פרוטוקול מתח מתון כרוני בלתי צפוי לתסמיני דיכאון ייזום, שינויים התנהגותיים ותוצאות בריאותיות שליליות במכרסמים

מחלת נפש דיכאון היא הפרעת נוירולוגית מורכבת שמוכרת כיום כגורם מוביל לניטל נכות והמחלה בעולם. NIMH מדווח כי כ -12% מהאמריקאים סובלים מדיכאון קליני, עם נשים פעמיים רבות המושפעות לעומת גברים ^1. בארה"ב לבדה, הדיכאון מהווה מיליארדים דולרים עלויות בריאות ישירות ומוערך 193,000,000,000 $ יותר בעלויות עקיפות (הוריד רווחים ואיבד את הפרודוקטיביות) ^2. סימפטומים של דיכאון כוללים anhedonia, שינויים במחזורי משקל ושינה, ירידה בפעילות גופנית והיגיינה אישית, תחושות של חוסר תקווה או אשמה, ו / או מחשבות חוזרות של מוות או התאבדות. במהלך העשור האחרון, אפידמיולוגיים ומחקרים קליניים הראו כי דיכאון הוא גורם סיכון בלתי תלוי למחלות לב וכלי דם תחלואה (CVD) ותמותה ^3, והוא מנבא פרוגנוזה חמורה יותר של פתולוגיות לב וכלי דם, כולליםtherosclerosis, יתר לחץ דם, אוטם שריר לב, ומחלת לב כלילית, ללא קשר להיסטוריה הקודמת של CVD הגלוי ^4. למרות השכיחות הגוברת והשפעה על בריאות הציבור שלילית של דיכאון, הפתופיזיולוגיה אטיולוגיה ונלווית של מחלה זו הוא הבין היטב וההטרוגניות של ההפרעה בשל גורמים שונים (לדוגמא, ומרכיבים גנטיים, ביולוגיים, סביבתיים) עשתה אבחנה קלינית קשה לְהַגדִיר.

ראיות מצביעות על כך שלחץ נפשי בלתי ניתן לפתרון הוא גורם תורם גדול לפיתוח מחלות דיכאון ויכול להיות גם דיכאון חזק פתוגניים גורם מקשר וCVD, בין שאר בשל שיבוש וחוסר ויסות של ההיפותלמוס יותרת המוח-יותרת הכליה (HPA) ציר ^5,6. תפקוד לקוי של ציר HPA הוא מנגנון עיקרי שנקשר לשינויים התנהגותיים ופיסיולוגיים שנצפו בדיכאון והפיתוח של מספר גורמי סיכון CVD, כוללדיסליפידמיה, השמנת יתר, סוכרת ^ו-7. מודלים פרה מרובים של דיכאון פותחו בניסיון לשכפל את המנגנון של מאפיין פעילות הציר שינה HPA של דיכאון קליני; מודלים כאלה לספק אמצעי תוקף לחקירת השינויים התנהגותיים, נוירולוגים, ופיסיולוגיים הקשורים ללחץ כרוני ואקוטי בבעלי חיים. תוקפו של מודל חיה של מחלת מבוסס על הרלוונטיות של אטיולוגיה וההתקדמות של עיצוב המודל ויכולתה לשחזר אנטומיים, neurophysiological, ותכונות התנהגותיות שנצפו במחלות של בני אדם. בנוסף, תגובות פרה-קליניים לטיפולים (כגון SSRI) אמורות להניב תוצאות דומות לאלו שנצפו במסגרות קליניות.

מודלים של בעלי חיים כמה מדיכאון מתח מושרה כיום מנוצלים במחקר, כגון חוסר אונים נלמדו, מתח בתחילת חיים, ולחץ חברתי תבוסה. עם זאת, כל אחד מהמודלים האלה יש חסרונות טבועיםשלהפחית את היעילות של התרגום שלהם ^8. בתוך העשורים האחרונים, מתח מתון פרוטוקול בלתי צפוי הכרוני (UCMS) התפתח כאחד הדגמים הכי translationally-הרלוונטיים ללימוד הפתופיזיולוגיה של דיכאון במכרסמים ^9. מודל זה מבוסס על הרעיון הבסיסי שחשיפה כרונית לגורמי לחץ משבשת מערכות תגובת לחץ וסופו של דבר מוביל להתפתחות של הפרעות דיכאון. במהלך פרוטוקול UCMS, בעלי החיים שנחשפו לסדרה אקראית של גורמי לחץ סביבתיים וחברתיים מתונים על בסיס יומי. גורם מכריע שמשפר את הרלוונטיות של מודל זה למצבים אנושיים טמון ברמה הגבוהה של ודאות וחוסר יכולת שליטה של ​​גורמי הלחץ, כמו גם את הזמן שבו הם הציגו. בנוסף, פרוטוקול UCMS משתמש רק לחצים קלים, במקום להסתמך על חייו המוקדמים או גירויים פיזיים אגרסיביים. על פני תקופה של חשיפת UCMS, התנהגויות דיכאון לפתח ודומות לClinסימפטומים iCal, לרבות ירידה בהיענות לתגמולים (anhedonia), שינויים בפעילות גופנית והתנהגות חוקרת (חוסר אונים וייאוש), הידרדרות של מדינת המעיל ופעילות מינית שינתה ^10. כמעט כל סימפטומים של דיכאון להדגמה כבר דיווח על השימוש במודל זה, ומחקרים הראו כי התנהגויות אלו יימשכו מספר שבועות בעקבות ההפסקה של מתח. בנוסף, יכולות להיות בהדרגה נערצת התנהגויות דיכאון הנגרמות UCMS אלה על ידי כרוניים, אבל לא חריפים, טיפול בתרופות נוגדות דיכאון מסוים, המצביעות על תופעות נוירולוגיות דומות של שיפור טיפולי המשקף את הפעולה הקלינית ויעילות משתנה של סוכנים אלה בבני האדם באופן הדוק ^{11,14- 18.} כאן אנו מדווחים תיאור מפורט של פרוטוקול UCMS ולתאר תוצאות התנהגותיות וכלי דם אופייניות בעכברים.

כל ההליכים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים במדעי בריאות באוניברסיטת מרכז המערב וירג'יניה.

1. בחירה של בעלי החיים דגם

הערה: מינים הנפוצים ביותר במודל UCMS כוללים ספראג Dawley, וחולדות Wistar וBALB / CJ עכבר; מודלים עכברי אחרים הראו יעילות מוגבלת (DBA / 2, C57BL / 6). עם זאת, שיקול זהיר יש לתת לעכבר המסוים או זן עכברים של בחירה, כרקע הגנטי והרגישות ללחצים סביבתיים משתנים במידה רבה בין מינים והוכחו כגורמים קריטיים המשפיעים על התוצאות של מחקר ^{11,14,15, 19.}

1. להשתמש בבעלי חיים בגיל המתאים (למשל, אם נקודת הסיום הרצויה הוא להיות מוערכת בחולדה בת 17 שבועות, ולאחר מכן החולדות חייבת להתחיל פרוטוקול UCMS ב ~ 9 שבועות של גיל) כפרוטוקול זה לוקח בלאהשבועות רח 7-9 לגרום לתסמיני דיכאון באופן מלא.
2. בעלי חיים חד-בית עוברים UCMS בכלובים שאושרו IACUC ומתקנים, במזון וכברצונך אוכל סטנדרטי מודעה זמינה (אלא אם כן נדרש אחרת על ידי פרוטוקול ספציפי).
3. קח טיפול מיוחד על מנת להבטיח בקרות הם שוכנו בחדר שקט עם פעילות מינימאלית כדי להפחית את ההשפעות של כל גורמי לחץ סביבתיים לא ידועים אפשריים.

2. פרוטוקול מתח בלתי צפוי כרוני מתון

הערה: בעלי חיים עוברים UCMS מועברים יומי (> 5 ימים בשבוע) לחדר נקי משמש למניפולציות UCMS. בעלי חיים נחשפים ל1 או 2 של גורמי הלחץ המפורטים להלן בכל יום. גורמי לחץ מבוצעים על לוח זמנים אקראיים, וכל מתח מנוהל על מינימום של 3-4 שעות (ראה טבלה 1).

1. לצנן את המצעים על ידי שפיכת 10-20 גר '. מים של נקיים לכל כלוב סטנדרטי. התאם את כמות מים בהתאם לגודל שלכלוב כדי לצנן את מלוא המצעים אבל לא לגרום לאיגום מים. מתגורר בעלי החיים בכלוב לח במשך 3-4 שעות.
2. הסר מצעים מכל כלוב במשך 3-4 שעות, לאחר שבעלי החיים שהועברו ללחץ נוסף הדורשים כלוב ריק (אמבט רדוד, הטיה כלוב) או להציב לתוך כלוב נקי עם מצעים טריים.
3. כלובי הטיה לכ 45 מעלות (ללא מצעים) במשך 3-4 שעות. יכולים להיות מוטים כלובים עם אובייקט יציב שיישאר במקום כחיה נעה סביב בכלוב.
4. אלתר 12 שעות אור / 12 שעות / מחזורים כהים רגילים לsuccessions של 30 תקופות דקות שנמשך 8 שעות. לאחר, לחזור לבעלי חיים המחזור הרגיל.
5. העבר את כל בעלי חיים מהכלוב בבית שלה לזה של הכלוב של חיה השכנה שהוסר למשך 3 שעות.
6. הסר את כל המצעים מכלוב ולהוסיף מים עד לעומק של ~ 0.25 אינץ 'לעכברים או ~ 0.5 אינץ' לחולדות לכ 4 שעות. השתמש במים שהם חם יותר מאשר RT (~ 30 מעלות צלזיוס) כדי למזער hypothermפוטנציאל IA. בקצרה חיות יבשות עם מגבת רכה בסיומה של חשיפת המים לפני ההשמה לכלובים נקיים.
7. לחשוף בעלי חיים לטורף ריחות / נשמע על ידי הוספת מדגם קווצות מתפזרות באופן אקראי של פרווה או שתן (10-20 מיליליטר) ממיני טורפים טבעיים לתוך הכלוב במשך 3-4 שעות. לחלופין, לשחק נוהם או רעשי טורפים ממיני טורפים טבעיים בסמוך לכלובים במשך 3 שעות.
8. בסוף כל תקופה לחץ יומיומית, למקם את כל החיות לכלובים נקיים ולהחזיר אותם למתקן הדיור.

3. ניטור בעלי החיים / טיפוח עשרות

1. בדוק כל חיה יומית לפיתוח פצעים או פצעים שעשויות לדרוש טיפול וטרינרים. בעלי חיים המתפתחים באורח קל עשויים להמשיך בפרוטוקול UCMS על ההסכמה של הווטרינר.
   1. שני חוקרים מיומנים בהערכת טיפוח מעיל לבדוק כל חיה ולהקצות ציון מעיל שבועי בסולם של 0-1. ציון זה הוא להרתיעממוקש ידי הקצאת עשרות בודדים (0- נקי, 1-מלוכלך) לכל אחד מגוף 8 ראש regions-, צוואר, גב מעיל, מעיל הגחון, זנב, forelimbs, גפיים אחוריות, ואזור איברי המין. אותו החוקרים הם לבצע משימה זו בכל פרוטוקול UCMS לשמור על עקביות בהקצאת עשרות מעיל.
   2. כל בעל חיים שחווה ירידה חדה במשקל גוף (כלומר,> 15%) יש לדווח לצוות הוטרינרים ויש להסיר מן הפרוטוקול.

4. התנהגות בדיקה ומדידות תוצאה

הערה: מספר שיטות של הערכה יכולה לשמש כדי לכמת שינויים התנהגותיים מפרוטוקול UCMS במכרסמים.

1. ציון טיפוח המעיל מצטבר.
   1. כפי שתואר לעיל, ציון טיפוח מעיל שבועי מוקצה לכל בעל חיים.
2. מבחן Splash סוכרוז:
   1. מניחים את החיה בכלוב נקי מרופד בצמר גפן או מגבת כדי למנוע מצעיםמהקפדה על המעיל שלה. ריסוס תמיסת סוכרוז 10% על מעיל הראש והגב של כל חיה ולהקליט כוללת טיפוח התנהגות במשך 5 דקות.
   2. טיפוח הפעילות (מוגדרת כניקוי של הפרווה על ידי מלקק או מגרדים) נמדד על ידי חביון (זמן המתנה בין הריסוס והייזום של הטיפוח הראשון) ותדירות (מספר הפעמים טיפוח חלק גוף מסוים).
3. מבחן העדפת סוכרוז:
   1. להרגיל בעלי חיים לשתות 1% תמיסת סוכרוז (w / v) 72 שעות לפני הבדיקה ולאחר מכן לספק חשיפה לשני בקבוקים (1% תמיסת סוכרוז לעומת מים ברז בבקבוקים שונים). אחרי ההתרגלות, לספק חיות גישה כרצונך מודעת מים ברז ופתרון סוכרוז במשך 3 שעות עם. אחרי 3 שעות שיא צריכת הכמויות של תמיסת סוכרוז ומי ברז ולחשב העדפת סוכרוז כ: [(צריכת סוכרוז) / (צריכת מים + צריכת סוכרוז)] × 100.
4. מבחן זנב השעיה (עכברים בלבד):
   1. סולבלות עכברים בזנב ממוט יציב (20 סנטימטרים מהרצפה) באמצעות דבק (2 סנטימטר מקצה הזנב). זמן חוסר תנועה שיא מעל 5 דקות. עכברים נחשבים נייחים רק כאשר הם תולים באופן פסיבי וחסר תנועה לחלוטין.
5. המבחן לשחות בכפייה:
   1. בעלי חיים מקום במכל (~ סנטימטר קוטר 15-20 לעכברים; ~ קוטר 55-60 סנטימטר לחולדות) מלאים במים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס ± 0.5. רשום את חביון התקף הראשון של ניידות ואת משך הזמן ללא תנועה במהלך תקופת הבדיקה 5-דקות. בסוף הבדיקה, למקם את החיה הרטובה בכלוב החזקה על כרית חימום (30-35 מעלות צלזיוס) עם מצעים רגילים מכוסים על ידי מגבת נייר סופגת עד יבש.
6. גבוה פלוס מבוך:
   1. לאפשר לכל בעלי חיים כדי לחקור את המבוך בחופשיות במשך 5 דקות. ערכי שיא כולל לכל זרוע, וזמן כולל בילו בכל זרוע, על פי קריטריונים מראש ^20.
7. Locomoפעילות טור:
   1. רמות שיא הפעילות, מוגדרות כתנועה כללית, תנועות עדינות, תנועות גידול, וחוסר פעילות, לשניהם חריפים (30 דקות) ו / או כרונית (12 שעות) תקופות זמן. לעשות זאת באמצעות כלוב בבית או סביבת רומן, בהתאם לסביבת האדם (אם כי יש לשמור על עקביות) בזמן אמת על ידי משקיף או פוסט-הוק על ידי הפעלה חוזרת וניתוח צילומי מצלמה.

5. הרחבה / וריאציה של פרוטוקול UCMS

1. לנהל סוכנים טיפוליים מתאימים או אתגרים ללמוד את היכולת שלהם או כדי להקהות את הפיתוח של תוצאות מושרה UCMS (אם יזם מוקדם) או להפוך חומרת תוצאות מושרה UCMS הוקמו (אם יזם מאוחר). זה תלוי במעבדה או פרוטוקול ¹¹ הבודדים.

6. הערכות תוצאה סופיות

1. לאחר סיום פרוטוקולי UCMS ובדיקות התנהגותיות, לנצל בעלי חיים בexper הבאiments באופן שמתייחס להשערות, מטרות או יעדים של המעבדה האדם הספציפיות.
   הערה: כדוגמאות, זה יכול לכלול תגובות לב וכלי דם, דלקתיות או האנדוקרינית ללחץ כרוני. לחלופין, יכולות להיות הציגו התערבויות טיפוליות בשלב זה להעריך את יעילותם ויסודות מכניסטית.

דוגמא ללוח הזמנים לשבוע הבא הליך UCMS אחד מוצגת בטבלה 1. בכל שבוע, גורמי לחץ חולקו באקראי למניעת מצעד תמיכה ולהבטיח ודאות של אתגר המתח בכל יום.

מדדים של דיכאון כמו התנהגויות

בעקבות 8 שבועות של UCMS, היו שינויים משמעותיים לתוצאות התנהגותיות ופיזיולוגיות במכרסמים הדגישו כרוני ביחס לזני השליטה הלא הדגישו. פיתוח של דיכאון כמו התופעות הבאות UCMS היה הערכה באמצעות ציון מעיל, בדיקת הפתיחה סוכרוז, והשעיה זנב (עכברים בלבד; מפנה 12,13). ירידה הדרגתית בציוני טיפוח מעיל נצפתה בכל בעלי החיים UCMS (איור 1, לוח), וזה מסומן השפלה במצב הפיזי של המעיל מציע ירד טיפוח פעילות. התנהגות זו עלולה במקביל חוסר המוטיבציה או חוסר העניין בעמ 'erforming משימות יומיומיות, כגון התחזוקה של טיפול אישי מינימאלי.

בעלי החיים UCMS גם הפגינו חביון עלה ל חתן ומופחת כולל זמן טיפוח במבחן סוכרוז הפתיחה (איור 1, הפנלים B ו- C). זמן גדל ליזום טיפוח התנהגות יחד עם זמן ירד בילה טיפוח קשור עם מוטיבציה מופחתת וירידה בהתנהגות גירוי עצמית, או רגישות מופחתת להנאה. זה הוא נציג של סימפטום הליבה של דיכאון, anhedonia. בנוסף, חל גידול משמעותי בזמן התזוזה במהלך בדיקת ההשעיה זנב בעכברים. כאמור, התנהגות זו היא מידה של ייאוש התנהגות עם חוסר תנועה גדול יותר המייצגת דיכאון חמור יותר כמו סימפטום.

מדדים של שינויים פיסיולוגיים

מפה יכולה להיות מורמת באופן משמעותי כתוצאה מפרוטוקול UCMS, אבל זה לא הוא ציין באופן עקבי ( (איור 2). משמרת מוגברת כלפי תגובות מרחיב הקהו הוא ציין במקרים קליניים של סיכון מוגבר להתפתחות מחלת לב וכלי דם.

עכברי UCMS המתבטאים הגדילו את רמות פלזמה של קורטיזול, סמן של מתח פיסיולוגי כרוני, וnitrotyrosine, סמן של עקה חמצונית כרונית (טבלה 2).

בנוסף, עכברי UCMS הראו רמות גבוהות באופן משמעותי של TNF-α הסמנים פרו-דלקתיים וMCP-1. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שבעלי חיים הדגישו לפתח פרופיל מחלה pathophysiological הבא 8 שבועות של UCMS (טבלה 2).

סטייה עם סקס

העדויות אחרונות הראו כי יש divergen כמותית משמעותיתce בתשובות לUCMS בין הזכר ונקבות עכברים (13). באופן ספציפי, הנתונים מצביעים על כך שנקבות עכברים, נחשפו לפרוטוקול UCMS הזהה כמו גברים באותו גיל, לפתח תגובות התנהגותיות חמורות יותר לפרוטוקול מאשר גברים (לוח 3 ואיור 3), עם רמות גבוהות של קורטיזול, nitrotyrosine וסמנים של דלקת .

עם זאת, למרות הבדלים בין מינים זה בעקבות פרוטוקול UCMS, vasculopathy שמתפתח כתוצאה נראה קהה במין הנשי בהשוואה לזכרים, מאוד המצביעה על תחזוקה מעולה של תפקוד האנדותל, למרות הסביבה התפשרה (איור 4) .

לאיורי 1 ו 3, תוצאות התקבלו באמצעות הטכניקות שתוארו לעיל, עם היישום של ANOVA ומבחני t כמתאים. לאיורים 2 ו 4, תוצאות התקבלו u לשיר יחסי ריכוז תגובה בהכנות טבעת אב העורקים vivo לשעבר. עקומות היו בכושר עם משוואה לוגיסטית שלושה פרמטר, עם ANOVA ומבחני t כמתאים לגבולות התחתונים של העקומות. אנא ראה אזכור 12,13 לפרטים.

תסמיני דיכאון איור 1. בעקבות שמונה שבועות של UCMS בעכברים. הנתונים מוצגים למעמד מעיל (לוח א '), המיסות (לוח ב') והתדירות (לוח C) טיפוח הפנים הבא 10% תרסיס פתרון סוכרוז, וסך הכל תקופה של חוסר תנועה במהלך בדיקת ההשעיה זנב (לוח ד ') לבקרה ועכברים UCMS. * P <0.05 לעומת control.Please ראה התייחסות 12 לפרטים.כחוש "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. תגובות לmethacholine vasodilator מעכברים בעקבות שמונה שבועות של UCMS. הנתונים מוצגות לעכברים בתנאי שליטה (שליטת גבול תחתון = 10.3 ± 2.4%) ולאחר שמונה שבועות של פרוטוקול UCMS הוטל (UCMS גבול התחתון = 33.6 ± 4.4 %). * P <0.05 לעומת תגובות בטבעות של כלי דם שלא טופלו מעכברי שליטה. מהתייחסות 12 עם אישור מודפס מחדש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. הבדלי איור בתסמיני דיכאון Folגעיית שמונה שבועות של UCMS בזכר ונקבת עכברים. הנתונים מוצגים למעמד מעיל (), המיסות (B) ותדירות (C) טיפוח הפנים הבא 10% תרסיס פתרון סוכרוז, וסכה כל התקופה של חוסר תנועה במהלך מבחן השעיה זנב (ד ') לבקרה ועכברים UCMS. * P <0.05 לעומת הבקרה במין; † p <0.05 לעומת UCMS-זכר. מהתייחסות 13 עם אישור מודפס מחדש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

4. הבדלי איור בתגובות vasodilator מזכר ונקבת עכברים בעקבות שמונה שבועות של UCMS. תגובות מרחיב של טבעות אב העורקים לconcentratio הגדלתNS של methacholine (פנל עליון) וnitroprusside נתרן (פנל תחתון) מעכברים בתנאי בקרה ולאחר שמונה שבועות של UCMS. * P <0.05 לעומת הבקרה במין; † p <0.05 לעומת UCMS-זכר. מהתייחסות 13 עם אישור מודפס מחדש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1. שבועיים מדגם להטלת פרוטוקול בלתי צפוי לחץ מתון כרוני (UCMS).

טבלת 2. מאפיינים בסיסיים בין קבוצות עכבר בתנאי בקרה ולאחר 8 שבועות של UCMS. כל העכברים בגילי 17-18 שבועות. * P <0.05 לעומת שליטה. שונה מהתייחסות 12.

טבלת 3. מאפיינים בסיסיים בין הזכר ונקבת קבוצות עכבר בתנאי בקרה ולאחר 8 שבועות של UCMS. כל העכברים בגילי 17-18 שבועות. * P <0.05 לעומת שליטה. שונה מהתייחסות 13.

למחברים אין מה לחשוף.