אסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית משנים את תכונותיהם התפקודיות והמבניות בתגובה לגירויים מזיקים. דוח זה מציג פרוטוקול להערכת מורפולוגיה תלת מימדית של אסטרוציטים במצבי מחלה או לאחר התערבויות טיפוליות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים
במאמר זה
סיכום
תקציר
כמו תאי גלייה במוח, יש לי האסטרוציטים תפקידים פונקציונליים מגוונים במערכת העצבים המרכזית. בנוכחות גירויים מזיקים, האסטרוציטים לשנות את המאפיינים הפונקציונליים ומבניים שלהם, מצב הנקרא astrogliosis תגובתי. כאן, פרוטוקול להערכה של תכונות מורפולוגיות של האסטרוציטים מוצג. פרוטוקול זה כולל כימות של 12 פרמטרים שונים כלומר את פני השטח והנפח של הרקמה מכוסה על ידי astrocyte (שטח astrocyte), כל astrocyte כולל סניפים, גוף תא, וגרעין, כמו גם אורך כולל ומספר הסניפים, העצמה של immunoreactivity הקרינה של נוגדנים המשמשים לזיהוי astrocyte, וצפיפות astrocyte (מספר / 1000 מיקרומטר 2). למטרה זו תמונות מיקרוסקופיות confocal (3D) תלת ממדים נוצרו, ותוכנת ניתוח תמונת 3D כגון Volocity 6.3 שימש למדידות. רקמת מוח חולדה נחשפה לביתא עמילואיד 1-40 1-40) עם או בלי התערבות טיפולית שימש להציג את השיטה. גם פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח morphometric 3D של תאים אחרים משני in vivo או בתנאי מבחנה.
מבוא
במערכת עצבים מרכזית בריאה (CNS), האסטרוציטים לשחק תפקיד חשוב בויסות זרימת דם, חילוף חומרים של אנרגיה, תפקוד הסינפטי וגמישות, ויון תאי ועצביים הומאוסטזיס 1-3. בנוסף, האסטרוציטים להגיב לגירויים מזיקים שונים ותנאים חריגים כגון טראומה, זיהום, איסכמיה או ניוון מוחיים באמצעות astrogliosis תגובתי אשר מאופיין על ידי יתר, הפצה ושיפוץ פונקציונלי של האסטרוציטים 4,5.
astrogliosis תגובתי יכול להנדס את התגובה הדלקתית ותהליך תיקון ברקמה, ולכן יכול להשפיע על התוצאות הקליניות של התערבויות טיפוליות. בהתאם לכך, האסטרוציטים קיבלו את תשומת לב ממדען המוח בעשורים האחרונים כיעדים פוטנציאליים להתערבויות טיפוליות עבור מגוון רחב של מחלות התוקפות את מערכת העצבים המרכזית.
בדרך כלל יש לי האסטרוציטים צורת stellate עם ד היטבסניפי efined שהתפשטו ברחבי סומה 6. במצב חולה במוח, סניפי astrocyte להיות מפותלים ולהראות קצוות נפוחים 7, למשל בנוכחות של בטא עמילואיד (Aβ).
מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח תמונות 3D של האסטרוציטים נרכשו על ידי מיקרוסקופיה confocal. שנים עשר פרמטרים כמותיים שונים עבור כל astrocyte נמדדו: השטח הפנים ואמצעי אחסון של שטח astrocyte (הרקמה מכוסה על ידי astrocyte), תא כולו (כולל סניפים), גוף תא, וגרעין; האורך הכולל ומספר הסניפים; עוצמת הקרינה של נוגדנים המשמשים לזיהוי astrocyte; והצפיפות של האסטרוציטים (מספר / 1000 מיקרומטר 2). לשם כך, השתמשנו חלקים במוח מחולדות שנחשפו לintrahippocampal הזרקה של Aβ 1-40 עם או בלי טיפול האיזופלוונים כחומר אנטי דלקתי. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לmorphometricalysis סוגי תאים שונים במבחנה או בvivo בתנאים שונים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה בוצע בהתאם למדיניות שנקבעה במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (NIH) שאושרה על ידי ועדת אתיקה של אוניברסיטת איראן למדעי רפואה (טהרן, איראן).
1. בעלי חיים, תכשירי ניתוח ודגימה
הערה: הכן רקמת מוח לניתוח מיקרוסקופי confocal 3D.
- בעלי חיים הפרד באופן אקראי לשתי קבוצות: Aβ 1-40 -injection (n = 8), וAβ 1-40 -injection עם טיפול האיזופלוונים (n = 8); לנהל האיזופלוונים (10 מ"ג / קילוגרם בדילול מלא ברכב כגון שמן קיק polyethoxylated) על ידי HR gavage 1 לפני הניתוח.
- להרדים את החיות עם קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם). אשר הרדמה תקינה על ידי חוסר רפלקס נסיגה לאחר צובט את הבוהן. השתמש במשחה על עיניים במהלך הניתוח כדי למנוע יובש.
- הנח בעלי חיים במנגנון stereotaxic וראש הגילוח. החל iodפתרון ine לנקות את הקרקפת לפני החתך ולשמור על אתר המבצע סטרילי במהלך הניתוח כדי להקטין את הסיכון לזיהום. הזרק Aβ 1-40 stereotaxically (4 μl) בהיפוקמפוס ב-3.5 מ"מ אחורי לגבחת, ± 2 מ"מ לרוחב קו האמצע, ו-2.8 מ"מ מתחת דורה, על פי אטלס מוח חולדה 8. לשיטת stereotaxic עיין פרסום קודם 9.
- לספק תצפית / טיפול שלאחר ניתוח עד לבעלי החיים הם בהכרה מלאה כדי להבטיח את נוחותם של בעלי החיים. שמור את החיות חמות במהלך התאוששות, ולא להחזיר אותם לכלוב עם חיות אחרות עד להחלמה מלאה. שים לב לכל סימן של זיהום בבעלי החיים לאחר ניתוח.
- להרדים את בעלי החיים לעומק על ידי קטמין (150 מ"ג / קילוגרם) שלושה שבועות לאחר הניתוח. לבצע קיבוע transcardial ידי מרוססי חיות עם מי מלח 0.9% ואחריו paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PBS (pH = 7.4), ולאחר מכן להסיר ולתקן מוח כפי שתואר ב 10 </ Sup>.
- פוסט לתקן את המוח paraformaldehyde 4% במשך 2-3 ימים על 4 מעלות.
- להטביע את הרקמה בלוקים פרפין על ידי שימוש בציוד רקמות הטבעה, ולהימנע מתחת מילוי או קלטת מילוי מעל שכן הוא עלול להפריע ליישור או חתך נכון. שים לב לכיוון של הרקמות בבלוק פרפין.
הערה: היפוקמפוס החולדה, למשל, קרוב לחלק אחורי של האונה המוחית. לפיכך, הרקמה צריכה להיות מוטבעת באופן שמתחיל חתך בחלק אחורי של המוח. השתמש באטלס פקסינוס 8 כמדריך כדי להגיע למבנה האנטומי הרצוי. - מניחים את microtome מטיוטות אוויר או פתחים מאז תנועות אוויר להפוך את הטיפול בחלקים קשים.
- השתמש בחלקים עם מיקרומטר עובי ≥20 כעומק זה עם יהיה צורך להפיק תמונות Z-Stack של האסטרוציטים מלאים. אל תשתמשו בכמה הסעיפים הראשונים, כפי שיש להם עובי רצוי בשל תרמית דוארxpansion.
- מניחים את החלקים על פני השטח של מים חמים (5 ± 2 C, מתחת לטמפרטורת ההיתוך לפרפין) רק מספיק זמן כדי לשטח את החלקים.
הערה: מעל הרחבת הסעיף יכולה להפריע את המורפולוגיה של המבנה. השתמש במכחול זעיר להעביר בזהירות חלקים. לאסוף 02:58 סעיפים על כל שקופית. - שקופיות חנות במעמד בתנוחה זקופה ולתת להם להתייבש על 37 C למשך מספר שעות או O / N.
2. אימונוהיסטוכימיה
- סעיפי Deparaffinize בקסילן, 2 x 10 דקות, ורעננותם דרך שיפוע אלכוהול (99.8%, 95%, ו -70%, 10 דקות כל אחד) וPBS.
- דגירה עם נוגדנים כנגד חלבון חומצי גליה fibrillary (GFAP) בדילול 1: 1,500 בPBS המכיל 0.25% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.25% Triton X-100 ו -3.5% בסרום נורמלי (O / N ב 4 ג).
- לשטוף חלקים בPBS למשך 3 x 5 דקות.
- דגירה עם antibodie פוספט מצומדות- אלקליין המשניים ל1H (1: 100, 21 C, מדולל PBS).
- שטוף את החלקים בPBS למשך 3 x 5 דקות.
הערה: חשוב לשטוף את החלקים כראוי לאחר נוגדנים משני למזער מכתים רקע. - סעיפי דגירה בחושך עם נוזלים קבועים האדום אַב צֶבַע (15-20 דקות). הערה: הכן את הפתרון לא יותר מ 30 דקות לפני השימוש.
- לשטוף חלקים בPBS למשך 3 x 5 דקות.
- לבסוף, להכתים את הגרעינים עם 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 500, בדילול מלא PBS) לפני-מחליק לכסות. אחסן את השקופיות בשעתי 24-48 המקרר לפני מיקרוסקופיה.
3. Confocal מיקרוסקופית
הערה: להערכה כמותית (ראה בהמשך), בחר astrocyte עם גרעין מוכתם DAPI נראה בבירור עם מינימום של חופף סניפים כדי להפחית את הסיכון לטעויות. הפקת תמונות Z-סטאק היא זמן רב. היה סבלני ולא מפסיק במהלך עיבוד. מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הזקוף הוא used כדי ליצור תמונות 3D מהאסטרוציטים.
- שים את השקופיות במיקרוסקופ השלבים, ובחר את מטרת 63X.
- פתח את תוכנת ההדמיה ולחץ על מערכת התחל. לחץ על כרטיסיית אתר. עבור להקצאה, ובחר GFP להתאים את האור הנכון.
- פתח את התריס כדי לשקף את האור. מצא Revolver רפלקטור בצד ימין של תריס ולבחור את הצבע שצריך לבוא לידי ביטוי על ידי האסטרוציטים (ירוק, אדום או סגול); צבע אדום (WF FSet20) שימש כאן.
הערה: אל תשכח להתמקד התמונה ישירות בעיניים של המיקרוסקופ. - כדי למצוא את המיקוד הטוב ביותר, לחץ על כל סגור, לשים סיכת מיקרוסקופ במצב מסך, ולחץ על כרטיסיית הרכישה.
- לחץ על חכמה התקנה תחת לשונית הרכישה; נפתח חלון. בחר fluorophore הנכון (כלומר DAPI ואלקסה פלואוריד 555, בפרויקט הנוכחי) מהרשימה. הצבע שנבחר באופן אוטומטי.
- לחץ על האות הטובה ביותר, והחל, ואז ללחוץ על חשיפה הגדר; המחשב יהיה אז באופן אוטומטי להגדיר את הפרמטרים החשיפה.
- לייעול התמונה, ללכת לחלון הערוצים. ביטול סימון Track2, להדגיש Track1 ולחץ על חיים. למקד את התמונה במידת הצורך.
- בחלון הערוצים להתאים את המקשים הבאים; לחץ על 1AU כדי לייעל את חריר באופן אוטומטי. זה מאוד חשוב לעשות את הצעד הזה אחרת תמונות confocal יהיו לא-אופטימליות. התאם רווח ליש העצמה הטובה ביותר (לשמור הגדרה זו להלן 800 כדי להפחית את רעש נוסף). לבסוף, קבע את רווח הדיגיטלי בין 2 ו -3.
- ביטול סימון Track1, לחץ על Track2 וחזור על שלב 3.8 לTrack2. אז להפסיק חי.
- עבור לחלון רכישת מצב. לשפר את התמונה על ידי אופטימיזציה של גודל מסגרת והמיצוע. כדי לשנות את גודל המסגרת ללכת לX * Y ובחר 1,024 x 1,024. בחר מהירות איטית כדי ליצור תמונה טובה יותר.
- עבור למיצוע ובחר מספר ≥4. ערך מיצוע זה מציין את מספר הסריקות שיהיה בממוצע לproducדואר התמונה שנרכשה. כעת לחץ על כפתור הצמד, ולשמור את תמונת 2D נתפסה.
- להדמיה 3D, לסמן את פריט Z-סטאק תחת הגדרה חכמה גורם לחלון Z-סטאק לפתוח.
- הגדר את העמדות הראשונות ואחרונה לZ-סטאק, כלומר העומק של התא. לחץ על ראשית חיים. לאחר מכן השתמשתי בכונן המוקד של המיקרוסקופ להתמקד בעמדה העליונה של astrocyte ברקמות, שבו Z-סטאק הוא להתחיל. לחץ על הסט הראשון. לאחר מכן להתמקד למטה למצב הנמוך ביותר של astrocyte ברקמות, שבו סריקת Z-סטאק יש להפסיק. לחץ על Set האחרון. אז להפסיק חי.
- בחר את המרווח; 1.01 מיקרומטר משמש במחקר הנוכחי; מרווח בחירה יכול להיעשות על ידי לחיצה על אופטימלי כדי להגדיר את מספר פרוסות.
- לחץ על התחל ניסוי. שמור את התמונות פעם אחת לסיום הסריקה. תמונה זו תשמש למדידה של הפרמטרים הבאים: פני שטח ונפח של שטח astrocyte, חזייה כל astrocyte כוללnches, גוף תא, וגרעין.
- לרכוש תמונת 2D באמצעות מטרת 10X או 20X כפי שמתואר בשלבים 3.6-3.11. תמונה זו יכולה לשמש למדידה עוצמת הקרינה immunoreactivity של נוגדנים, וצפיפות astrocyte (מספר / 1000 מיקרומטר 2).
4. צפיפות astrocyte וGFAP + עוצמת הקרינה
- פתח את תמונת 20X 2D. לחץ על HISTO (Hisogram) בצד השמאל של חלון תמונה.
- כדי לחשב את צפיפות astrocyte, בחר שלושה שדות ראייה ברציפות תחת מטרת 20X. לספור את מספר האסטרוציטים כי התערוכה סומה ברורה עם מינימום, חופפות סניפים בשדות.
- כדי לכמת את עוצמת הקרינה, בחר כלי מתאים (מלבן או עיגול) בכותרת התחתונה של חלון תמונה, ולבחור אזור למדידה. שים לב לערך הממוצע וסטיית תקן יופיעו באופן אוטומטי מתחת לתמונה. במחקר הנוכחי, שטח מלבני 0.7 מ"מ 2 בין רחiatum ולהב המדיאלי של רכס המשונן היה בשימוש.
5. סניפי astrocyte
- כדי לכמת את האורך ומספר כולל של סניפים, להשתמש בתמונות 3D (שנרכשו עם 20X) בתוכנה לניתוח תמונה. צייר קו באופן ידני לאורכו של כל סניף של astrocyte נבחר. לאחר מכן בחר את מדידת הכלי שמתמחה למדידת קו-אורך. על מנת לכמת את מספר הסניפים, בחר את ספירת הכלי לספור את מספר הפריטים מסומנים.
6. נפח ושטח פנים
הערה: סימון מבנה ידני בתוכנת ניתוח תמונת 3D דורשת התמקדות ואימון. תרגל מספר פעמים לפני שמתחיל ניסוי.
- כדי לכמת את אזור הנפח והשטח של גרעין astrocyte, סומה, גוף תא ושטח, להעביר את תמונות 3D (שנרכשו בשלבי 3.1-3.16) לתוכנת ניתוח תמונת 3D כגון Volocity 6.1.
- פתח את התוכנה וליצור חדשסִפְרִיָה. גרור את כל התמונות לעמודה האפורה שנשארה בספרייה החדשה. לאחר מכן, בחר אחד תמונת 3D. מימין, יש ערוצים שונים בצבעים שונים. הפעל ערוץ אחד של עניין; למשל הערוץ הכחול לDAPI כאשר מודד את הגרעין. לשנות את הבהירות באופן ידני כדי לקבל ניגוד אופטימלי.
- בחרו בתפריט כלים, ללכת להפוך נפח ולייצר תמונת 3D אחת מתמונות Z-ערימה. לחץ על מאפיינים בתפריט העריכה ולהיות בטוח שX, Y ו- Z נכסים מוצגים; אחרת אי אפשר לבצע את ניתוח 3D.
- לחץ על סמל כלי RIO Freehand בסרגל הכלים. כדי למדוד את שטח הנפח ושטח של גרעין astrocyte לצייר קו סביב הגרעין שכותרתו DAPI.
- כדי למדוד את שטח הנפח ופני שטח של גוף תא astrocyte לצייר קו סביב סומה למעט סניפים.
- כדי למדוד את שטח הנפח ושטח של astrocyte השלם (גוף תא כוללים סניפים) למתוח קו סביב סומה הבאהפני השטח של כל הסניפים.
- כדי להעריך את אזור הנפח והשטח של שטח astrocyte למתוח קו בין קצות הענפים.
הערה: לחצו על מחק במקלדת כדי למחוק ציורים לא רצויים. - לחץ על תפריט המדידות בחלק העליון של חלון התמונה כדי ליצור פרוטוקול מדידה; חלון המכיל כלים שונים פותח.
- גרור מצא אובייקטים לחלק העליון של החלון (חלונית). תן שם תיאורים לאוכלוסייה 1, לבחור את הצבע קשור, ולחצו על מדד. חלון אחר נפתח.
- בחר אזור כלומר פרמטר, נפח או משטח. לחץ על אישור. הנתונים יופיעו בטבלה.
- כדי לשמור את הנתונים בלחיצה על תפריט המדידה ובחר הפוך פריט מדידה.
- בחר פריט מדידה חדש בשם מהחלון נפתח. ואז לתת שם לנתונים ולחצו על אישור.
- לבסוף, לייצא את הנתונים לתוכנת סטטיסטיקה כגון כרית גרף או להצטיין תכנית. השתמש במבחן t כדי לנתח את הנתונים, אז עלילה 2D גרaphs.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
חלק זה מציג כמה דוגמאות של התצפיות איכותיות וכמותיים המיוצרות על ידי ניתוח morphometric 3D. לקבלת תוצאות של כל 12 הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן מלאים, עיין הפרסום הקודם שלנו 10.
תצפיות איכותיות
האסטרוציטים הציגו ענפים דקים או עבים שהיו בדרך כלל ארוך בAβ 1-40 חולדות הוזרקו (איור 1). כמה האסטרוציטים בצורת דמויות ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מועסקים morphometry confocal 3D להעריך 12 פרמטרים שונים שהיו קשורים עם מורפולוגיה astrocyte. לצורך כך, הרקמה בהיפוקמפוס של חולדות עם 1-40 Aβ - astrogliosis המושרה, עם או בלי טיפול מקדים האיזופלוונים כסוכן אנטי דלקתי היו בשימוש. על ידי שימוש בתמונות 3D ותוכנת morphometric, הצלחנו להראות את ההשפעה של האיזופלוונים על astrogliosis כלומר המורפולוגיה של האסטרוציטים.
...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממועצת המחוז של Östergötland, (שבדיה) והתאית ומולקולרי המרכז למחקר באוניברסיטת איראן למדעי רפואה (טהרן, איראן).
תודות
למחברים אין מה לחשוף.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עמילואיד בטא 1-40 | סיגמא אולדריץ' | 79793 | יש לשמור ב-70 מעלות ויותר; C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | שמור ב -20 & deg; C |
| נוגדנים לארנב פוליקולונלי כנגד חלבון חומצי סיבי גליה | DAKO | Z0334 | |
| נוגדני IgG מצומדים לחזירים אלקליין פוספט נגד ארנב נוגדנים | IgG DAKO | ||
| כרוגן קבוע נוזלי | DAKO | K0640 | |
| מאגר מצע אדום קבוע | נוזלי DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | שמן קיק פוליאתוקסילי - שלב 1.1 |
| LSM 700 מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| ניתוח תמונה 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
מקורות
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079(2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526(2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
