מאמר שיטה

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

7.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53105

⸱

31 באוגוסט 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

במאמר זה

סיכום

ייצור פיומלנין חיידקי מביא לעמידות מוגברת לעקה חמצונית ולאלימות. אנו מדווחים על טכניקות שניתן להשתמש בהן כדי לקבוע עיכוב של ייצור פיומלנין ולבדוק את העלייה ברגישות כתוצאה מכך לעקה חמצונית בחיידקים, כמו גם לקבוע ריכוז מעכב מינימלי של אנטיביוטיקה (MIC).

תקציר

פיומלנין הוא פיגמנט חוץ-תאי אדום-חום המיוצר על ידי מספר מינים של חיידקים ופטריות. פיגמנט זה נגזר ממסלול הקטבוליזם של טירוזין ותורם לעמידות מוגברת לעקה חמצונית. ייצור פיומלנין ב-Pseudomonas aeruginosa מופחת באופן תלוי מינון באמצעות טיפול ב-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). אנו מתארים שיטת טיטרציה המשתמשת בריכוזים מרובים של NTBC כדי לקבוע את ריכוז התרופה שתפחית או תבטל את ייצור הפיומלנין בחיידקים. לשיטת הטיטרציה יש תוצאה הניתנת לכימות בקלות, הפחתה ניכרת בייצור הפיגמנט עם עלייה בריכוזי התרופות. אנו מתארים גם שיטת צלחת מיקרוטיטר לבדיקת ריכוז מעכב מינימלי של אנטיביוטיקה (MIC) בחיידקים. שיטה זו משתמשת במינימום משאבים וניתן להרחיב אותה בקלות כדי לבדוק מספר אנטיביוטיקות בצלחת מיקרוטיטר אחת עבור זן אחד של חיידקים. ניתן להתאים את בדיקת ה-MIC לבדיקת ההשפעות של תרכובות שאינן אנטיביוטיות על צמיחת חיידקים בריכוזים ספציפיים. לבסוף, אנו מתארים שיטה לבדיקת רגישות חיידקים לעקה חמצונית על ידי שילוב H2O2 בצלחות אגר ואיתור דילולים מרובים של חיידקים על הצלחות. רגישות לעקה חמצונית מסומנת על ידי הפחתה במספר המושבה וגודלה עבור הדילולים השונים בצלחות המכילות H2O2 בהשוואה לביקורת ללא H2O2. בדיקת לוחית המתח החמצוני משתמשת במינימום משאבים ובריכוזים נמוכים של H2O2. חשוב לציין, יש לו גם יכולת שחזור טובה. ניתן להתאים את בדיקת לוחית הספוט הזו לבדיקת רגישות חיידקים לתרכובות שונות על ידי שילוב התרכובות בצלחות אגר ואפיון גידול החיידקים שנוצר.

מבוא

Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק גרם שלילי המייצר מגוון פיגמנטים כולל פיומלנין, פיגמנט אדום-חום המסייע בהגנה מפני עקה חמצונית1-4 וקושר מגוון תרכובות, כולל אנטיביוטיקה אמינוגליקוזיד5-7. ייצור פיומלנין נגרם על ידי פגם במסלול הקטבוליזם של טירוזין4,8, בין אם באמצעות מחיקות או מוטציות של הגן המקודד הומוגניזאט 1,2-דיאוקסיגנאז (HmgA)1,9 או באמצעות חוסר איזון באנזימים השונים במסלול10. הומוגניזט מצטבר עקב השבתת ה-HmgA, והוא מופרש ומתחמצן ליצירת פיומלנין11. ניתן לבטל או להפחית את ייצור הפיומלנין באופן תלוי מינון באמצעות טיפול בקוטל העשבים 2-[2-ניטרו-4-(טריפלואורומתיל)בנזויל]-1,3-ציקלוהקסנדיון (NTBC)12, המעכב 4-הידרוקסיפנילפירובאט דיאוקסיגנאז (Hpd) במסלול הקטבוליזם של טירוזין13. Hpd נדרש להיווצרות הומוגניזציה, ולכן פיומלנין11.

אנו מתארים בפירוט שלוש טכניקות שהיו חשובות במחקרינו על טיפול NTBC בזנים המייצרים פיומלנין של P. aeruginosa. טכניקות אלה כוללות טיטרציה של NTBC כדי לקבוע את הריכוזים שיבטלו או יפחיתו את ייצור הפיומלנין בזנים המייצרים פיומלנין במעבדה וקלינית, קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה כאשר חיידקים מטופלים ב-NTBC, והרגישות הנובעת מכך לעקה חמצונית עם טיפול ב-NTBC.

בדיקת הטיטרציה שפיתחנו משרתת שתי מטרות. ראשית, הבדיקה תאפשר למשתמש לקבוע אם NTBC יכול לבטל או להפחית את ייצור הפיומלנין בחיידק הנחקר ובאילו ריכוזים. זה יאפשר למשתמש לקבוע רגישות ל-NTBC, מכיוון שזנים שונים של חיידקים עשויים להיות בעלי רגישויות שונות לתרכובת זו, כפי שנצפה ב-P. aeruginosa12. שנית, בדיקת הטיטרציה של NTBC תאפשר למשתמש לקבוע את הריכוז המתאים של NTBC לשימוש במבחנים הבאים, כגון אנטיביוטיקה MIC ומבחני תגובת עקה חמצונית, אם המטרה היא לבטל או להפחית את ייצור הפיומלנין ולקבוע את ההשפעות של הפחתת פיגמנט.

בדיקת הטיטרציה פועלת מכיוון שניתן לראות הבדל גלוי בייצור פיומלנין בזנים שטופלו ב-NTBC וההבדלים בייצור פיומלנין תלויים במינון12. בנוסף, ניתן ליישם טכניקה זו לחקר תרכובות אחרות שעשויות לחסל או לשפר את ייצור הפיגמנט בחיידקים.

MICs אנטיביוטיים משמשים לקביעת רגישות החיידקים לאנטיביוטיקה. ישנן מספר שיטות לקביעת MICs, כולל צלחות דילול אגר ודילול מרק14. ניתן לבצע דילול מרק במבחנות קטנות או בצלחת מיקרוטיטר של 96 בארות. שיטת לוחית המיקרוטיטר לקביעת MIC המתוארת כאן תאפשר למשתמש לבדוק מגוון רחב של אנטיביוטיקה תוך שימוש במינימום משאבים. הבדיקה מספקת יכולת שחזור כמו גם גמישות במספר האנטיביוטיקה והזנים שנבדקו בשיטה זו. בנוסף, עם שילוב NTBC בבדיקה, המשתמש יכול לקבוע אם חיסול או הפחתה של ייצור פיומלנין משנה את הרגישות לאנטיביוטיקה בחיידקים המייצרים פיומלנין.

ניתן לבחון את תגובת החיידקים לעקה חמצונית במספר דרכים. השיטות הנפוצות ביותר המתוארות הן ספירות ברות קיימא של חיידקים הנתונים ללחץ חמצוני למשך תקופה מסוימת1, או מבחני דיפוזיה של דיסק מתח חמצוני15. שיטות אלו נוטות להשתמש בריכוזים גבוהים של גורמי לחץ חמצוני כדי לבחון את ההשפעות של עקה חמצונית בחיידקים והתוצאות יכולות להיות משתנות למדי בין שכפולים ביולוגיים. בדיקת הספירה הקיימא נוטה גם להשתמש ביותר לוחות אגר מאשר השיטות האחרות. בדיקת לוחית הספוט שאנו מתארים משתמשת בריכוזים נמוכים של H2O2 ומאפשרת למשתמש לבדוק את תגובת העקה החמצונית של זנים מרובים באמצעות מינימום צלחות. הבדיקה ניתנת לשחזור באופן עקבי בין שכפולים טכניים וביולוגיים. מכיוון שפיומלנין מעורב בעמידות בפני מתח חמצוני, שילוב NTBC בבדיקה מאפשר למשתמש לקבוע את ההשפעות של חיסול ייצור פיומלנין על עמידות לעקה חמצונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תרבות מדיה, אנטיביוטיקה, ו2- [2-ניטרו-4 (trifluoromethyl) נזואיל] -1,3-cyclohexanedione (טיפול עם NTBC)

  1. הפוך מרק LB (tryptone 1%, 0.5% תמצית שמרים, 0.25% NaCl בH 2 O) וaliquot לתוך כרכים מתאימים. לעקר על ידי החיטוי. לאחסן בטמפרטורת חדר.
  2. הפוך 100 מיליליטר אגר LB (tryptone 1%, 0.5% תמצית שמרים, 0.25% NaCl, אגר 1.5% בH 2 O) ב 250 מיליליטר צלוחיות. לעקר על ידי החיטוי ולאחסן בטמפרטורת חדר. ודא שאגר הוא נמס לפני המזיגה לצלחות.
    הערה: צלוחיות המכילות אגר LB 100 מיליליטר יניב 4 צלחות. הסכום של אגר LB ניתן לשנות למתאים למספר הצלחות הדרושות עבור assay.
  3. הפוך PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 2 מ"מ KH 2 PO 4) 16. לעקר על ידי החיטוי או סינון ולאחסן בטמפרטורת חדר.
  4. הכן את פתרונות מניות האנטיביוטיקה לגנטמיצין, kanamycin,tobramycin ד.
    1. הכן ריכוזי המניה אנטיביוטיים מתאימים לפ זני aeruginosa המכילים 100 מ"ג / מיליליטר גנטמיצין, 30 מ"ג / מיליליטר kanamycin, ו -10 מ"ג / מיליליטר tobramycin. ממיסים את האנטיביוטיקה במים, סנן לעקר (0.2 מיקרומטר), וחנות על 4 מעלות צלזיוס. לשנות את האנטיביוטיקה וריכוזים בהתאם לחיידק למד.
  5. הכן את פתרונות מניות הטיפול עם NTBC. ממיסים 10 מ"ג בטיפול עם NTBC ב400 μl של DMSO. זה מניב ריכוז של 75.9 מ"מ טיפול עם NTBC. פתרונות מניות טיפול עם NTBC חנות ב -20 ° C. פתרונות הפשרה בטמפרטורת חדר כנדרש.
    יש מקורות שונים בטיפול עם NTBC הבדלים במסיסות: הערה. לקבוע את הרכב המתאים שבי לפזר את הטיפול עם NTBC מבוסס על המלצות היצרן ולהתאים שלב 1.5 בהתאם.

2. טיפול עם NTBC titrations של זני חיידקים

  1. תרבויות לילה הוקמו של הזנים להיבדק. הוסף 2 מבחנת מרק 16 x 150 מ"מ מיליליטר LBים (אחד לכל זן) ולחסן עם 1 מושבה מבודדת מכל זן. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור על הכתף תרבית רקמה בחממת אוויר.
  2. למחרת, להכין titrations בטיפול עם NTBC במרק LB. השתמש במגוון ראשוני 0-900 מיקרומטר טיפול עם NTBC מאז יש לי זנים שונים הבדלים ברגישות לטיפול עם NTBC.
    1. הוסף 1 מיליליטר מרק LB ל4 עד 5 מבחנות (16 x 150 מ"מ) לכל זן.
    2. מוסיף את פתרון הטיפול עם NTBC המניות (75.9 מ"מ) למבחנות (16 x 150 מ"מ) בטווח של ריכוזים. ראה טבלת 1 לריכוזי טיפול עם NTBC וכרכי המניה מקביל להוסיף 1 מיליליטר של מרק LB.
  3. מדוד את OD 600 של תרבויות הלילה. לשטוף תרבויות לפני נטילת OD 600 קריאות לחיסול pyomelanin נוכחי בתקשורת.
    1. שטוף את התרבויות על ידי צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות בmicrocentrifuge ב16,000 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant וכל תאים באופן רופף טבליות עםmicropipettor וresuspend תא גלולה המוצק ביטראות 1 מיליליטר
  4. לחסן צינורות טיטרציה בOD 600 0.05. לחשב את הסכום של תרבות שטפה הדרוש כדי לחסן את הצינורות.
    הערה: השתמש בתרבויות נשטפו לחיסונים מאז pyomelanin לא צריך להיות נוכח.
  5. דגירה צינורות טיטרציה לכ 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור באמצעות מסובב תרבית רקמה בחממת אוויר.
  6. לצלם את צינורות טיטרציה ולהשוות ייצור פיגמנט בתוך ובין הזנים לקבוע את הסכום בטיפול עם NTBC להשתמש עבור מבחני MIC וסטרס חמצונים. השתמש OD 600 קריאות על מנת לקבוע את הסכום של pyomelanin בsupernatant התרבות החופשי תא ולקבוע צפיפות תאים.
    הערה: OD 600 היחס של pyomelanin בsupernatant התרבות לתאים ניתן לחשב לכמת הבדלים בייצור pyomelanin לאחר טיפול בטיפול עם NTBC.

3. אנטיביוטיקה מינימאלית מעצוריםריכוז Assay הטורים (MIC) בצלחות 96-היטב

  1. תרבויות לילה הוקמו של הזנים להיבדק בLB עם ובלי טיפול עם NTBC.
    הערה: פרוטוקול זה מתואר באמצעות רמת הנציג של 300 מיקרומטר טיפול עם NTBC. הרמה המתאימה של טיפול עם NTBC לשמש נקבעה בשלב 2.6.
    1. להוסיף 300 מיקרומטר טיפול עם NTBC 2 מיליליטר ליטראות הוסף נפח שווה ערך של רכב (DMSO) 2 מיליליטר LB למצב לא טיפול עם NTBC.
    2. שימוש בקיסמי סטרילי, לחסן צינורות עם מושבה מבודדת אחד של חיידקים. יהיה תרבות אחת עם טיפול עם NTBC ותרבות אחת ללא טיפול עם NTBC עבור כל זן. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור באמצעות מסובב תרבית רקמה בחממת אוויר.
  2. למחרת, להפוך את LB + טיפול עם NTBC ופתרונות אדון LB + DMSO להקמת assay MIC. להוסיף טיפול עם NTBC בריכוז של 600 מיקרומטר כזה יהיה מדולל שני פי כאשר הבידוד נוסף, מניב ריכוז סופי של 300 מיקרומטר.
    1. כדי לבדוק antibi אחדotic לזן אחד, להוסיף 600 מיקרומטר טיפול עם NTBC 2 מיליליטר LB ולערבב כדי להפוך את פתרון אדון הטיפול עם NTBC. הוסף נפח שווה ערך של רכב (DMSO) 2 מיליליטר LB ולערבב כדי להפוך אין פתרון אדון טיפול עם NTBC. השתמש בפתרונות אלה ליצירת פתרונות מניות אנטיביוטיות, כמו גם להקמת סדרת הדילול ב96-גם צלחות.
      הערה: הניסוחים פתרון האדון יניבו פתרון נוסף כדי להסביר שגיאות pipetting. ניתן לשנות את פתרונות שהאדון למעלה או למטה, כנדרש בהתאם למספר של אנטיביוטיקה וזנים שנבדק.
  3. הכן את הפתרונות אנטיביוטיים בפתרונות אדון LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
    הערה: ריכוז האנטיביוטיקה בפתרונות אלה צריך להיות כפולים הריכוז הרצוי הסופי. פתרון מספיק צריך להיעשות כדי להעביר 100 μl לארבע בארות בצלחת 96-היטב.
    1. הכן גנטמיצין +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 64 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 0.288 μl של מניית גנטמיצין (100 מ"ג / מיליליטר) עד 450μl LB + טיפול עם NTBC או פתרון אדון LB + DMSO.
      הערה: הריכוז המרבי של גנטמיצין לפ aeruginosa PAO1 הוא 32 מיקרוגרם / מיליליטר.
    2. הפוך kanamycin +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 256 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 3.84 μl של מניית kanamycin (30 מ"ג / מיליליטר) לפתרונות אדון 450 μl LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
      הערה: הריכוז המרבי של kanamycin לפ aeruginosa PAO1 הוא 128 מיקרוגרם / מיליליטר.
    3. הכן tobramycin +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 8 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 0.36 μl של מניית tobramycin (10 מ"ג / מיליליטר) לפתרונות אדון 450 μl LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
      הערה: לפ aeruginosa PAO1, את הריכוז המרבי של tobramycin הוא 4 מיקרוגרם / מיליליטר.
      הערה: ניתן להתאים האנטיביוטיקה והריכוזים לחיידקים להיבדק.
  4. להוסיף לכל פתרון אנטיביוטי 2x 100 μl לארבע בארות בצלחת 96-היטב. מניחים את הפתרונים הללו בא השורה לexamplדואר, גנטמיצין צריך להיות ממוקם בA1 דרך A4, kanamycin צריך להיות ממוקם בA5 דרך A8, וtobramycin צריך להיות ממוקם בA9 דרך A12. ראה איור 1 א לתרשים של צלחת 96-היטב להגדיר.
    הערה: ניתן לבדוק אנטיביוטיקה מרובה בצלחת אחת, אבל רק אחת מתח צריך להיבדק לכל צלחת לחסל את הפוטנציאל לזיהום צולב מזנים אחרים.
  5. הוסף 50 μl של פתרון אדון LB + הטיפול עם NTBC או LB + DMSO לשורות 'עד ח' לצלחת 96-היטב. ודא שצלחת אחת הוא LB + טיפול עם NTBC וצלחת אחת היא LB + DMSO. ראה איור 1 א.
    1. השתמש LB + טיפול עם NTBC לאנטיביוטיקה בLB + טיפול עם NTBC. השתמש LB + DMSO לאנטיביוטיקה בLB + DMSO.
  6. שימוש micropipettor לבצע שני דילולים סדרתי של פי האנטיביוטיקה על ידי העברת 50 μl של הפתרון משורה לשורה ב מערבבים את הפתרון, לשנות את הטיפים pipet, ולהעביר 50 μl של הפתרון מהשורה B לחתור חזור ג ל remainiשורות ng. לאחר דילול השורה G, להסיר 50 μl של הפתרון שמהשורה ופסולה. השתמש H שורה כמו אין שליטת אנטיביוטיקה להתפתחות חיידקים. ראה איור 1.
    הערה: כל גם בשורות באמצעות G מכילה כעת 50 μl של אנטיביוטיקה בLB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO ב2X הריכוז הרצוי הסופי. שורת H מכיל LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO ללא אנטיביוטיקה.
  7. מדוד את OD 600 של תרבויות הלילה. לשטוף את כל התרבויות לפני נטילת OD 600 קריאות לחיסול pyomelanin הנוכחי בתקשורת.
    1. שטוף את התרבויות על ידי צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות בmicrocentrifuge ב16,000 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant עם micropipettor וresuspend התא גלולה ביטראות 1 מיליליטר
  8. לדלל את תרבויות הלילה ל2.75x10 5 / מיליליטר CFU ביטראות
    הערה: תניח שיחידה אחת OD 600 היא המקבילה של 1x10 9 CFU / ml לפ aeruginosa. OD לCFU / המרות מיליליטר ניתן הייתifferent בחיידקים אחרים.
  9. הוסף 50 μl של תרבות חיידקים בדילול ולמתאים.
    הערה: תרבויות גדלו בטיפול עם NTBC יש להוסיף לבארות המכילות טיפול עם NTBC ותרבויות גדלו בDMSO יש להוסיף לבארות המכילות DMSO. ראה איור 1.
    1. להוסיף חיידקים לשלוש בארות עבור כל זן וריכוז אנטיביוטיקה. הוסף 50 μl של LB ולרביעי לפעול כביקורת לזיהום חיידקים. ראה איור 1.
    2. השתמש micropipettor רב-ערוצים לחסן את הבארות. ודא שpipet טיפים הם קרובים לתחתית של הבארות בעת הוספת הבידוד על מנת למנוע זיהום של בארות הסמוכות.
      הערה: הוספת תרבית חיידקים לבארות יהיה לדלל את ריכוזי אנטיביוטיקה וטיפול עם NTBC שני קיפול.
  10. מכסה את 96-גם הצלחות עם parafilm ודגירה כ 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. דגירה 96-גם צלחות באופן סטטי, בחממת אוויר.
  11. בדוקהצלחות להתפתחות חיידקים בבארות. MIC הוא הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה שבאין צמיחת חיידקים נתפסת לכל שלושת משכפל של כל זן.
    1. מבחינה ויזואלית לבחון את הצלחת לצמיחה או לקרוא באמצעות קורא צלחת קבוצה לOD 600.

Assay פלייט 4. ספוט לתגובה לחץ חמצוני

  1. תרבויות לילה הוקמו של הזנים להיבדק בLB עם ובלי טיפול עם NTBC כמתואר בשלב 3.1.
  2. למחרת, להכין צלחות אגר LB המכילות H 2 O 2 כלחץ חמצוני. מגוון של H 2 O 2 ריכוזים 0-1 מ"מ הוא נקודת התחלה טובה.
    1. ממסים את צלוחיות אגר LB. תקשורת מגניב כ 50 מעלות צלזיוס בטמפרטורת חדר.
    2. להוסיף H 2 O 2 ישירות לתקשורת מקוררת בריכוזים הרצויים. צלוחיות מערבולת לערבב. ראה טבלה 2 לריכוזים של H 2 O 2וכרכים של H 2 O 2 המרוכז להוסיף. ערכים אלה מבוססים על של אגר LB 100 מיליליטר.
    3. יוצקים צלחות מייד לאחר הוספת H 2 O 2 ולהבת פני השטח כדי להסיר בועות. התשואה היא 4 צלחות לשל אגר LB 100 מיליליטר. סמן את הצלחות עם ריכוז H 2 O 2.
    4. מקם את הצלחות שנחשפו בזרימה מכסה המנוע ביולוגי עם המאוורר פועל למשך 30 דקות כדי להסיר לחות עודפת מהצלחות.
      הערה: השתמש בצלחות באותו היום הם מוכנים. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום לנתונים לא עקביים.
      הערה: לחץ חמצוני כגון paraquat ניתן להחליף לH 2 O 2 בassay זה. הריכוזים המשמשים לגורמי דחק חמצוני אחרים עשויים להיות שונים מאלה ששימשו לH 2 O 2.
  3. לשטוף ולמדוד את OD 600 של תרבויות הלילה כמתואר בשלב 3.7.
  4. לנרמל את OD 600 של כל מ"ק הלילהltures לערך הנמוך ביותר לקבוצה של זנים שנבדק. פ aeruginosa בדרך כלל יש OD 600 של כ 2.5 כאשר גדלו הלילה בLB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
    1. לקבוע את עוצמת הקול של התרבות צריכה לדלל את התרבות לOD הנמוך ביותר 600 בהיקף כולל של 1 מיליליטר. לדוגמא, אם יש תרבות OD 600 של 3 וOD הנמוך ביותר 600 לקבוצה של זנים הוא 2.5, לבצע את החישוב הבא: (2.5) (1 מיליליטר) = (3) (x). x = .833 מיליליטר. .833 מיליליטר של התרבות יוצב בצינור microfuge.
    2. לחשב את הסכום של LB + טיפול עם NTBC (300 מיקרומטר) או LB + DMSO צריך להביא את תרבות נפח 1 מיליליטר. לדוגמא בשלב 4.4.1, הסכום של LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO הוסיף לתרבות יהיה .167 מיליליטר (1 מיליליטר נפח כולל - .833 מיליליטר תרבות). הפוך פתרונות מניות של LB + טיפול עם NTBC וLB + DMSO לשימוש עבור דילולים אלה בהתבסס על הנפח הדרוש לדילול כל הזנים.
    3. מערבבים את התרבות וLB + NTBC או LB + DMSO ידי vortexing.
  5. כדי לשמור על תרבויות בריכוז קבוע בטיפול עם NTBC או DMSO, לבצע עשרה דילולים סדרתי של פי תרבויות הלילה המנורמלת בPBS + טיפול עם NTBC או PBS + DMSO.
    1. הפוך פתרונות מניות של PBS + טיפול עם NTBC וPBS + DMSO. לקבוצה אחת של דילולים לזן אחד, לערבב טיפול עם NTBC מיקרומטר 300 או נפח שווה של DMSO עם PBS להניב בנפח כולל של 720 μl. קנה מידה של מניות אלה למעלה או למטה, תלוי כמה זנים נבדקים.
    2. צינורות microfuge תווית עבור 10 -1 בדילולים 10 -7 סידוריים. להוסיף 90 μl של PBS + טיפול עם NTBC או PBS + DMSO לצינורות המתאימים. השתמש PBS + טיפול עם NTBC לזנים גדלו בLB + טיפול עם NTBC ולהשתמש PBS + DMSO לזנים גדלו בLB + DMSO.
    3. הוסף 10 μl של תרבות לצינור הדילול המתאים 10 -1. מערבבים על ידי vortexing ולהעביר 10 μl של דילול 10 -1 לצינור דילול 10 -2. חזור על פעולה עד כל דילולים היו performed. לשנות טיפים pipet בין דילולים.
  6. 5 μl ספוט של 10 -3 דרך 10 -7 דילולים על 2 O 2 צלחות LB + H בשני עותקים עבור כל זן. השתמש בקצה pipet אחד אם כתמים הם מצופים מרוב לדלל לדלל לפחות (10 -7 עד 10 -3). לא להטות או להטות את הצלחת עד שהנוזלים התייבשו לתוך הצלחת.
  7. דגירה הצלחות במשך 24-48 שעות על 37 מעלות צלזיוס (חממת אוויר), בהתאם לזן.
    הערה: פ aeruginosa PAO1 תהיה מושבות בגודל טובות על LB לאחר 24 שעות של דגירה. דגירה זנים עד שיש להם מושבות בערך באותו הגודל כמו PAO1.
  8. לצלם את הצלחות באמצעות מצלמת CCD מעל transluminator. לחלופין, לערוך את התמונות לניגוד ויבול באותו הגודל. לספור את מספר המושבות בכל מקום כדי לקבוע שינויים ברגישות ללחץ חמצוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

titrations טיפול עם NTBC

Titrations הטיפול עם NTBC שימש כדי לקבוע אם הטיפול עם NTBC היה מסוגל להפחית את ייצור pyomelanin בפ aeruginosa, וגם לזהות את הריכוז בטיפול עם NTBC שמבטל או מקטין pyomelanin ייצור לשימוש במבחנים נוספים. ייתכנו שינויים ברמות של pyomelanin מיוצר בחזרות שונות, אבל מגמות כלליות יישארו קבועות. Assay טיטרציה הטיפול עם NTBC גם יכול להיות שונה כדי לבדוק את תרכובות אחרות שעשוי להשפיע על ייצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטת הטיטרציה של NTBC המתוארת בפרוטוקול זה תאפשר למשתמש לקבוע אם NTBC יכול להפחית או לחסל את ייצור הפיומלנין בחיידקים, ולקבוע את ריכוז ה-NTBC הנדרש. השלב הקריטי ביותר בבדיקת הטיטרציה של NTBC הוא קביעת טווח ריכוזי ה-NTBC לשימוש בבדיקה. לזנים שונים של P. aeruginosa יש רגישויות שונות ל-NTBC, וזני מעבדה עשויים להיות רגישים יותר ל-NTBC מאשר מבודדים קליניים12 (איור 2). לכן, יש צורך לבדוק טווח של ריכוזי NTBC עבור כל זן הנבדק. רצוי להתחיל בריכוזים נמוכים יותר ולהגדיל לריכוזים גבוהים יותר לפי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים מודים לדארה פרנק וקארי הארווד על תרומתם הנדיבה של הזנים. קרן המחקר של אוניברסיטת ויסקונסין מילווקי מחזיקה בפטנט מס' 8,354,451; עם טענות המכוונות באופן נרחב לטיפול או עיכוב התקדמות זיהום של מיקרואורגניזם בחולה על ידי מתן תרכובת מעכבת 4-הידרוקסיפנילפירובאט דיאוקסיגנאז כגון 2-[2-ניטרו-4-(טריפלואורומתיל)בנזויל]-1,3-ציקלוהקסנדיון (NTBC). הממציאים הם גרהם מורן ופאנג הה. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R00-GM083147). ספריית המוטאנטים של אוניברסיטת וושינגטון P. aeruginosa transposon נתמכת על ידי NIH P30 DK089507.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-[2-ניטרו-4-(טריפלואורומתיל)בנזויל]-1,3-ציקלוהקסנדיון (NTBC)סיגמא-אולדריץ'SML0269-50 מ"גנקרא גם ניטיסינון.  מסיס ב-DMSO.
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30 wt. % in H2O.  התייצב.
GentamicinGold BioG-400-100מסיס ב-H2O.  מסננים לעקר.
KanamycinFisher ScientificBP906-5מסיס ב-H2O.  מסננים לעקר.
TobramycinSigma-AldrichT4014-100MGמסיס ב-H2O.  מסננים לעקר.

מקורות

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092(2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NTBCMICSpot PlatePseudomonas Aeruginosa

מאמרים קשורים