מאמר שיטה

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

DOI:

10.3791/53120

⸱

23 בנובמבר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Materials Science and Technology, Naval Research Laboratory, 2Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תקשורת בין-תאית היא קריטית לשליטה בפעילות פיזיולוגית שונות בתוך ומחוץ לתא. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת טבע מרחב ובזמן של הפרשות תא בודדות. כדי להשיג זאת, גישה רב תחומית המשלבת משמשת nanoplasmonic ללא תווית חישה עם הדמיה תא חי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תקשורת בין-תאית היא חלק בלתי נפרד ממערכת מורכבת המסייעת בשמירה על פעילות תאית בסיסית. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של איתות כזה עלול להוביל להפרעות רבות. כדי להבין איתות מתא לתא, חיוני לחקור את האופי המרחבי והטמפורלי של המולקולות המופרשות מהתא מבלי להפריע לסביבה המקומית. מבחנים שונים פותחו כדי לחקור הפרשת חלבונים, אולם שיטות אלו מבוססות בדרך כלל על בדיקות פלואורסצנטיות המשבשות את מסלולי האיתות הרלוונטיים. כדי להתגבר על מגבלה זו, נדרשת טכניקה ללא תוויות.

במאמר זה, אנו מתארים את הייצור והיישום של טכנולוגיית הדמיית תהודה פלזמון מקומית ללא תוויות (LSPRi) המסוגלת לזהות הפרשות חלבון מתא בודד. הננו-מבנים הפלזמוניים מעוצבים בצורה ליטוגרפית על כיסוי זכוכית סטנדרטי וניתן לעורר אותם באמצעות אור נראה במיקרוסקופי אור זמינים מסחרית. רק חלק קטן מכיסוי הכיסוי מכוסה על ידי הננו-מבנים ומכאן שטכניקה זו מתאימה היטב לשילוב טכניקות נפוצות כגון פלואורסצנציה והדמיית שדה בהיר.

בפרוטוקול זה נעשה שימוש בגישה רב-תחומית המשלבת ננו-ייצור חיישנים וביו-פונקציונליזציה לאחר מכן, אפיון קינטי מחייב של ליגנד ואנליט, שילוב השבב ותאים חיים וניתוח האות הנמדד. ככלל, טכנולוגיה זו מאפשרת גישה כללית ללא תוויות למיפוי הפרשות תאים ומתאם שלהן עם תגובות התאים הסמוכים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תקשורת בין-תאית חיונית להסדרת פעילויות רבות פיסיולוגיות הן בתוך ומחוץ לתא. מגוון של חלבונים ושלפוחית ​​יכול להיות מופרש שלאחר מכן יפעיל תהליכים תאיים מורכבים כגון בידול, ריפוי פצעים, תגובה חיסונית, הגירה, והתפשטות. 1-5 תקלות של מסלולי איתות בין-תאיים היו מעורבות במספר רבה של הפרעות, כולל סרטן, טרשת עורקים , וסוכרת, עד כמה שם.

Assay הפרשת התא האופטימלי צריך להיות מסוגל מרחב ובזמן מיפוי החלבון המופרש של עניין מבלי לשבש את מסלולי איתות הרלוונטיים. בדרך זו קשרים סיבתיים בין פרופילי הריכוז והתגובה של התאים שקיבלו ניתן להסיק. למרבה הצער, רב של טכניקות המבוסס על ניאון הנפוץ ביותר אינו עומד בקריטריונים אלה. חלבוני היתוך פלורסנט יכולים לשמש כדי לתייג אנליטי within התא אבל יכול לשבש את מסלול ההפרשה, או אם מופרש, תוצאות בזוהר מפוזר מחוץ לתא שקשה לכמת. מבחני מבוססי immunosandwich ניאון הם הטכניקות הנפוצות ביותר לאיתור הפרשות סלולריות אך בדרך כלל דורשים הבידוד של תאים בודדים. 6-11 בנוסף, כניסתה של נוגדן החישה בדרך כלל עוצרת או מסיימת את הניסוי ואת הגודל של תוויות הנוגדן, 150 kDa עבור IgG, הוא מכשול לאיתות במורד הזרם.

בגלל המחסומים אלה עדיף שטכניקה ללא תווית להיות מנוצלת להפרשות חלבון תמונה ובין טכנולוגיות ללא תווית קיימות, משטח תהודת plasmon (SPR) והתהודה plasmon פני השטח מקומית חיישנים (LSPR) הם מועמדים מצוינים. 12-17 אלה חיישנים היו בשימוש נרחב ללימודים מחייבים אנליטי של חלבונים, exosomes וסמנים ביולוגיים אחרים. 18-24 במקרה של LSPR, nanostr plasmonicuctures ניתן בדוגמת lithographically על coverslips זכוכית ונרגש באמצעות אור נראה דרך תצורות מיקרוסקופ שדה רחב סטנדרטיים. בשל טביעת רגל ננו, רוב מצע הזכוכית זמין עבור טכניקות הדמיה נפוצות כגון שדה בהיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי ביצוע בדיקות אלה גם מתאים לשילוב עם מיקרוסקופ לחיות תאים. 25-28 אנחנו הוכחנו מדידה בזמן אמת הפרשות נוגדנים מתאי hybridoma באמצעות ננו plasmonic זהב פונקציונליות עם החלטות מרחב ובזמן של 225 אלפיות שני ו -10 מיקרומטר, בהתאמה. תצורת השבב הבסיסית מתוארת באיור 1. 28 נתיב פלט האור של המיקרוסקופ הוא פיצול בין מצלמת CCD המשמשת להדמיה וספקטרומטר בשילוב סיבים אופטי-לקביעה כמותית של התפוסה החלקית של מערך נתון של ננו (איור 2 ).

Protocol מוצג במאמר זה מתאר את תכנון הניסוי למדידת הפרשות תא בודדים בזמן אמת תוך מעקב התגובה של התאים באמצעות מיקרוסקופ השדה בהיר הסטנדרטי בו-זמנית. גישה רב תחומית כוללת ייצור של ננו, functionalization של ננו לזיקה הגבוהה המחייבת של analytes, אופטימיזציה משטח לשני מכשיר מזעור מחייב שאינו ספציפי ואפיון קבועי קצב קינטית באמצעות משטח מסחרי Plasmon תהודה (SPR), שילוב של שורות תאים על גבי המצע, והניתוח של דימויים ונתוני רפאים. אנו צופים בטכניקה זו כדי להיות טכנולוגיה המאפשרת למיפוי המרחב ובזמן של הפרשות תא והקשרים סיבתיים שלהם עם תאים מקבלים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצור ננו-מבנה 1.

  1. בחר 25 מ"מ coverslips זכוכית קוטר עם עובי משוער של 170 מיקרומטר (מס '1.5) כמצעים לnanofabrication.
  2. לטבול את coverslips בפתרון פיראניה (3: 1 יחס של חומצה גופרתית ומי חמצן) במשך לפחות 6 שעות. לשטוף את coverslip הספוג פיראניה עם כמות עצומה של ultrapure 18.2 MΩ deionized מים מזוקקים (DDW).
    זהירות: חומצת Piranha מגיבה באלימות עם חומרים אורגניים ויש לטפל בם בזהירות רבה.
  3. סרט דק הפקדת 10 ננומטר כרום על coverslips על ידי אידוי קורה אלקטרוני כדי למנוע תופעות תשלום בדפוסים וההדמיה של ננו.
  4. ספין את השכבה הראשונה של bilayer להתנגד בהיקף של methacrylate מתיל אתיל חומצת החלב קופולימר (MMA_EL6) ב 2000 סל"ד במשך 45 שניות ולאחר מכן לאפות ב 150 מעלות צלזיוס. ספין השכבה השנייה של methacrylate פולי-מתיל (950PMMA_A2) בסל"ד 3000 במשך 45 שניות ולאחר מכן לאפות ב 180 מעלות צלזיוס.
  5. לַהַגn להתנגד bilayer באמצעות קרן אלקטרונים ליתוגרפיה (EBL) ב 25 ק עם מינון שטח של 300 μC / 2 סנטימטר. לפתח באלכוהול איזופרופיל / קטון (IPA) מתיל isobutyl (MIBK): 2/1 ולשטוף בIPA.
  6. ההפקדה Ti (5 ננומטר) / סרט Au (80 ננומטר) על המצע באמצעות מאייד קורה אלקטרוני.
  7. בעקבות תצהיר הזהב, להרים את bilayer קופולימר להתנגד ידי השרייה המצע באצטון במשך 4 שעות.
  8. בדוק את המצע באמצעות מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק (SEM) כדי לאשר צורת ננו-מבנה וגודל, להסיר את הכרום שנותר מהמצע באמצעות לחרוט רטוב באמצעות CR-7 etchant עבור 60 שניות ב RT ולאחר מכן לשטוף בDDW.
  9. עיצוב מרווח מערך מרכז למרכז 33 מיקרומטר להשאיר מקום להדמית תא בין מערכים. תבנית ננו 20 x 20 תבנית לכל מערך עם המגרש של 300 ננומטר באמצעות סופר קורה אלקטרוני. כל שבב מכיל 300 מערכים עם ממד ננו-מבנה אופייני לגובה 80 ± 2.5 ננומטר ו -70 ננומטר ± diame 2.5ter.
  10. בדוק משנה של מערכים באמצעות מיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM) עבור האימות של גודל ואחידות.
  11. צרף טבעת תמיכה, בדרך כלל סיליקון, לחלק האחורי של coverslip באמצעות אפוקסי ריפוי UV.

2. שבב ניקוי ויישום של חד שכבתי התאסף עצמית

  1. לניקוי והתחדשות השבבים, אפר פלזמה בכוח של 40 וואט בתערובת 300 mTorr של מימן 5%, ארגון 95% במשך 45 שניות לאחר ניקוי התא למשך 5 דקות באותם תנאים.
  2. Functionalize ננו הזהב מייד לאחר ashing הפלזמה ידי טבילת השבב בפתרון תיאול האתנולית שני מרכיבים המורכב של יחס 3: 1 של SH- (CH 2) 8 -EG 3 אה (SPO) ורכיב עם או אמין או קבוצה פונקציונלית carboxyl, כלומר, SH- (CH 2) 11 -EG 3 -NH 2 (SPN) או SH- (CH 2) 11 -EG 3 -COOH (SPC).
  3. השאר אותי השבבn O פתרון תיאול / N כדי ליצור monolayer עצמית התאספו (SAM).
  4. יש לשטוף את השבב עם אתנול ויבש עם גז חנקן.
  5. במידת הצורך, לאחסן השבב פונקציונליות של עד 2 שבועות על 4 מעלות צלזיוס.
  6. כשמוכן לשימוש להגיב SPN או רכיב SPC עם יגנד באמצעות כימיה בהתאם ליגנד של בחירה (ראה להלן).
    הערה: יכולים להיות מחדש השבבים ועשרות-פונקציונליות מחדש של פעמים. שבב נתון יכול לשמש לתקופות שנעות בין 6 חודשים ליותר משנה. הספקטרום נמדד על מערך נתונה לשכפל באופן מהימן לאחר regenerations חוזר ונשנה של ashing פלזמה, ואחריו biofunctionalization. 29

3. Functionalization השטח וקינטי אפיון

הערה: השתמש בשבב פונקציונליות במכשיר SPR המסחרי לאפיין את קבועי קצב הקינטית בין יגנד ואנליטי, כמו גם ללמוד את ההתנגדות של סם ב הלא ספציפיinding. יש מגוון רחב של ספיקות ועיצובי microfluidic המאפשרים functionalization משטח יעיל. מאז יש לנו SPR זמין מסחרי שטופלנו סביב ספיקות המומלצות. נציין כי ספיקות אלה הן אופייניות לכל מכשירי SPR ולכן הם לא מגבילים. מכשיר SPR הוא לא הכרח שכן כל functionalization יכול להתבצע ישירות על שבב LSPR, אבל זה לא להפחית עומס העבודה שלנו כי זה מכשיר מרובב ואילו הגדרת microfluidic LSPR שלנו היא לא.

  1. Functionalize שבב זהב חשוף מסחרי עם SAM כפי שתואר בסעיף 2.
  2. אם באמצעות SAM מבוסס SPC, להפעיל את קבוצת carboxyl עם 1: 1 תערובת של 133 מ"מ של 1-אתיל-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ו -33 מ"מ של -hydroxysuccinimide N (NHS) בDDW 10 דקות.
  3. להטות קבוצת carboxyl מופעלת עם הנוגדן / יגנד של עניין עבור 300 שניות באמצעות קצב זרימה של 30 μl / דקה. הכן את הליגנדים בpH 6 חיץ פוספט, בדרך כלל, אבל זה יכול להשתנות בהתאם למולקולה.
  4. לאחר נטיה ליגנד, לזרום 0.1 M ethanolamine בנאגר מלוח פוספט (PBS) כצעד deactivator עבור 300 שניות בשיעור של 30 μl / דקה. Ethanolamine מסייע במזעור המחייב שאינו ספציפית.
  5. להציג אנליטי של ריבית בקצב זרימה של 100 μl / דקה באמצעות מגוון של ריכוזים ולחשב את קבועי קצב קינטית באמצעות תוכנת ניתוח קינטית.
  6. אם אינו ספציפי מחייב הוא בעייתי, להגדיל את היחס של SPO לSPC או SPN.

4. LSPR הגדרות כלליות

  1. הגדרות מיקרוסקופ:
    1. השתמש במנורת הלוגן W 100 לקוהלר להאיר את המדגם. השתמש במסנן מסירה ארוך (בדרך כלל 593 הפסקת ננומטר) בנתיב האור לחסל אורכי גל שאינו תורם לשינוי התהודה (איור 2).
    2. לאיסוף נתונים LSPRi, להשתמש במיקרוסקופ הפוכה עם immersio שמן 40Xמטרת n (1.4 NA) וthermoelectrically מקורר מצלמת CCD 16 ביט.
    3. הנח מפצל קרן ביציאת הפלט של מיקרוסקופ כדי להשיג תמונות וספקטרום בו-זמנית.
    4. הגדר את הבמה מיקרוסקופ טמפרטורה מבוקרת עד 37 ° C ולאזן במשך 4 שעות.
    5. לשלב הרכבה דגירה נוספת על מיקרוסקופ כדי להסדיר את ריכוז CO 2 ולחות של 5% ו -95%, בהתאמה.
  2. הכנת שבב והרכבה:
    1. Functionalize שבב LSPR כפי שתואר בסעיף 2 ביחסי SAM אופטימלי שני המרכיבים נקבעו מהניסויים SPR.
    2. טען את השבב בתוך מחזיק microfluidic מותאם אישית כדלקמן. מניחים את השבב על חתיכה תחתונה אלומיניום. כריך השבב בין זה חתיכה תחתונה ואטם סיליקון וחתיכה עליונה פלסטיק שקופה. השתמש 4 ברגים כדי להדק את ההרכבה.
    3. ליישום תיאול מבוסס SPC טיפוסי, שחרר מעיל 300 μl 1: לערבב 1ture של 133 מ"מ של EDC ו -33 מ"מ של NHS בDDW להפעיל קבוצות carboxyl של רכיב תיאול SPC.
    4. חכה 10 דקות ולשטוף באופן ידני את פני השטח עם 10 מ"מ PBS.
    5. להטות קבוצת carboxyl מופעלת עם יגנד (בדרך כלל שבר נוגדנים או נוגדן) של ריבית על ידי ירידת ציפוי 300 μl של פתרון ליגנד.
    6. חכה 30 דקות ולשטוף באופן ידני עם 10 מ"מ PBS.
    7. זרוק מעיל 300 μl של 0.1 מ 'ethanolamine בPBS על השבב כדי למזער מחייב ספציפי. חכה 10 דקות.
    8. שטוף את ethanolamine עם PBS המכיל 0.005% Tween 20 (PBS-T20).
    9. מניחים פיסה מעל השבב קוורץ להפחית תנודות בנתונים הקשורים להמניסקוס שינוי.
    10. שמור את השבב רטוב עם חיץ PBS-T20 תוך גובר על מיקרוסקופ.
    11. הנח את מכלול שבב LSPR בחוזקה לבעל מדגם במה המחומם ולצרף צינורות microfluidic.
    12. לצרף את צינורות מיקרופלואידיקה לbu ההרכבה והזרימהffer (או מדיה סרום חופשית ללימודי תא) עד למצב יציב הוא הגיע.
    13. לאפשר ההרכבה ומיקרוסקופ כדי לאזן לפחות 2 שעות.
    14. יישר את השבב באמצעות ג'ויסטיק, כך שהמערך המרכזי מיושר עם הסיבים האופטיים לספקטרוסקופיה. נתונים ספקטרוסקופיות נלקחים באמצעות ספקטרומטר ותוכנת ניתוח ספקטרלי.
    15. שמור מערכים בפוקוס לאורך הניסוי באמצעות תוכנת פוקוס אוטומטי, פוקוס Definite Zeiss או מכשיר אוטומטי שווה ערך.

5. הדמיה LSPR של פרשות אנטי-c-myc מ9E10 תאי Hybridoma

הערה: קו תא hybridoma משמש למחקר זה להביע נוגדן אנטי c-myc constitutively ולכן אינו דורש הדק כימי

  1. Functionalize ננו עם פפטיד c-myc. יש לכך ערך K D של 1.77 ננומטר לנוגדנים אנטי-c-myc מופרשים על ידי שיבוט 9E10 תאי hybridoma.
  2. תרבות תאי hybridoma בcompletמדיום גידול דואר עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקת 1% בבקבוק T75 ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2. לשמור על צפיפות תאים של 4 × 10 5 תאים / מיליליטר.
  3. למחקרי הפרשת תא, תאים גלולה מהבקבוק T75 ידי צנטריפוגה, לשטוף פעמיים עם RPMI-1640 מדיה סרום חופשית (SFM) כדי להסיר את הנוגדנים המופרשים ולהתאים את צפיפות תאי 4 × 10 6 תאים / מיליליטר.
  4. קציר התאים ובדיקת כדאיויות לפני מציג אותם לשבבי LSPR.
  5. להציג את 50 μl של פתרון התא באופן ידני על גבי שבבי LSPR עם micropipette. אחרי כמה דקות 25 עד 50 תאים לדבוק פני השטח של שבבי LSPR.
  6. לשטוף את התאים שנותרו בפתרון עם SFM הטרי באמצעות מערכת זלוף microfluidic.
  7. בחר את מערכי LSPR הדמיה שהם קרובים, בתוך 10 מיקרומטר, אך לא חופף עם התאים.
  8. כדי להבטיח שהאות היא ספציפית לantib אנטי c-myc מופרשodies להציג תקשורת תרבות תא עם ובלי הנוגדנים הנוכחיים, כמו גם עם הנוגדנים אבל עם אתרי הקישור שלהם נחסמו על ידי הנוכחות של ריכוז להרוות של פפטיד c-myc בפתרון.
  9. לכייל את החיישנים בסוף כל סיבוב עם פתרון להרוות של נוגדנים אנטי-c-myc (250 ננומטר). זה עוזר בנרמול התגובה של החיישנים ולקבוע התפוסה חלקית המבוססת על פרופיל biofunctionalization של כל ריצה.
  10. תקן את הסחף בכיוון X ו- Y באמצעות תוכנת יישור תמונה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר שנערך הפרשת תא חי טיפוסי יש מצבים רבים של איסוף נתונים מתרחש. איור 3 מראה כיסוי של תמונת LSPRi, אשר מדגישה את המערכים רבועים, ותמונה מוארת אור מועבר אשר מדגישה את התא בפינה השמאלית תחתונה. הנתונים נאספים בדרך כלל על פני תקופה של 3 שעות ואחרי ההקדמה של פתרון להרוות של אנליטי לחישוב הנורמליזציה המתואר להלן. דימויי הקרינה יכולים גם להיות משולבים בשגרת איסוף נתונים על ידי המיתוג האוטומטי של קוביית מסנן. באיור 4 תא מוכתם בDHPE rhodamine צבע קרום הניאון מציג סיומות כמו lamellipodia (חיצים). אם הרחבות כאלה היו חפיפה עם המערכים הם היו נותנים חיוביים שגויים להפרשת חלבון. יש מצבים רבים של דימויים יכול לעזור לזהות מקרים כאלה.

איור 5 מראה נתונים ספקטרומטריית לפני ומאחוראה ההקדמה של פתרון להרוות (400 ננומטר) של לרכוש מסחרי נוגדנים נגד c-myc למערכים פונקציונליות c-myc. לא תאים נכחו בניסוי זה. הספקטרום מציג שני משמרות אדומות ועלייה בעוצמת. ההבדל בין האזורים בשתי עקומות תוצאות בעלייה בעוצמת תמונת המערך במצב LSPRi על מצלמת CCD. גישת ניתוח נתונים ריבועים פחותים שאינו ליניארי פותחה כדי להסיק התפוסה חלקית של ligands משטח מחויב מהספקטרום. 30,31

בסוף הניסוי, את ערכי העצמה רוויה (כלומר, ≈ תפוסת השבר 1) משמשים לחישוב תגובה מנורמלת עבור כל מערך באמצעות הנוסחה הבאה:

איפה עוצמה המנורמלת בt נקודת הזמן, עוצמת ראשונית בתחילת הניסוי, עוצמת רוויה סופית, ועוצמת נמדדת של המערך בt נקודת הזמן

ערכים מנורמלים משני מערכים מוצגים באיור 6. מערך אחד היה בתוך 10 מיקרומטר של התא תחת חקירה ואילו השני, המשמש כביקורת, היה במרחק של 130 מיקרומטר מהתא. העלייה הפתאומית בתגובה המנורמלת של המערך הקרוב ביותר לתא ביחס לתגובה השטוחה של מערך הבקרה מעידה על התפרצות מקומית של נוגדנים מופרשים.

figure-results-1
איור 1. חיישן עיצוב. ציור המתאר את הגיאומטריה של ניסוי הפרשת תא חי טיפוסי. התא (אליפטית הכחולה) מופקד על שבב LSPR המכיל מערכים של ננו זהב biofunctionalized. בתצוגה המוגדלת-ב, הפרשת התא של עניין, במקרה נוגדנים זה מוצגים כמולקולות בצורת אות V, נמדד כהם נקשרים אל פני השטחשל ננו פונקציונליות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. התקנה אופטית. האור האיר ממנורת הלוגן מסונן ראשון על ידי מסנן מסירה ארוכה (LP). האור מקוטב ליניארית (P1) ומאיר את המדגם באמצעות אובייקטיבי NA 40X / 1.4. האור המפוזר נאסף על ידי המטרה ועבר דרך מקטב חצה (P2). מפצל 50/50 קרן (BS) מוכנס לתוך נתיב האור שנאסף לספקטרוסקופיות בו זמנית וניתוח הדמיה. למעלה מימין:. תמונה מיקרוסקופית כוח אטומית של 9 ננו הבודד מופרד על ידי המגרש של 300 ננומטר אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3. תא חי LSPRi לימוד. התמזג אור מועבר ותמונת LSPRi מראה תא בודד hybridoma (שמאלי תחתון) מוקף 12 מערכים. זוהי תמונת ניגודיות משופרת. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4. תא חי פלואורסצנטי הלימוד. תמונה צבעונית שווא ניאון של תא hybridoma אחת מוכתם בDHPE rhodamine, שהוא צבע קרום. במצב הדמיה ניאון המערכים הם בדרך כלל לא נראים לעין, עם זאת, מערך סמוך הוא לצפייה כאן כabחסרים כיכר בפינה הימנית התחתונה. התא ניתן לראות להיות מופרד מהמערך למרות סיומות כמו זרוע (אולי filopodia או lamellipodia) מאריכים החוצה מהתאים (חיצים). סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5. Spectral לערוץ. הספקטרום המתקבל ממערך פונקציונליות c-myc לפני ואחרי כניסתה של 400 ננומטר פתרון של נוגדנים אנטי-c-myc. לא תאים נכחו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6 איור 6. הפרשת תא בודדת. התגובה של מערך ממוקם בתוך 15 מיקרומטר של תא בודד ואחד הממוקם במרחק 130 מיקרומטר (בקרה). סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לטכניקת ההדמיה LSPR המתוארת בעבודה זו יתרונות רבים על פני מתודולוגיות מסורתיות יותר לגילוי הפרשות תאים. ראשית, רזולוציית הזמן של הטכניקה שלנו היא בסדר גודל של שניות בעוד שהחלופה המסחרית, בדיקת אימונו-חול הידועה בשם EliSpot, היא בעלת רזולוציית זמן טיפוסית של 2 עד 3 ימים. כתוצאה מכך הצלחנו לפתור שינויים פתאומיים בקצב הפרשת החלבון, כמו זה שמוצג באיור 6. שנית, פיזור מערכים על פני השבב מאפשר לעקוב אחר האות המופרש במרחב ובזמן, מה שמאפשר השוואות קפדניות יותר למודלים מבוססי דיפוזיה של הפרשת תאים. בנוסף, ניתן להשתמש במערכים כמו מערך הבקרה המוצג באיור 6 כדי להפחית שינויים גלובליים בתמונה הנובעים בדרך כלל מגורמים אינסטרומנטליים כגון סחף מיקוד. שלישית, הטכניקה שלנו אינה דורשת שינוי של התאים. אם תרצה, הניסוי יכול לשלב תגים נפוצים כגון חלבונים פלואורסצנטיים, אך אם יש חשש שתגים כאלה עלולים להשפיע לרעה על כדאיות התא או ההומאוסטזיס, האופי נטול התווית של הגישה שלנו אינו דורש אותם. רביעית, באמצעות הנתונים הספקטרוסקופיים הראינו שניתן לחשב מידע כמותי לגבי התפוסה החלקית של ליגנדים קשורים לפני השטח.

ישנן שיטות חלופיות רבות ל-EBL לייצור ננו-חלקיקים מתכתיים. עם זאת, מצאנו כי ה-EBL מספק גמישות ניכרת לאופטימיזציה של ממדי ננו-מבנה ומערך כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לאופטיקה ולתאים הנחקרים. קריטית גם העובדה שניתן לחדש את השבבים בקלות על ידי אפר פלזמה. באופן זה ניתן להשתמש בשבב טיפוסי עשרות פעמים. יש לשנות את פרטי הפונקציונליזציה הביולוגית עבור היישום הספציפי. הפרוטוקול המוצג כאן צימד את פני השטח עם ליגנדים קטנים יחסית של פפטיד c-myc. ליגנדים גדולים יותר כגון נוגדנים שלמים דורשים בדרך כלל יותר מרווח ולכן יחס SPO ל-SPN/SPC גבוה יותר. בלי קשר, שכבת SAM מעוצבת היטב חיונית למניעת קשירה לא ספציפית בניסויים בתאים חיים. באופן כללי, אנליטים בעלי משקל מולקולרי גדול יותר מזוהים בקלות רבה יותר על ידי LSPR. לפיכך, בביטוי התא הבודד שלה, טכניקה זו עשויה שלא להתאים לאיתור הפרשת חלבונים קטנים, כגון ציטוקינים.

ההגדרה הנוכחית שימשה לחקר תאים בודדים שאינם נצמדים. יש מספר משמעותי של חלבוני איתות ושלפוחיות מופרשים שהתוצאות המדווחות בעבודה זו ישימות אליהם ישירות. למשל אנטיגן קרצינו-עוברי (CEA), שכבר עשרות שנים מהווה סמן אבחנתי לסרטן. ידוע כי תאי סרטן המעי הגס מפרישים CEA בקצב של אלפי מולקולות/תא/שעה והמשקל המולקולרי הוא 180 kDa העולה על זה של נוגדני IgG. מאמינים כי CEA מעורב במסלולי איתות אוטוקריניים ופרקריניים, אך האופי המרחבי-זמני של הפרשות אלה מעולם לא נמדד. הטכניקה שלנו יכולה לענות ישירות על שאלות איתות אלה. הרחבה של עבודה זו תהיה למדוד את האופי המרחבי-זמני של הפרשת CEA מתאים בודדים. 33 העבודה העתידית תתמקד גם בשילוב LSPRi עם תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות של תאים נצמדים. על ידי שילוב מערכים מרובים המסוגלים לזהות מספר חלבונים מופרשים במקביל, לטכניקה זו יש פוטנציאל לפתוח צוהר חדש להפרשות התאים ולאופן שבו הן משפיעות על תאים שכנים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'ורג' אנדרסון על ההערות והדיונים המועילים. עבודה זו נתמכה על ידי המכון לננו-מדע של מעבדת המחקר הימית ופרס עמית המחקר של מועצת המחקר הלאומית.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
25  כיסויי זכוכית בקוטר מ"מ כליביו-מדע CSHP-No1.5-25  170± 5 ומיקרו; m הוא אופטימלי
פולי-מתיל מתאקרילטMicrochemPMMA 950 A4
אתיל לקטט מתיל מטקרילטMicrochemMMA EL6
מאייד קרן אלקטרוניםTemescalFC-2000
ליתוגרפיה של קרן אלקטרוניםRaithSeries 150
אתנולסיגמא-אולדריץ'459836
אצטוןSigma-Aldrich320110
CR-7 תחריט כרוםCyantekCR-7
מיקרוסקופ אלקטרונים סורקZeissUltra 55
מיקרוסקופ כוח אטומיVeecoNanoscope III
מערכת אפר פלזמהTechnicsSeries 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)ProchimiaTH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)ProchimiaTH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)ProchimiaTH 002-m11.n3-0.2
מערכת תהודה פלזמון פני השטחBioradXPR36
שבב זהב חשוףשבב BioradGLCפלזמה אפר להסרת החד-שכבתי
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimideThermo22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)Thermo24510
פנטילמין-ביוטין         Thermo21345
אתנולמיןSigma-AldrichE9508
NeutraavidinThermo31000
פוספט חוצץ מלחThermo28374
Tween 20Sigma-AldrichP2287
מיקרוסקופ הפוךZeissAxio Observerמיקרוסקופ מצויד במטרת טבילת שמן פי 40; CO2 ודגירה של לחות ממצלמת CCD של Pecon GmbH
HamamatsuOrca R2מקורר תרמו-אלקטרי (16 סיביות)
ספקטרומטראופטיקה אוקיינוסQE65Pro
Spectrasuiteאופטיקה אוקיינוסגרסה 1.4
c-myc פפטיד HyNic TagSolulinkSP-E003
נוגדןחד שבטי נגד c-mycSigma-AldrichM4439
קו תאים היברידומהATCCCRL-1729
תמיסה אנטיביוטית אנטי-מיקוטית (100 ופעמים;)סיגמא-אולדריץ'A5955
סרום מדיה חופשית RPMI 1640 Invitrogen  11835-030 
סרום בקר עובריATCC30-2020
רודמין DHPELife TechnologiesL-1392

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ludwig, A. -K., Giebel, B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).
  2. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Letterio, J. J., Roberts, A. B. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).
  4. Werner, S., Grose, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).
  5. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).
  6. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).
  7. Gazagne, A., et al. A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).
  8. Han, Q., et al. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).
  9. Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).
  10. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).
  11. Shirasaki, Y., et al. Real-time single-cell imaging of protein secretion. Scientific Reports. 4, (2014).
  12. Milgram, S., et al. On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin. Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).
  13. Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).
  14. Ermakova, A., et al. Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds. Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).
  15. Haes, A. J., Van Duyne, R. P. A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).
  16. Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).
  17. Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4, 244-251 (2009).
  18. Barbillon, G., et al. Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance. Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).
  19. Endo, T., et al. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip. Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).
  20. Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).
  21. Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease. Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).
  22. Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).
  23. Park, J. H., et al. A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A. Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).
  24. Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance. Nanotechnology. 21, (2010).
  25. Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).
  26. Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).
  27. Oh, B. R., et al. Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood. ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).
  28. Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time. Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).
  29. Raphael, M. P., et al. A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).
  30. Raphael, M. P., et al. Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution. Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).
  31. Raphael, M. P., et al. A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).
  32. Henn, A. D., et al. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).
  33. Bramswig, K. H., et al. Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis. Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LSPRi

מאמרים קשורים