ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Summary

תרביות משותפות מייצגות שיטה רבת ערך לחקר האינטראקציות בין עצבים לרקמות ואיברי מטרה. מערכות מיקרופלואידיות מאפשרות תרבית משותפת של גנגליונים ואיברים או רקמות מתפתחים שלמים במצעי תרבית שונים, ובכך מייצגות כלי רב ערך למחקר במבחנה של הדיבור בין נוירונים למטרותיהם.

Abstract

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות. עם זאת, מנגנוני תופעות אלה אינם מובנים היטב עדיין. בפרט, התפקיד של עצבוב בהתפתחות שן והתחדשות מוזנח.

כמה מחקרים בvivo סיפקו מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים. עם זאת, רוב הגישות אלה אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות.

שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת. בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים)כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתיים. עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation.

מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופה ארוכה של זמן, כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic, וכי הם שומרים בתנאים אלה את אותו דפוס העצבוב שהם מראים בvivo.

על בסיס זה, אנו מתארים כיצד לבודד ושיתוף התרבות מתפתחת חיידקי הגרעינים ושן המשולש בפרוטוקול system.This שיתוף תרבות microfluidic מתארת ​​בצורה פשוטה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על אינטראקציות כאלה בcontrolled וסביבה מבודדת.

Introduction

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות ^1,2. יתר על כן, עצבוב מעורב בוויסות של התפשטות תאי גזע, גיוס ובידול ^3-5. ואכן, מחקרים שנעשה לאחרונה הבינו ברקמות של המתחם orofacial הראו כי עצבים הפאראסימפתטית נחוצים לתפקוד תאי אפיתל בפיתוח וההתחדשות של בלוטות הרוק ^6,7. באופן דומה, זה כבר הוכיח כי העצבוב הוא הכרחי לפיתוח והתחזוקה של בלוטות טעם ^8-11. לפיכך, חשוב לנתח את התפקידים עדיין המוזנחים של עצבוב בפיתוח איברים אחרים חשובים orofacial ורקמות כגון שיניים.

למרות העצבוב העשיר של שיניים למבוגרים, וז....

Protocol

כל העכברים נשמרו וטופלו על פי חוק צער בעלי החיים השוויצרי ובהתאם לתקנות של משרד הקנטון הווטרינרית, ציריך.

1. הכנת Dissection חומר, תרבות מדיה, המכשירים microfluidic

1. מלקחיים החיטוי מיקרו לנתיחה ומספריים (121 מעלות צלזיוס, זמן עיקור: 20 דקות) ולאחסן אותם במכל סטרילי.
2. לעקר coverslips זכוכית (24 מ"מ x 24 מ"מ) על ידי דוגריהם ב 1 M HCl למשך 24 שעות על שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף אותם שלוש פעמים עם סטרילי H, מזוקק

Results

תוצאות אלו מראות כי הגרעינים המשולש מבודדים יכולים לגדול בתא אחד של מכשיר microfluidic ו, בנוסף, כי הפיתוח של חיידקי שן הבודדים מתמשך לתקופה ארוכה של זמן בתא האחר של מכשיר microfluidic. תקשורת והתרבות שונה משמשות בשני תאים, וmicrogrooves בין שני התאים לאפשר הרחבה של האקסון מגנגליון trigeminal כלפי חיידקי שן המתפתחות. איור 3 מייצגת הדמיה של neurofilament באמצעות immunofluorescence ^37, בשיתוף תרבות של עכבר הגנגליון עוברי המשולש וחותך עכבר עוברי במערכת שית.......

Discussion

קודם בניסויים במבחנה של עצבוב שן היו מבוסס על שיתוף תרבויות קונבנציונליות של הגרעינים המשולש ורקמות או תאים ^26,28,29 שיניים. מחקרים אלה נערכו לחקור בעיקר את ההשפעות אטרקטיביות של תאים או רקמות אלה באקסונים חושיים ^38. למרות שמביא התקדמות משמעותית בתחום, כמה בעיות טכניות הועלו. חיידקי שן מתחילים להידרדר לאחר כמה ימים של תרבות ^37. בהתבסס על תצפיות אלה, תאי עצב ושיניים גדלו באותם תנאי התרבות לפגוע בכל ניתוח סופי של מולקולות מעורבות בשיחת ההכלא.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
התקני בידוד AXON AXIS	Millipore	AX15010-TC	מיקרו-ערוצים באורכים שונים זמינים
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
עכבר רקומביננטי beta-NGF	R& D Systems	1156-NG-100	בטא-NGF אנושי וחולדה (R& D Systems) מקבילים
ל-DMEM-F12	Gibco	11320-033