מאמר שיטה

הערכת רגישות התנהגות נגרמת קוק העדפות מקום אלפו עכברים

17.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53107

⸱

18 בפברואר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, McLean Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה נועד לאפשר לחוקרים לערוך ניסויים שנועדו לבחון היבטים אלה של התמכרות באמצעות מבחני העדפת מקום מותנית ורגישות התנהגותית תנועתית.

תקציר

נהוג לחשוב שחוויות מתגמלות עם סמים יוצרות אסוציאציות הקשריות חזקות ומעודדות צריכה חוזרת. בתורם, חשיפות חוזרות ונשנות לסמים גורמים לשינויים מתמשכים בתפקוד המוח של אנשים פגיעים, ושינויים מתמשכים אלה ככל הנראה משמשים לשימור ההתנהגויות הבלתי מסתגלות של חיפוש ונטילת סמים האופייניות להתמכרות/תלות2. במכרסמים, חווית תגמול ואסוציאציות קונטקסטואליות נמדדות לעתים קרובות באמצעות בדיקת העדפת מקום מותנית, או CPP, שבה נמדדת העדפה להקשר שזווג בעבר לתרופה. רגישות התנהגותית, לעומת זאת, היא עלייה בהתנהגות הנגרמת על ידי סמים המתפתחת בהדרגה במהלך חשיפות חוזרות ונשנות. מכיוון שלעתים קרובות ניתן למדוד התנהגויות רגישות לאחר מספר חודשים של הימנעות מסמים, בהתאם למינון ומשך החשיפה הראשונית, הן נחשבות למתאמות נצפות של פלסטיות מתמשכת הנגרמת על ידי תרופות. חוקרים מצאו שבדיקות אלה שימושיות בקביעת המצעים הנוירוביולוגיים המתווכים היבטים של התמכרות, כמו גם בהערכת הפוטנציאל של התערבויות שונות בשיבוש התנהגויות אלה. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים בסיסיים ויעילים עבור CPP של עכברים ורגישות התנהגותית תנועתית לקוקאין.

מבוא

מחקר שמטרתו להבין התמכרות לסמים באמצעות מודלים של בעלי חיים חייב לנקוט במגוון גישות כדי לטפל בכל אחד מהמרכיבים המגוונים החוסמים את הצלחת הטיפול, כולל תגמול/חיזוק/מוטיבציה ונסיגה ונסיגה, כמו גם ההתמדה הכללית שמסבכת עוד יותר את הנושאים הללו בהתמכרות. מאחר שחוויות מתגמלות הקשורות לנטילת סם נחשבות כמניעות לשימוש לאחר מכן, מחקרים המתמקדים באסוציאציות של הקשר לסמים עשויים להיות שימושיים במיוחד להבנת מנגנוני המוח התורמים לנטילת סמים ולחיפוש אחר סמים. אחת כזו, העדפת מקום מותנית (CPP) היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה להשוואת הבדלים בין קבוצות ברגישות לתגמול. הפרשנות המסורתית של המשימה כוללת התניה קלאסית, או פבלובית, שבה גירוי מותנה (CS) משויך לגירוי בלתי מותנה (UCS), ולאחר זיווגים מרובים, ה-CS מעורר את אותה התנהגות כמו ה-UCS (עם זאת, ראה39,40). תיאורטית, בעלי חיים לומדים לקשר מצב אינטרוספטיבי (תגמול או סלידה) עם רמזים הקשריים. לאחר מכן מוערכת העוצמה היחסית של המצב האינטרוספטיבי על ידי קביעת העדפת החיה לרמזים ההקשריים. השימוש בהתניה במקום למדידת קשרים בין תרופות לתגמול החל ב-1957 לפחות, במחקר שהשתמש במורפיום על חולדות במבוך Y3,4. במהלך העשורים האחרונים, וריאציות על שיטה זו היו בשימוש נרחב כדי לחקור העדפת מקום וסלידה במכרסמים מגירויים שונים, והיא נותרה שימושית במיוחד בחקר אסוציאציות הנגרמות על ידי סמים ממכרים. במחקר על התמכרות לסמים, נעשה שימוש במבחן כדי להעריך את התכונות המתגמלות של מספר תרופות ואת התרומה של מערכות מוח וחלבונים שונים לתגמול על סמים (לביקורות, ראה5-7,44). בעוד שישנן שיטות מעולות להערכת גורמים התורמים להתמכרות לסמים, כלומר מתן עצמי של סמים, CPP היא גישה פשוטה ונגישה הרבה יותר למדידת תפקוד התגמול.

רוב הפרוטוקולים הנוכחיים להעדפת מקום מותנה וסלידה (CPA) משתמשים במנגנון המאפשר למכרסמים גישה לשני תאים נפרדים, דרך פתח או תא חיבור קטן יותר. ההבחנות בין שני התאים מבוססות לעתים קרובות, לכל הפחות, על רמזים חזותיים ומישושיים, כולל צבע הקיר ומרקם הרצפה, אך לפעמים כוללות אלמנטים אחרים, כגון רמזי ריח. עיצובים "מוטים" מנסים בדרך כלל להפוך העדפה מולדת קיימת לחדר אחד על פני השני, כמו זה שמכרסמים מראים בדרך כלל לחדר שחור על פני לבן. עיצובים "בלתי מוטים" שואפים ליצור העדפה לאחד משני חדרים שהיו בתחילה מושכים באותה מידה על ידי הקצאת איזון אקראית לכל אחד מהחדרים בתוך קבוצה. עיצוב "מאוזן" משמש כאשר בעלי חיים מראים העדפות קטנות, אך כקבוצה אינם מעדיפים את אותו תא. המטרות של תכנון אחרון זה הן לייצר 1) ציוני העדפה לפני המבחן עבור תא הזוגות (בסופו של דבר) של קוקאין שאינם שונים באופן משמעותי בין קבוצות הניסוי ו-2) העדפה זניחה לתא המזווג עם קוקאין במבחן המקדים, חיובי או שלילי8. העיצוב המאוזן אידיאלי לשימוש עם התאים המתוארים, המשתמשים בהטיות סותרות לצבע הקיר (שחור על פני לבן) וריצוף (חוט מעל מוט), וכתוצאה מכך חלוקה שווה בערך של העדפות קטנות הן לצד השחור והן לצד הלבן בבעלי חיים שונים. חישובי איזון מתוארים בפירוט נוסף להלן.

במהלך התניה, בעלי חיים נחשפים לתרופה ומוכנסים במהירות לאחת משתי הסביבות הללו לפרק זמן מוגבל. החשיפה היא בדרך כלל באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p.) או לפעמים תת עורית (s.c), אם כי פותחו גם פרדיגמות למתן עצמי תוך ורידי (i.v.)9, ועירויים תוך גולגולתיים38 במנגנון העדפת מקום. זיווגים אלה משלימים על ידי זיווגים שאינם תרופות (רכב) באותו אורך המתבצעים בתא הנגדי, שיכולים להתרחש באותו יום כמו זיווגי תרופות או בימים נפרדים. באופן כללי, כאשר נותנים להם לחקור את המנגנון לאחר התניה, בעלי חיים יבלו זמן רב יותר במקום שבו הם קיבלו תרופה מתגמלת (כלומר, כזו שבני אדם ובעלי חיים יתנו בעצמם מרצונם), בעוד שהם יימנעו ממקום שבו הם קיבלו תרופה שגרמה למחלה (למשל, ליתיום כלוריד). מספר מחקרים הוקדשו לאופטימיזציה של התנאים להעדפת מקום על פני סמים שונים (לסקירה, ראה7). מינוני קוקאין (i.p.) לעכברים נעים בדרך כלל בין 1 ל-20 מ"ג/ק"ג, כאשר מינונים של פחות מ-5 מ"ג/ק"ג משמשים לעתים קרובות לניתוח רגישות גבוהה בקבוצה אחת. בדרך כלל נדרשים שני זיווגים או יותר של תרופות עבור עכברים בוגרים10, ואורך הזיווגים הללו הוא שיקול חשוב. מינונים נמוכים מאוד של קוקאין דורשים התניה מיידית וקצרה, ככל הנראה מכיוון ששיטה זו לוכדת את התקופה המתגמלת ביותר של החשיפה. תקופות התניה מאוחרות או ארוכות מאוד עלולות לגרום ללא העדפה, או אפילו עלולות לגרום לסלידה11,12. כאן מוצגת שיטה בסיסית להשגת העדפת מקום מותנית לקוקאין בעכברים בוגרים.

בעוד שבדיקת CPP היא שיטה אידיאלית להערכת למידה וזיכרון הקשורים לתגמול של אסוציאציות בהקשר תרופתי, ניתן לטעון שרגישות התנהגותית קלה יותר לביצוע ומאפשרת הערכה של שינויים המתפתחים במהלך טיפול חוזר. ידוע גם בשם סובלנות הפוכה, התנהגויות העוברות רגישות מוגברות בהדרגה על ידי חשיפות חוזרות ונשנות לסם מסוים, במיוחד פסיכוסטימולנטים, וידוע כי רגישות צולבת מתרחשת בין חלק מהתרופות הללו, אך לא כולן. אחת ההערכות הראשונות של רגישות תנועתית הנגרמת על ידי קוקאין, בפרט, במכרסמים פורסמה ב-197613. מספר מעבדות הראו כי תנועה רגישה ניתנת לזיהוי זמן רב לאחר הפסקת התרופה, בהתאם לאורך, מיקום ומינון החשיפה המקורי14-17, והפרוטוקול הנוכחי שימש לאיתור רגישות למשך 10 חודשים לאחר שבעה ימים (30 מ"ג/ק"ג) של טיפול בקוקאין בעכברים18. ניתן לבצע את הבדיקה באמצעות טכנולוגיות פוטו-קרן או מעקב וידאו, במכשירים בגדלים וצורות שונות, מה שמקל על מעבדות רבות לבצע אותה. האופי החזק, הפשטות וההתמדה של רגישות תנועתית הופכים את הערכתה לחלק אידיאלי בבחינת מנגנונים בסיסיים של שינויים ארוכי טווח בהתנהגות הנגרמת על ידי תרופות.

כפי שהורחב בדיון, שיקול חשוב בעת ביצוע בדיקת רגישות תנועתית הוא האם התרופה ניתנת בסביבת הבית או כלוב הבדיקה. כדי לנצל את הרגישות החזקה המתרחשת כאשר מתן תרופות מתרחש מחוץ לכלוב הביתי, פרוטוקול זה משתמש בשיטה זו. עם זאת, נצפה שכאשר בעלי חיים אינם מורגלים כראוי לסביבה חדשה לפני חשיפה לסמים, מתרחשת אפקט תקרה המושרה על ידי חידוש ביום הראשון, שיכול להסוות באופן חלקי או מלא את האופי המתקדם של הרגישות. סביר להניח שזה מייצג השפעות סינרגטיות מפעילות תנועה של התרופה יחד עם חידוש, ובעוד שהמנגנונים העומדים בבסיס השפעות כאלה עשויים להיות מעניינים, השיטה המתוארת נועדה להפחית את תפקיד החידוש ולאפשר למדוד את השפעות התרופה באופן עצמאי יותר. בעוד שצפוי ששיטה זו תהיה שימושית בהערכה של תרופות אחרות הרגישות לתנועה, היא העריכה בעיקר את יעילותה עם קוקאין בעכברי C57BL/6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית החולים מקלין ושימוש. הערה: הפרוטוקול הבא מתאר גישה יחידה CPP ולרגישות של תנועה, פרטים רבים אשר נבדלים פרוטוקולים מצליחים אחרים (למשל, האור לעומת בדיקות כהה שלב ורצופים לעומת המינון לסירוגין, וכו '). טירונים מומלצים להתחיל עם פרוטוקולים אלה, או פשוט להשתמש בם כמדריכים, התאמה שינויים מהספרות על בסיס שאלה הניסיון (ים) בהישג יד. שיטות מדידות אוטומטיות מתוארות; עם זאת, ניתן להשתמש באמצעים לא-אוטומטיים עבור כל assay (כלומר, הקלטת וידאו, יד-ניקוד).

1. העדפות מקום אלפו

  1. ציוד חדר Set-Up:
    1. טפל עכברי הניסוי במשך 1-3 דקות כל יום, לפחות 3-5 ימים לפני הבדיקה.
      הערה: לעולם אל ידית עכברים עלולים למצוא סילוק מן stre הקאמריתssful, אשר יכול להפריע או לשנות מיזוג.
    2. השג ארבעה או יותר מנגנוני CPP תלת תאי, רצוי מצוידים photobeams עבור איסוף נתונים אוטומטיים 18. ודא כי כל תא יש שני, visually- גדולים במישוש-מובחנים תאי התחברות בתא קטן, ניטראלי דרך דלתות שניתן מגייסת / וריד כדי לשלוט בגישה. מכסים על כל תא צריך לפתוח להכנסה / הסרה של עכברים להיות מותקן עם קטן, בנפרד לשליטה אורות (dimmable) (אחד לכל תא).
      הערה: עיצובי תא CPP להשתנות וניתן לרכוש מסחריים או נבנה על ידי חוקרים. עבור העיצוב "המאוזן", תכנית מומלצת הוא תא אחד גדול עם קירות לבנים ורצפת רשת תיל ושני עם קירות שחורים וריצוף בר. התא באמצע צריך קירות אפורים ריצוף אפור פרספקס מוצק. לצורך הסבר, תאים אלה ייקראו בשם "לבן", "שחור" ו "באמצע".מכסים צריכים להיות ברורים פרספקס. תצורות תא חלופיות (אחת או שתי קאמרי) גם אפשריות ודנו במקום אחר (ראה דיון).
    3. הגדרה בחדר כפי שיהיה במהלך בדיקה: לכבות או להגדיר אור מעל שולחן כדי הגדרת dimmest ולסגור את הדלת. השתמש מד אור בתוך כל תא ולהגדיר את האורות המכסות כך תאי באמצע בהיר מעט (15-20 לוקס) מאשר תאי בשחור לבן (6-10 לוקס) כדי להרתיע עכברים מן לבלות שם.
      הערה: אם משך הזמן הממוצע באמצע הוא פחות או יותר מאשר בתאי שחור או לבן, להגביר עוד יותר את הניגוד תאורה המתואר בשלב 1.1.3. לחלופין, להשתמש ריצוף פחות מושך עבור באמצע. (למשל, ~ 220 0.5 סנטימטרים חורים בקוטר, מחולק באופן שווה ב 6 x 3.5 x ¼ "פרספקס), אך להימנע קאמרי זו מרתיעה. פיילוט ביצוע שינויים על מנת להבטיח כי ירידות הזמן בינוני אינם נובע פוחתים בחיפושי כולל (מעברים) .
    4. Program איסוף נתונים אוטומטי ( "נוהל," איור 1 א) או באופן ידני לאסוף נתונים על פי הפרמטרים הבאים. ניסויי סט להתחיל על הפסקת הקורה הראשונה בחדרו או מיזוג. "בדיקה" קבע הפעלות להיות 20 דקות אורך ו לעקוב אחר השקיע זמן קורה הפסקות בתא אחד. גדר פגישות "מיזוג" להיות 30 דקות ארוכות (אופציונאלי) כדי למדוד הפסקות קרן בתא אחד. כוון את כל האורות הקאמריות להאיר במהלך המשפט.
    5. כן נפח מלא של פתרון קוק הנדרש לצורך ניסוי בהישג יד. ממיסים קוקאין HCl ב 0.9% NaCl (מלח), מבסס את הריכוז הסופי על נפח הזרקה של משקל הגוף 0.1 מ"ל / 10 גרם (למשל, מנה של 5 מ"ג / ק"ג, ריכוז הפתרון הוא 0.5 מ"ג / מ"ל). תערובת וורטקס למשך 30-45 שניות, סינון סטרילי (0.2 מסננים מזרק מיקרומטר) ולאחסן ב RT.
  2. בדיקה:
    ההערה: ציר הזמן הכללי CPP הוא PRE-TEST, מיזוג, ואז POST-TEST. מבחן-מראש ניתן להפריד מיזוג ידי 1-3 ימים; עם זאת, מיזוג וביום שלאחר בדיקה צריך להתבצע על ימים רצופים (איור 2 א). התזמון הזה צריך להישמר זהה עבור כל הקבוצות באותה הניסוי.
    1. מבחן בשלב האור 'חיות באמצעות אותו מנגנון עבור כל חיה על פני ימים.
    2. כל יום ניסיון (כלומר, בדיקות וחוות ימים מיזוג), להעביר עכברים אל חדר ההמתנה התנהגותי ולאפשר להם לשבת באין מפריע בכלובים בביתם 1-1.5 שעות לפני המשפט. בחר את המיקום שבו עכברים ניתן להעביר במהירות מהכלוב שלהם למנגנון, עם הפרעה מזערית, כשהמשפט מתחיל. הפעל את כל הציוד כך שכל רעשים הקשורים הבדיקה (למשל, אוהדי ציוד) נוכחים.
    3. ניקיון יסודי בכל מנגנון (קירות פנימיים, ריצוף ומגשים) עם קלה, אלכוהול, גליקול-ether- או אמוניה מבוססת וחיטוי מגבונים לפני ואחרי כל עכבר (השתמש סםסוג דואר של מנקה לאורך הניסוי). האם לא תחתון ריצוף הזנחה.
    4. בדוק כי אורות בחדר מוגדרים כראוי (כבוי או מעומעם) בתחילת כל יום.
    5. להמשיך עם הבאות בהתאם אם זה יום "מבחן" או "מיזוג":
      1. לדין ימים 1 ו -6 (כלומר, לפני ואחרי בדיקות פוסט), הציבו את דלתות תא היתר במצב פתוח (איור 2 ב).
      2. טען את תוכנת מחשב "מבחן" וזן מזהי חי (איור 1 א), ולאחר מכן להנפיק הפקודה להתחיל (איור 1B), אם זה אפשרי.
      3. בעדינות נמוך כל עכבר לתא באמצע מנגנון שהוקצה לו, פניו אל הקיר האחורי, ואת ברכות לסגור את המכסה. לאחר שכל התאים נטענים, עזוב את חדר הבדיקות למזער את הרעש.
      4. השאירו עכברים בתוך כל המנגנון עד ניסויים עבור כל העכברים נסגרו / הסתיים (איור 1 ג). נתוני ניסויים ייצוא.
    6. זמן קצר לפני או לאחר בדיקה מקדימה, לשקול את החיות. השתמש משקולות אלה לחישובי מינון במהלך מיזוג.
    7. על מנת להתכונן ניסויים מיזוג, לחשב כל "העדפה" לפני הבדיקה של העכבר לתאי בשחור לבן על ידי הפחתת הזמן המושקע בכל אלה מן האחר (כלומר, "לבן מינוס שחור" & "שחור מינוס לבן", ראה איור 3, עמודים 9 & 10).
    8. מאז עכברים עם העדפות ראשוניות חזקות לעשות איזון קשה, להקים גבול מקובל ציוני העדפה (למשל, <33% מזמן משפט בסך הכל) ואינם כולל עכברים חורגים ממנה מהחישובים. להשתמש בתקרת ליברלית (<66% מזמן משפט בסך הכל) על מנת למקסם את ההכללה כאשר התשה סבירה לאחר הבדיקה יושלם (למשל, עקב מניפולציות כירורגית מחוץ יעד).
      הערה: עכברים העולים על מגבלה יכול עדיין להיבדק, בניסיון לשמור ההעדפות מראש הבדיקה שלהם מאוזנים. מאוחר יותר, tעכברים hese ניתן לשלול מניתוח, במידת הצורך, כדי לאזן ציונים לפני הבדיקה. אם הטיות בדיקה מראש קיצוניות (כלומר,> 800 שניות) פרופורציונליות להשפיע קבוצה אחת, שקול לשנות את סביבות מיזוג ו / או באמצעות מבחני אחרים.
    9. בחר את התא השחור או לבן כמו תא תרופת הזיווג עבור כל עכבר, בינתיים סיכום ציוני העדפה מראש המבחן המתאים בתוך כל קבוצה עם סדר העדיפויות שלהלן:
      הערה: תשמור על עצמך כדי לאזן ציוני בין קבוצות בתוך כל קבוצה, כמו גם על פני כל מחזורים קודמים.
      1. הפוך את הסכומים עבור כל קבוצות כמקבילה ככל האפשר.
      2. הפוך את הסכומים קרובים לאפס ככל האפשר (כלומר, בוחר את הצד המועדף עבור כמה עכברים והצד שאינו מועדף עבור אחרים). אם הסכום אפסי הוא בלתי אפשרי עבור כל קבוצת נתונה, להתאים מחדש את כל לאחרים מתאימים במדויק את התוצאה הטובה ביותר שניתן להשיג עבור הקבוצה המגבילה, לטובת קבוצה שלילית במקצת מסכם מעלחִיוּבִי.
      3. ככל ריאלי, לשמור הקצאות של שחור נגד לבן והעדיף לעומת תאים שאינם מועדפים עבור זיווגי תרופה אפילו בתוך כל קבוצה.
      4. כמו כן, הוא לא תמיד אפשר לעמוד ביעדים הנ"ל, לתקן סטיות כל על ידי ביצוע שיקולי איזון מנוגדים בתוך מחזורים מאוחר יותר; עם זאת, מנסה להימנע לייצר קבוצות עם העדפות מראש מבחן ממוצע שונה לחלוטין.
    10. על מיזוג ימים 2-5, למקם דלתות תא היתר במצב סגור (איור 2 ג).
    11. כן מזרקי פרט עם קוק (ימים 2 ו -4) או מלוח (ימים 3 ו -5) פתרון, כמתואר שלב 1.1.5 ועל סמך משקולות גוף הנמדדים בדיקה מקדימה.
      הערה: מנה צריך להיבחר ביחס לציפיות ניסיוני, שיקולים שהוזכרו במבוא, ואפקטי רצפה ותקרה פוטנציאליים. זה בדרך כלל טוב ביותר לנהל ניסויים בלתי תלויים באמצעות לפחות שתי מנות שונות.
    12. טען "גonditioning "תוכנת מחשב וזן מזהי חי (איור 1 א), ולאחר מכן להנפיק להתחיל פקודה (איור 1B), אם זה אפשרי.
    13. בעורף ולהזריק כל עכבר (IP), מייד הוריד אותם לתוך תא שחור או לבן המתאים של מנגנון שהוקצה להם מול הקיר אחורי, אז בשקט לסגור את המכסה. לאחר שכל התאים נטענים, עזוב את חדר הבדיקות למזער את הרעש.
    14. סור עכברים מהחדר שלהם קרובים בדיוק 30 דקות ככל האפשר (כלומר, העכברים הראשונים יוסרו מלשכתו שלהם ואילו עכברים אחרים הם עדיין מתנה). סר חי בשקט ככל האפשר, ללא החדרת רעש.
  3. ניתוח סטטיסטי:
    1. בחר שיטת ניתוח. כך או לחסר משך הזמן בצד לזווג המלוח במהלך שלאחר בדיקת מעת בילה בצד לזווג הקוק במהלך שלאחר הבדיקה (הקוק - מלוח, שניות) או לנצל את הזמן בילה בתא הסמים לזווג שלאחר בדיקהפחות זמן מראש הבדיקה בילה על חדר הסמים לזווג.
      הערה: אם אתה משתמש בשיטה הראשונה, גם קו העלילה גרפים של משך הזמן הממוצע באמצע, saline- סמים לזווג תאי במהלך טרום ופוסט בדיקות לכל קבוצה. בהשוואת הבדיקה מראש, שלאחר הבדיקה צריך להראות זמן הגדיל את הצד לזווג התרופה וירידת זמן מושקע בצד לזווג המלוח (ראה איור 6, תחתון, ודיון להסבר).
    2. בהתאם לאופי ומספר הקבוצות מושווים, להשתמש מבחן t, חד-צדדי או דו סטרי ANOVA, לפי העניין, ואולי עם ניתוח פוסט הוק, לנתח או של ציוני חיסור הנ מוצג.
      הערה: עשרות העדפת קוק נוטים להיות משתנה, ויתר על כן, יכולים להיות שלילי (כלומר, מצביעים סלידה בצד לזווג סמים). עכברים להראות סלידה אין להסירו (אלא אם כן הם חריגים סטטיסטיים), מאז תוצאה זה נורמלי וחשוב סביר בקביעת הבדלים בין הגרoups. שאזדקק גודל מדגם של 12 עד 30 בעלי חיים לכל קבוצה, תלוי בגודל שפעת הטיפול.

2. רגישות של תנועה

  1. ציוד חדר Set-Up
    1. השג מערך photobeam 4 x 8 (X x Y) (מידות מחוץ 11.5 "x 20"). לבנות תא עם גג פתוח עשוי פרספקס שחור (מידות פנימיות 22 1/6 "x 13 ¾" x 9 3/8 ") כדי לשכן את המערך (האיור 4 א).
    2. הכן לחדר הבדיקה, כך אור אדום (תקרה או קיר רכוב) יכול לשמש במהלך הבדיקה.
    3. כן הפעלות תכנית נפרדת לניסויי הרגלה ו זריקה יומית.
      1. ניסויי הרגלה מוגדרים להיות בין 30-60 ניסויי דקות הזרקה להיות בין 60-120 דקות (איור 5). האורך המומלץ עבור כל 60 דקות. שמור אורך משפט עקבי לאורך מחזורים מרובים באותו הניסוי.
      2. ניסויי סט להתחיל recording על הפסקת הקורה הראשונה המתרחשת לאחר אות ההתחלה כבר יזם (איור 5). לצורך הניסוי הזרקת, להגדיר את אות תחילת כך תיבות ניתן להתחיל בנפרד (לא ביחד), במידת האפשר.
      3. הפסקות קרן סט שתירשמנה ב המוגדרים על ידי המשתמש "פחים" רצוי 5 דקות כל אחד (איור 5).
    4. כן נפח מלא של פתרון קוק הנדרש לצורך ניסוי בהישג יד. ממיסים קוקאין HCl ב 0.9% NaCl (מלח), מבסס את הריכוז הסופי על נפח הזרקה של משקל הגוף 0.1 מ"ל / 10 גרם (למשל, מנה של 5 מ"ג / ק"ג, ריכוז הפתרון הוא 0.5 מ"ג / מ"ל). תערובת וורטקס למשך 30-45 שניות, סינון סטרילי (0.2 מסננים מזרק מיקרומטר) ולאחסן ב RT.
  2. בדיקה
    הערה: השלב הראשוני של בדיקות פועל במשך 10-11 ימים רצופים. עכברים לקבל שני ניסויים יומיים: הרגלה (הזרקה-חינם) והזרקה. נהל מלוחים במשך שלושת הראשונים fבימינו (ראה דיון על החשיבות של התרגלות מלוחים), וקוקאין בשבע הבא תוך שימוש באותו מינון (למשל., 15 מ"ג / ק"ג / יום).
    1. כל יום, להסתגל עכברים בכלובים בביתם אל חדר ההמתנה התנהגותיים למשך 30 דקות עד 1 שעה.
    2. הכן עכבר בגודל סטנדרטי נקי כלובים דיור אקרילי שקוף עם שכבה דקה מאוד של מצעים טריים (למשל, גזרי אורנים), כדי photobeams מעורפל לא, אם זה אפשרי (איור 4C & D).
    3. כלובי מקום נגד ציר Y של מערך photobeam ליד קצה אחד, כך חמש קורות מחולקות באופן שווה לכל אורכו. קורות ציר ה- X שאינם משמשים מבחן זה (איור 4C & D).
    4. קח העכברים לכלוב ביתם, בסדר אקראי, בעורפו ולשקול אותם. הסר כל עכבר מהסירה לשקול ידי בבסיס הזנב שלהם (עם תמיכה) ומניח ישירות לתוך הכלוב של התנועה שהוקצה להם. כיסוי כל כלוב עם מכסה המסנן העליון סטנדרטי.
    5. כן מזרקי פרט wמלוחים ה- i או פתרון קוקאין, כמתואר שלב 2.1.7, מבוסס על משקל הגוף של אותו היום. התחל עם מינון של 15 או 20 מ"ג / ק"ג, ולשקול בניסוי שני שימוש במינון גבוה או נמוך (ראה דיון על הגורמים הרלוונטיים).
    6. לאחר ניסויי הרגלה הסתיימו עבור כל כלובים, לטעון את תכנית ההזרקה.
    7. אחת בכל פעם, להסיר עכברים ממבחן הכלוב, בעורפו שלהם ולתת הזריקה שלהם (IP). לפני החזרת את העכבר לכלוב הבדיקה שלה, במהירות ליזום את אות ההתחלה בכלוב (איור 5 ג, למטה).
    8. אחרי כל ניסויי ההזרקה הסתיימו, לחזור עכברים בכלובים בביתם וחדר הדיור שלהם.
    9. אם תרצה, לאפשר עכברים לעבור סדרה של תקופות נסיגה ואתגרי תרופה, כגון הבא: באותו המינון כמו מקורית, חצי מנה, במינון כפול, אז מלוח, המאפשר שבעה ימים לפני האתגר אותו במינון ושלושה שבע ימים לפני כל אתגר נוסף. לא משנה מה הבחירה של אתגרים, maintain תקופות נסיגה דומה בקבוצות בעלות עניין משותף במסגרת ניסוי.
      הערה: אם את המינון המקורי הוא גבוה (למשל, 30 מ"ג / ק"ג ומעלה), הכפיל במינון צריך לדלג או חליף עם מינון נמוך יותר. האתגר המלוח מגלה כל הפעלה של תנועה מותנית בסביבה לזווג הקוק לבד, ותוך כדי כך, כמות תנועה רגישה כי הוא קוק תלוי (ראה דיון).
  3. ניתוח סטטיסטי
    1. בחר את החלק (ים) של כל ניסוי אשר ישמשו לצורך ניתוח. רוב התנועה נגרמת הקוק במכרסמים מתרחשת בתוך ההזרקה ~ 15-30 דקות לאחר התרופה הראשונה. בהתאם משתני המעורבים, לשקול ניתוח תנועה מצטברת עבור חלונות הזמן המרובה (למשל, 15, 30, 60 ו / או 120 הדקות הראשונות) או להתמקד מקטעים עצמאיים של המשפט.
    2. באמצעות המסגרת הזמן שנבחרה, סכם את הפסקות הקרן עבור כל חיה ליום לניסויי הרגלת הזרקה בנפרד ולאחר מכןverage הסכומים עבור כל קבוצה. מגרש אומר ושגיאות התקן של הממוצע (SEM) בגרף קו על כל הימים. כמו טיפולים עשויים לשנות איך עכברים להגיב לתרופה מוקדם ו / או מאוחר בכל ניסיון יומי, גם עלילת הפסקות קרן קבוצה ממוצעת של בן 5 דקות במשך כל הניסוי יומי.
      הערה: שרטוט ממוצעי פעילות יומית לניסויי הרגלה והזרקה (למשל, 15 דקות ראשונות) עושה את זה באופן מלאכותי להופיע התנועה שהוטבלה בזריקה מלוחה, אך יש לזכור פעילות שיש לו (ככל הנראה) ירד לרמה זו עד סוף ההרגלה בכל יום .
    3. לנתח טיפול מליחי תרופת ימים רצופים בנפרד באמצעות מדידות חוזרות (RM) ANOVAs שיש גורם בתוך-נושאים של יום / השעה ולרבות כל גורמים בין-נושאים בעיצוב, על פי צורך. השתמש מבחן t או One-Way ANOVA לחקור הבדלים בין הקבוצות ביום 1 של קוקאין (לחשיפה אקוטית), וכן ANOVA רב משתני לקראת האתגרים. במידת הצורך, בצע significancדואר עם בדיקות פוסט-הוק או Univariate ANOVAs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות נציג מן assay CPP מוצגים באיור 6 באמצעות עכברי-בר C57BL / 6N בכ תשעה שבועות של גיל. מערך המחקר היה העצרת מעורבת 2 x 3, עם משתנה בתוך-מושאי הבדיקה (לפני ואחרי) וכן בין-מכפיפה משתנה של טיפול (מלוחים וקוקאין 5 ו -10 מ"ג / ק"ג). RM ANOVA הראה אינטראקציה מובהקת בין המבחן והטיפול (F 2,20 = 3.68, p <0.05), מה שהתפרש במקום השפעות עיקריות משמעותיות נצפו הוא המבחן (F 1,20 = 9.86, p <0.01) טיפול (F 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מדגים שיטות העדפת מקום מותנית ולרגישות של תנועה, שכל אחד מהם יכולים להיות בשימוש על ידי המעבדה הממוצעת להעריך היבטים של פלסטיות התנהגותית-סמים. כמו ברוב הבדיקות התנהגותיות, ישנם שיקולים ראויים נוספים מעבר הפרוטוקול הבסיסי. ראשית, כל הטכניקות האלה ניתן לתפוס כבעל שני שלבים, אינדוקציה והבעה. "גיוס" מכסה את הפיתוח של התנהגות-עבור CPP היא מתרחשת במהלך מיזוג, ועל רגישות זה בתקופה הראשונית של (בדרך כלל ברציפות) חשיפות התרופה. "ביטוי" עבור CPP הוא שלאחר הב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

המחברים מודים קארן דיאץ ושרי בירנבאום עבור קלט קודם על שיקולי תכנון התנהגותי ולורן Peca לעזרה עם בדיקות התנהגותיות. המחברים גם מכירים את התמיכה הנדיבה של קרן סימונס (מענק יוזמת לחקר האוטיזם סימונס קרן כדי CWC), NIDA (DA008277, DA027664, ו DA030590 כדי CWC, F32DA027265 כדי LNS ו F32DA036319 כדי RDP), קרן המחקר FRAXA ואלינור ומיילס תכנית מלגות שור (תמיכת המילגה LNS), ואת תכנית מלגות ג'ון Kaneb (תמיכת המילגה MT).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קוקאין הידרוכלוריד USPMallinckrodt Pharmaceuticals0406-1520רכישה ושימוש (חומר מבוקר Schedule II) למטרות מחקר דורש ציות ורישוי על פי החוק המדינתי והפדרלי.
העדפת מקום מותנה,  מכשיר שלושה תאים עם דלתות ידניות ואורות עבור MouseMed-Associates Inc.מד-CPP-MS & MED-CPP-3013המעבדה שלנו השתמשה בקופסאות אלה; עם זאת, קופסאות חלופיות רבות זמינות ומקובלות.
PAS-Home Cage Activity Monitoring מערכי PhotobeamDiego Instruments2325-0223 & 7500-0221המעבדה שלנו מאכלסת את המערכים הללו בתוך תאים שנבנו בהתאמה אישית, כמתואר בטקסט.  ישנן חלופות זמינות.
מגבונים חד פעמיים להסרת בד סאניPDI13872
San

מקורות

  1. National Institute on Drug Abuse. Drug Facts: Understanding Drug Abuse and Addiction. www.drugabuse.gov. , Available from: http://www.drugabuse.gov/publications/drugfacts/understanding-drug-abuse-addiction (2012).
  2. Kasanetz, F., et al. Transition to addiction is associated with a persistent impairment in synaptic plasticity. Science. 328 (5986), 1709-1712 (2010).
  3. Beach, H. D. Morphine addiction in rats. Can J Psychol. 11 (2), 104-112 (1957).
  4. van der Kooy, D. Chapter 13, Place Conditioning: A simple and effective method for assessing the motivational properties of drugs. Methods of Assessing the Reinforcing Properties of Abused Drugs. Bozarth, M. A. , 229-240 (2012).
  5. Carlezon, W. A. Place conditioning to study drug reward and aversion. Methods Mol Med. 84, 243-249 (2003).
  6. Prus, A. J., James, J. R., Rosecrans, J. A. Chapter 4, Conditioned Place Preference. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. Buccafusco, J. J. , (2009).
  7. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addict Biol. 12 (3-4), 227-462 (2007).
  8. Aguilar, M. A., Rodrìguez-Arias, M., Miñarro, J. Neurobiological mechanisms of the reinstatement of drug-conditioned place preference. Brain Res Rev. 59 (2), 253-277 (2009).
  9. Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. JoVE. (42), (2010).
  10. Brabant, C., Quertemont, E., Tirelli, E. Influence of the dose and the number of drug-context pairings on the magnitude and the long-lasting retention of cocaine-induced conditioned place preference in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 180 (1), 33-40 (2005).
  11. Pliakas, A. M., Carlson, R. R., Neve, R. L., Konradi, C., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Altered responsiveness to cocaine and increased immobility in the forced swim test associated with elevated cAMP response element-binding protein expression in nucleus accumbens. J Neurosci. 21 (18), 7397-7403 (2001).
  12. Knackstedt, L. A., Samimi, M. M., Ettenberg, A. Evidence for opponent-process actions of intravenous cocaine and cocaethylene. Pharmacol Biochem Behav. 72 (4), 931-936 (2002).
  13. Post, R. M., Rose, H. Increasing effects of repetitive cocaine administration in the rat. Nature. 260 (5553), 731-732 (1976).
  14. Marin, M. T., Cruz, F. C., Planeta, C. S. Cocaine-induced behavioral sensitization in adolescent rats endures until adulthood: lack of association with GluR1 and NR1 glutamate receptor subunits and tyrosine hydroxylase. Pharmacol Biochem Behav. 91 (1), 109-114 (2008).
  15. Henry, D. J., White, F. J. The persistence of behavioral sensitization to cocaine parallels enhanced inhibition of nucleus accumbens neurons. J Neurosci. 15 (9), 6287-6299 (1995).
  16. Hope, B. T., Simmons, D. E., Mitchell, T. B., Kreuter, J. D., Mattson, B. J. Cocaine-induced locomotor activity and Fos expression in nucleus accumbens are sensitized for 6 after repeated cocaine administration outside the home cage. Eur J Neurosci. 24 (3), 867-875 (2006).
  17. Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology. 52 (2), 185-190 (1977).
  18. Smith, L. N., Jedynak, J. P., Fontenot, M. R., Hale, C. R., Dietz, K. C., Taniguchi, M., Thomas, F. S., Zirlin, B. C., Birnbaum, S. G., Huber, K. M., Thomas, M. J., Cowan, C. W. Fragile X mental retardation protein regulates synaptic and behavioral plasticity to repeated cocaine administration. Neuron. 82 (3), 645-658 (2014).
  19. Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behav Brain Res. 115 (1), 39-47 (2000).
  20. Sakoori, K., Murphy, N. P. Maintenance of conditioned place preferences and aversion in C57BL6 mice: effects of repeated and drug state testing. Behav Brain Res. 160 (1), 34-43 (2005).
  21. Bardo, M. T., Neisewander, J. L., Miller, J. S. Repeated testing attenuates conditioned place preference with cocaine. Psychopharmacologia. 89 (2), 239-243 (1986).
  22. Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), 130-134 (2002).
  23. Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. J Neurosci. 24 (30), 6686-6692 (2004).
  24. Briand, L. A., Blendy, J. A. Not all stress is equal: CREB is not necessary for restraint stress reinstatement of cocaine-conditioned reward. Behav Brain Res. 246, 63-68 (2013).
  25. Redila, V. A., Chavkin, C. Stress-induced reinstatement of cocaine seeking is mediated by the kappa opioid system. Psychopharmacology. 200 (1), 59-70 (2008).
  26. Do Couto, R. ibeiro, Aguilar, B., A, M., Manzanedo, C., Rodriguez-Arias, M., Armario, A., Minarro, J. Social stress is as effective as physical stress in reinstating morphine-induced place preference in mice. Psychopharmacology. 185 (4), 459-470 (2006).
  27. Post, R. M., Lockfeld, A., Squillace, K. M., Contel, N. R. Drug-environment interaction: context dependency of cocaine-induced behavioral sensitization. Life sciences. 28 (7), 755-760 (1981).
  28. Badiani, A., Browman, K. E., Robinson, T. E. Influence of novel versus home environments on sensitization to the psychomotor stimulant effects of cocaine and amphetamine. Brain Res. 674 (2), 291-298 (1995).
  29. Li, Y., Acerbo, M. J., Robinson, T. E. The induction of behavioural sensitization is associated with cocaine-induced structural plasticity in the core (but not shell) of the nucleus accumbens. Eur J Neurosci. 20 (6), 1647-1654 (2004).
  30. Partridge, B., Schenk, S. Context-independent sensitization to the locomotor-activating effects of cocaine. Pharmacol Biochem Behav. 63 (4), 543-548 (1999).
  31. Le Foll, B., Diaz, J., Sokoloff, P. Increased dopamine D3 receptor expression accompanying behavioral sensitization to nicotine in rats. Synapse. 47 (3), 176-183 (2003).
  32. Heidbreder, C. A., Babovic-Vuksanovic, D., Shoaib, M., Shippenberg, T. S. Development of behavioral sensitization to cocaine: influence of kappa opioid receptor agonists. J Pharmacol Exp Ther. 275 (1), 150-163 (1995).
  33. Tirelli, E., Michel, A., Brabant, C. Cocaine-conditioned activity persists for a longer time than cocaine-sensitized activity in mice: implications for the theories using Pavlovian excitatory conditioning to explain the context-specificity of sensitization. Behav Brain Res. 165 (1), 18-25 (2005).
  34. Anagnostaras, S. G., Schallert, T., Robinson, T. E. Memory processes governing amphetamine-induced psychomotor sensitization. Neuropsychopharmacology. 26 (6), 703-715 (2002).
  35. Spangler, R., Zhou, Y., Schlussman, S. D., Ho, A., Kreek, M. J. Behavioral stereotypies induced by 'binge' cocaine administration are independent of drug-induced increases in corticosterone levels. Behav Brain Res. 86 (2), 201-204 (1997).
  36. Kelley, A. E. Measurement of rodent stereotyped behavior. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8, Unit 8.8(2001).
  37. Taniguchi, M., Carreira, M. B., Smith, L. N., Zirlin, B. C., Neve, R. L., Cowan, C. W. Histone deacetylase 5 limits cocaine reward through cAMP-induced nuclear import. Neuron. 73 (1), 108-120 (2012).
  38. Zangen, A., Solinas, M., Ikemoto, S., Goldberg, S. R., Wise, R. A. Two brain sites for cannabinoid reward. J Neurosci. 26 (18), 4901-4907 (2006).
  39. Huston, J. P., de Souza Silva, M. A., Topic, B., Müller, C. P. What's conditioned in conditioned place preference. Trends Pharmacol Sci. 34 (3), 162-166 (2013).
  40. Schechter, M. D., Calcagnetti, D. J. Trends in place preference conditioning with a cross-indexed bibliography; 1957-1991. Neurosci Biobehav Rev. 17, 21-41 (1993).
  41. Bevins, R. A., Cunningham, C. L. Chapter 9, Place Conditioning: A Methodological Analysis. Tasks and Techiniques: A sampling of methodologies for the investigation of animal learning, behavior, and cognition. Anderson, M. , 99-110 (2006).
  42. Hitchcock, L. N., Cunningham, C. L., Lattal, K. M. Cue configuration effects in the acquisition of a cocaine-induced place preference. Behav Neurosci. 128 (2), 217-227 (2014).
  43. Liu, Z. -H., Chuang, D. M., Smith, C. B. Lithium amerliorates phenotypic deficits in a mouse model of fragile X syndrome. Int J Neuropscyhopharmacol. 14 (5), 618-630 (2011).
  44. Bardo, M. T., Rowlett, J. K., Harris, M. J. Conditioned place preference using opiate and stimulant drugs: A meta-analysis. Neurosci Biobehav Rev. 19 (1), 39-51 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CPPCPP

מאמרים קשורים