי סינון. אחסנו את 10x PBS ומי deionized מזוקקים סטריליים על 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש. אין לאחסן פתרון 1N NaOH.
  4. כן פתרון קולגן בריכוז 1 מ"ג / מיליליטר סופי לפי פרוטוקול עבור "נוהל gelation חלופי כי אני קולגן, זנב עכברוש" המסופק על ידי יצרן. ג'ל כל גרם של 1.5 מ"ל של תמיסת קולגן. לדוגמה, להכין 18.5 מ"ל (0.5 מ"ל לתת דין וחשבון על אובדן במהלך pipetting) של פתרון קולגן להכין12 ג'לים. השתמש פתרון קולגן מייד או להיאחז קרח עד 2-3 שעות.
  5. קרמיין אלום לצבוע:
    1. שלב 1 גרם קרמיין סולפט אלומיניום אשלגן 2.5 גרם ב 500 מ"ל מים מזוקקים. מרתיחים תוך ערבוב במשך 20 דקות. צפה בזהירות כדי למנוע רותחים מעל. התאם נפח סופי חזרה 500 מ"ל מים מזוקקים נוספים.
    2. הוספת קריסטל של תימול לפעילות מיקרוביאלית ולכסות בקבוק עם רדיד אלומיניום על מנת להגן מפני אור. סינון דרך מסנן נייר דירוג מעבדה לפני כל שימוש. שימוש חוזר הפתרון הארגמן לתקופה של עד שלושה חודשים. חנות ב RT, מוגן מפני אור.
  6. פתרון Collagenase: לפזר את collagenase במדיום DMEM / F12 בריכוז של 0.125% w / v. אין לאחסן את הפתרון הזה.

2. תאים 3D תרבות של T47D ב זנב עכברוש קולגן מסוג 1 ג'לים וטיפול הורמונלי

הערה: לשמור טפטפות סרולוגיות סטרילי וטיפים פיפטה ב 4 ° C..

  1. Prepaמחדש השעית תא בודד ולבצע ספירת תאים. בתרביות תאים פיצול T47D לפני שהם מגיעים למפגש 70%. צנטריפוגה נפח המכיל כמות התאים הדרושים. יחשוב על זה ג'ל אחד צריך להכיל כ 75,000 T47D תאים.
  2. באמצעות הגלולה קרה-פיפטה, מחדש להשעות את תא הנפח המתאים של קולגן. תחשוב על זה כל ג'ל מורכב 1.5 מיליליטר של קולגן. מערבבים את התאים ואת קולגן בעדינות כדי למנוע החדרת בועות.
  3. כדי למנוע את ההשפעה של חשמל סטטי על חלוקת תא, לצחצח את הגבולות, העליון והתחתון של צלחת 12-היטב עם מברשת חשמל סטטי הפחתה לאחר להוריד את הכיסוי מעל הצלחת. כדי למנוע הצטברות חשמל סטטי במהלך מגע עם משטח עבודה של מכסה המנוע, להציב צלחת זו על גבי זו צלחת 12-היטב (צלחת ריקה) כי גם כבר מוברש עם brush.Gently מפחיתי סטטי, יוצקים 1.5 מ"ל של תערובת לבאר כל צלחת 12-היטב.
  4. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הסר הצלחת דואר מהחממה ולמקם אותו בחזרה על מכסה המנוע.
  5. בעזרת קצה p200 סטרילית, לנתק את ג'ל בזהירות בתנועה מעגלית עדינה מגבול הבאר. הג'ל צריך גם לנתק מתחתית הבאר.
  6. לדלל הורמונים במדיה CDFBS שיתווספו הבארות. השתמש E2 ו- R5020 בריכוז ופרולקטין הסופי 10 -10 M בכל ב- 10 -7 M הריכוז הסופי. כפי בקרה, שימוש במדיה CDFBS ללא הורמונים הוסיפו אך עדיין מכיל את הנפח הגבוה ביותר של DMSO השווה מניות הורמון המשמש. ודא כי כל טוב מכיל 1.5 מ"ל של התקשורת. מניחים את תרבויות 3D בתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 100% לחות רקמת תרבות חממה. שמירה על תרבויות עבור 1 או 2 שבועות, שינוי התקשורת כל 2 ימים.

3. עיבוד ג'ל Mounts הפריטים

  1. הסר מדיה התרבות ולהוסיף 1.5 מ"ל של PBS היטב כל אחד.
  2. מעבירים את הג'ל על שקופית. חותך את ג'ל לשניים באמצעות עקומהלהב כירורגי ד. המשך עיבוד עם חצי אחד ולשמור את החצי השני לניתוח היסטולוגית.
  3. מעבירים את הג'ל וחצי הר שלם לשקופית. תן יבש ג'ל למשך 5 דקות ולאחר מכן להעביר את השקופית בצנצנת coplin המכיל פורמלין 10%.
    הערה: כל incubations צריך להיעשות ב RT.
  4. תקן ג'לים בצנצנת coplin על N / שייקר O.
  5. לשטוף מחליק פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד על שייקר. העברת שקופיות 70% EtOH; דגירה במשך שעה 1 על שייקר. מגלשות העברת קרמיין אלום O / N.
  6. למחרת, מייבשים שקופיות על שייקר ב 70% EtOH, 95% EtOH ו 100% EtOH עבור שעה 1 כל אחד. העברת שקופיות קסילן פעמיים במשך שעה 1 כל ולשמור על שייקר. השתמש הרכבה בינונית מבוססי טולואן לעלות הג'לים coverslips עבה 1.5 מ"מ.
  7. בדוק mounts כל תחת אור רגיל (מיקרוסקופ או סטריאוסקופ). לניתוח מפורט יותר של הצורה לומן להשתמש במיקרוסקופ confocal ולדמיין לצבוע קרמיין עם לייזר ננומטר 633 HeNe.

4. עיבוד ג'ל עיבוד עבור ניתוח היסטולוגיה

  1. מעבירים את החצי הנותר של הג'ל על בקבוקון זכוכית 20 מ"ל המכיל 10% פורמלין ולתקן על שייקר O / N.
  2. לשטוף ג'לי פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד על שייקר. ג'לי מקום לתוך קלטות עיבוד להטבעת פרפין.
  3. ג'לים העברת 70% EtOH, דגירה במשך שעה 1 ופעל עם 95% EtOH עבור שעה 1, לשנות כדי EtOH 95% טרי עבור שעה 1, 100% EtOH עבור שעה 1, ולשנות כדי EtOH 100% טרי 1 שעה. בשלב זה, ניתן לאחסן ג'לים 100% EtOH O / N ב RT או מודגרות עם קסילן במשך שעה 1 ולאחר מכן שוב קסילן טרי 1 hr.
  4. קלטות העברה פרפין עבור שעה 1 ב 60 מעלות צלזיוס חממה ואקום, לחזור עם פרפין טרי עוד פעמיים.
  5. מלאו תבניות פלסטיק עם פרפין נקי. פתח את הקלטת, להסיר את הג'ל ומניחים אותו בתוך פרפין המכיל עובש פלסטיק. להתמלא פרפין ולהוסיף גבי קלטת שמע ובה התווית על גבי ולתת בלוק מגניב.
  6. הסר את plastעובש סעיף ic הבלוק באמצעות microtome. השג 5 אממ חלקים עבים כי הוא מכתים immunocytochemistry.

הפקת 5. של תאי תאי ג'לים באמצעות טיפול Collagenase

  1. הסר ג'ל מהבאר ולהעביר אותו בצלחת פטרי המכילות PBS. בקצרה ג'ל שטיפה.
  2. מעבירים את הג'ל על שפופרת 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של collagenase 0.125%. פיפטה למעלה ולמטה 4-5 פעמים כדי לשבור את הג'ל לחתיכות קטנות.
  3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות (עד נמס ג'ל התאים בתרחיף)
  4. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות בתוספת סרום. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (1,000 XG, 5 דק '), supernatant שנזרקו, מחדש להשעות תאים ולספור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מסכם את הליך הכנת תרבויות 3D רגיש להורמון. מבנים אפיתל הם נצפו mounts שלם של ג'לים בתרבית למשך 2 שבועות בנוכחות E2 לבד או ביחד עם הורמונים אחרים. רק תאים בודדים או קבוצות של 2-3 תאים נוכחים כשאף הורמונים מתווספים עד בינוני תרבות (בינוני CDFBS) (איור 2). מצב זה משמש כביקורת שלילית.

תאים במבני טופס תרבות 3D שמשתנים צורה, גודל, ונוכחות לומן. חלוקת המבנים בתוך הג'ל היא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים מודל תרבית תלת מימד רגיש להורמונים כדי לבדוק את פעולת ההורמונים על אפיתל השד. ניתן להעריך את התגובה להורמונים ברמות המורפולוגיה של הרקמות, התפשטות התאים וביטוי הגנים 12. מגבלה אחת של טכניקה זו היא שההדמיה בתקופת התרבות מוגבלת למיקרוסקופ אור מכיוון שהתרביות גדלות בצלחת תחתונה מפלסטיק. ניתן להתאים את מערכת התרבית התלת מימדית ללוחות תחתונים מזכוכית כדי לאפשר הדמיה חיה של התרביות 1.

נראה כי האופן שבו תאים נשמרים הוא קריטי לשימור פנוטיפים המגיבים להורמונים. חשו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מעריכים מאוד את תרומתם העריכה על ידי שריל Schaeberle. מחקר זה מומן על ידי Avon מענקים # 02-2009-093 ו 02-2011-095, ו NIEHS / NIH ES 08,314 ל AMS. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה או מכוני הבריאות הלאומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12 בארות צלחות תרבית רקמות (פלקון)פישר סיינטיפיק08-772-29
15 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליסטירןפישר סיינטיפיק14-959-49D
פחם פעילסיגמאC-5510
קרמין אלוםסיגמאC1022-100G
קולגנאז, סוג 3וורת'ינגטוןS0C11784
מיקרוסקופ קונפוקליZeissLSM510מצויד בלייזר HeNe 633nm
Dextran T-70Abersham / Pharmacia17-0280-01
DMEM / F-12, HEPES, ללא פנול אדום Life Technologies11339-021פנול מדיה נטולת אדום לשימוש הורמונלי
DMEM, גלוקוז נמוך, פירובט, ללא גלוטמין, ללא פנול אדוםLife Technologies11054-020פנול מדיה נטולת אדום לשימוש הורמונלי
17-Β-אסטרדיולEMD Millipore3301מומס באתנול
אתנולKoptecV1001
סרום בקר עובריHycloneSH30070.03לשימוש עם הורמונים, חייב להיות פחם דקסטרן מופשט 
מסננים (115 מ"ל)Nalgene380-0080, 245-0045, 120-00200.88, 0.45, 0.20 מיקרון, בהתאמה 
פורמלין, 10%פישר סיינטיפיקSF93-20
L-גלוטמין (200 מ"מ)Life Technologies25030-081
ICI 182,780 (פולבסטרנט)סיגמא אולדריץ'I4409-25MGמומס
במיקרוטום DMSO LeicaRM2155
מדיה להטמעת רקמותMcCormick Scientific39502004
פניציליןסיגמא7794-10MUמומס ב-10 מ"ל מים מזוקקים
נטולי יונים PermountFisher ScientificSP15-500
פוספט חוצץ מי מלח pH 7.4סיגמא אולדריץ'P3813-10PAK
פרולקטיןסיגמא AldrichL4021-50UGמומס במים מזוקקים
נטולי יונים פרומגסטוןפרקין אלמרNLP004005MGמומס באתנול
קולגן זנב עכברוש קורנינג 354236יח' עשויים להכיל ריכוזים משתנים, שימו לב בהתאם
אזמלMiltex4311
מעבד רקמות ספסל סגור למחצהLeicaTP1020
נתרן הידרוקסידסיגמא אולדריץ'S5881הכן 1N NaOH מלאי
מברשת אנטי סטטית StaticMaster AmstatC3500
Stripette פיפטות סרולוגיות קורנינג 4101
צלוחיות T-25קורנינג 
430168 קסטות טישופישר סיינטיפיק15-200-403E
בקבוקוני ויטון, זכוכית, 20 מ"לפישר סיינטיפיק03-341-25D 
קסילן VWR95057-822

מקורות

  1. Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325(2014).
  2. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
  3. Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
  4. Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
  5. Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
  6. Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
  7. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
  8. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
  9. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
  10. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
  11. Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
  12. Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
  13. Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מודל תרבית תלת-ממדיתאים המגיבים להורמוניםאפיתל השדתאי T47Dקולגן מזנב חולדהטיפול באסטראדיולטיפול בפרוגסטיןטיפול בפרולקטיןמורפוגנזה אפיתליתת proliferation של תאים
מודל התרבות 3D-תגובת הורמון של האפיתל בלוטת חלב האדם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.