מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

זיהומים נגיפיים מהווים איום מתמיד על בריאות הציבור וגורם משמעותי למחלות מגיפות, תחלואה ומקרי מוות ברחבי העולם. דרכי בקרה ספציפיות נגד זיהומים נגיפיים כוללות פיתוח חיסונים וטיפולים אנטי-ויראליים. בעוד שמאמצי החיסון הוכיחו את עצמם כמוצלחים בחיסון נגד מספר נגיפים, פתוגנים נגיפיים רבים נותרו ללא חיסון מגן כולל נגיף דנגי (DENV), ציטומגלווירוס אנושי (HCMV), נגיף הפטיטיס C (HCV), נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) ווירוס סינציאלי נשימתי (RSV)^1-5. תרופות אנטי-ויראליות, לעומת זאת, ממלאות תפקיד חשוב בניהול זיהומים נגיפיים אלה כאשר חיסונים מונעים אינם זמינים. עם זאת, נכון להיום, רק מעט תרופות אנטי-ויראליות מורשות וחסכוניות זמינות בהשוואה למספר הפתוגנים הנגיפיים המאיימים על בריאות הציבור. חשוב מכך, בשל עלייה בנסיעות העולמיות ועיור מהיר, המצב מחמיר על ידי סיכונים להתפרצויות מגיפה מזיהומים נגיפיים מתעוררים/מתעוררים מחדש המוחדרים לאזורים שאינם ילידים⁶. התפרצויות שנגרמו לאחרונה על ידי נגיף SARS, נגיפי שפעת (H1N1, H5N1, H3N2 ו-H7N9), DENV, נגיף הנילוס המערבי (WNV), נגיף החצבת (MV), נגיף התסמונת הנשימתית המזרח תיכונית (MERS) ונגיף האבולה^6-12 הן בין הדוגמאות המשקפות את הצורך בפיתוח תרופות אנטי-ויראליות כאשר חיסונים ו/או טיפולים אינם זמינים. בנוסף, תמיד קיים סיכון פוטנציאלי ליצירת זיהומים עמידים לתרופות עם תרופות אנטי-ויראליות הנמצאות בשימוש כיום. לפיכך, פיתוח והרחבה מתמשכים של היקף התרופות האנטי-ויראליות לזיהומים נגיפיים מתעוררים/מתעוררים מחדש נחוצים כדי לספק אסטרטגיות ניהול טובות יותר ולשמור על בריאות הציבור.

רוב הטיפולים האנטי-ויראליים מורכבים מתרופות אנטי-ויראליות בפעולה ישירה (DAAs) המכוונות לחלבון או קופקטור ויראלי ספציפי המתווך שלבים חשובים במחזור החיים הנגיפי. לדוגמה, אנלוגי הנוקלאוזידים אציקלוביר מעכב DNA פולימראז של נגיף ההרפס, מעכבי פרוטאז Boceprevir ו-Telaprevir מנוגדים ל-HCV NS3, ואוסלטמיביר וזנמיביר הם מעכבי נויראמינידאז החוסמים את שחרור חלקיקי נגיף השפעת מתאים נגועים^13-15. עם זאת, ישנם מעט מאוד מעכבי כניסה ויראלים מורשים, כולל Enfuvirtide, המכוון ל-HIV gp41 כדי למנוע איחוי, ו-Maraviroc, החוסם את הקולטן המשותף ל-HIV CCR5, ובכך מונע כניסה לנגיף¹⁶. חקירת אנטגוניסטים/מעכבים חדשים לכניסה לנגיף יכולה לסייע במתן טיפולים נוספים לשימוש מונע או טיפולי, כגון בשילוב עם תרופות אנטי-ויראליות אחרות עם מנגנון פעולה שונה לניהול טוב יותר של זיהומים נגיפיים^17-19.

זיהוי תרופות אנטי-ויראליות יכול לכלול תכנון תרופות מונחה מבנה ואסטרטגיה מבוססת סינון תרופות מועמדים. שיטות להערכת פעילות אנטי-ויראלית של סוכני בדיקה כוללות בדיקות ביוכימיות של פעילות אנזימטית והערכה על ידי מערכות מבוססות תאים^20-23. במערכות מבוססות תאים, ניתן לנתח את מחזור החיים הנגיפי לשלבי זיהום מובחנים, כגון אירועי כניסה (התקשרות, היתוך, הסרת ציפוי), שלב השכפול (שכפול גנום ויראלי ותרגום חלבון) ויציאת ויריון (הרכבה, התבגרות ושחרור). מכיוון שניתן להתאים את הבדיקות לחקירת כל שלב ספציפי באמצעות כלים ושיטות שונות, גישה זו מאפשרת זיהוי/בחינה של תרופות אנטי-ויראליות מועמדות פוטנציאליות עם מנגנון פעולה ספציפי המכוון לשלב הייחודי המנותח. לדוגמה, כדי לנתח את השפעת התרופה באופן ספציפי על חלקיקי הנגיף החופשי לפני הקישור לתא המארח, ניתן לבצע 'בדיקת השבתה ויראלית'. בבדיקה זו, הנגיף מורשה לדגור עם תרופת הניסוי ולאחר מכן מדולל כדי להוציא את התרופה לפני הדבקת תא חד-שכבתי. ניתן לנתח שלבים נוספים כגון חיבור ויראלי ושלבי כניסה/היתוך בנפרד, על ידי שינוי הטמפרטורה במהלך ההדבקה. עבור נגיפים עטופים רבים, כניסה/היתוך ויראלי בקרום התא המארח מקל מאוד ב-37 מעלות צלזיוס, אך בדרך כלל נמנע ב-4 מעלות צלזיוס, מה שאינו משפיע על קשירת הנגיף^24-29. לבסוף, השימוש בנגיפי דיווח או במערכות תאים יכול להקל על מחקרים אלה ולאפשר ניתוח תפוקה גבוהה.

בעבר השתמשנו בגישה מבוססת תאים וניתחנו את הכניסה המוקדמת של נגיפים עטופים שונים לבחינת תרכובות אנטי-ויראליות שעלולות לעורר אנטגוניזם^30,31. כאן מתוארות השיטות השונות בהן נעשה שימוש, כולל השבתה ויראלית, התקשרות ויראלית ומבחני כניסה/היתוך ויראליים.

הערה: ודא שכל ההליכים כרוכים בתרבית תאים וזיהום בנגיף מתנהלים בברדסי בטיחות ביולוגית מוסמכים המתאימים לרמת הבטיחות הביולוגית של הדגימות בטיפול. לצורך המתאר את הפרוטוקולים, HCV-מתויג כתב בלוציפראז Gaussia משמש כוירוס מודל ^32. בהקשר של תוצאות הנציג, חומצת chebulagic תרכובות (CHLA) וpunicalagin (PUG) משמשים כאנטי-נגיפיים מועמד כי יעד אינטראקציות גליקופרוטאין נגיפיים עם glycosaminoglycans פני תא בכניסת ויראלי מוקדם שלבים ^31. הפרין, אשר ידוע להפריע לכניסה של וירוסים רבים ^30,31,33,34, משמש כטיפול שליטה חיובי בהקשר כזה. לרקע בסיסי על טכניקות וירולוגיה, התפשטות של וירוסים, קביעת כייל נגיף, וביטוי של מינון זיהומיות ביחידות פלאק ויוצרים (PFU), להתמקד יחידות יוצרים (FFU), או ריבוי של זיהום (משרד הפנים), הקורא הוא מחדשהופנה להתייחסות ^35. לדוגמאות קודמות ותנאים מותאמים המשמשים לאיתור וירוסים המוצגים בתוצאות הנציג, הקורא נקרא אזכור ^30-32,36-39 כמו גם פרטים המופיעים בטבלה 1, איור 1 א, ואיור 2 א.

תרבות 1. תא, הכנת מתחם, וCytotoxicity מתחם

1. לגדול קו התא המתאים למערכת הזיהום בנגיף להיות מנותח (טבלה 1). לHCV, לגדול הא-7.5 תאים בינוניים השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), 200 U / פניצילין G מיליליטר, 200 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B.
2. הכן את תרכובות בדיקה ובקרת שימוש בממסים שלהם: למשל, לפזר CHLA ופג בsulfoxide דימתיל (DMSO); להכין הפרין במים מזוקקים כפולים סטרילי. לכל דילולים הבאים, להשתמש בתקשורת ובתרבות.
   הערה: concent הסופימנה של DMSO בטיפולי מתחם מבחן היא פחות מ -1% בניסויים; DMSO 1% כלולים כטיפול ביקורת שלילי במבחנים להשוואה.
3. לקבוע הרעיל של תרכובות הבדיקה (למשל, CHLA וPUG) בתאים לזיהום ויראלי באמצעות קביעת כדאיות תא מגיב כמו XTT (2,3-bis [2-methoxy-4-ניטרו-5-sulfophenyl] -5-Phenylamino) -carbonyl] -2H-tetrazolium הידרוקסיד):
   1. לHCV, זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 ⁴ תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO ₂ O / N להשיג שכבה.
   2. החל שליטת DMSO (1%) או ריכוזים הולכים וגדל של CHLA תרכובות בדיקה וPUG (לשעבר. 0, 10, 50, 100, ו -500 מיקרומטר) לבארות התרבות בשלושה עותקים.
   3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות, ואז להשליך את המדיום בצלחת ולשטוף את התאים עם 200 μl של נאגר מלוח פוספט (PBS) פעמיים.
   4. להוסיף assayin של 100 μlפתרון גרם מערכה במבחנה assay טוקסיקולוגיה מבוססת XTT לכל היטב דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך עוד 3 שעות כדי לאפשר XTT ייצור formazan.
   5. לקבוע את הספיגה עם קורא microplate באורך גל של 492 ננומטר בדיקה ואורך גל של 690 ננומטר התייחסות.
   6. לחשב את אחוז הישרדות תאים באמצעות הנוסחה הבאה: כדאיות תא (%) = ב/ כ× 100%, שבו 'ב'ו' בשם 'מתייחס לספיגה של תרכובות הבדיקה ובקרת הממס (לשעבר DMSO 1%. טיפולים), בהתאמה. קבע את הריכוז של 50% רעילים סלולארי (CC ₅₀₎ של תרכובות בדיקה מתוכנה אנליטיים כגון GraphPad פריזמה על פי הפרוטוקול של היצרן.

2. Readout של זיהום ויראלי

הערה: קריאת הנתונים של זיהום ויראלי תלוי במערכת הווירוס השתמשה ויכולות לערב שיטות כגון מבחני פלאק או מאה שSuring אותות כתב מוירוסים מתויג כתב. השיטה לאיתור זיהום הכתב-HCV מבוסס על פעילות הכתב בלוציפראז מתוארת להלן.

1. לאסוף supernatants מהבארות נגועות ולהבהיר ב17,000 XG ב microcentrifuge למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
2. מערבבים 20 μl של supernatant מבחן 50 μl של מצע בלוציפראז מערכת assay בלוציפראז Gaussia ולמדוד ישירות עם luminometer לפי הוראות היצרן.
3. הגעה infectivity HCV כיומן ₁₀ יחידות יחסי אור (RLU) לקביעת עיכוב נגיפי (%) ולחשב את 50% הריכוז יעיל (EC ₅₀₎ של תרכובות הבדיקה נגד זיהום HCV באמצעות אלגוריתמים מהתוכנה GraphPad פריזמה על פי הפרוטוקול של היצרן.

3. ויראלי האיון Assay

הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שוניםמחדש מופיע באיור 1 א. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU.

1. זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 ⁴ תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO ₂ O / N להשיג שכבה.
2. דגירה תרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) עם חלקיקי HCV על ​​37 מעלות צלזיוס (איור 1 א, 'לטווח ארוך " ) ביחס של 1: 1. לדוגמא, לבידוד נגיף 100 μl המכיל 1 x 10 ⁴ FFU, להוסיף לדילול עובד 100 מיקרומטר CHLA 100 μl; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר.
3. לדלל את תערובת הסמים וירוס ריכוז ל" תת-טיפולי "(יעיל) של תרכובות הבדיקה. לדוגמא, הריכוז יעיל של CHLA וPUG נגד HCV הוא במיקרומטר 1 ^31; לכןזה דורש דילול של פי 50 מתערובת הסמים וירוס שיכול להיות מושלמת עם 9.8 מיליליטר של המדיום בסיסי (בינוני culturing תא עם 2% FBS).
   הערה: הדילול לריכוז תת-טיפוליים מונע אינטראקציה משמעותית בין תרכובות הבדיקה ופני השטח של התא המארח, ומאפשר בדיקה של השפעת טיפול על virions התא ללא. שים לב שדילול זה תלוי בתגובת המינון אנטי של תרכובות המבחן נגד זיהום ויראלי מסוים, והוא נקבע לפני ביצוע assay המסוים הזה ^31.
4. לשם השוואה, לערבב את הווירוס עם תרכובות בדיקה ומייד לדלל (אין תקופת דגירה) לריכוז תת-טיפולי לפני הזיהום (איור 1 א, 'לטווח קצר ").
5. להוסיף את התערובת של HCV-התרופה מדוללת 100 μl על הא-7.5 monolayer התא (כמות הנגיף היא עכשיו ב1 x 10 ² FFU; משרד הפנים סופיים = 0.01) ודגירה של 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר נגיפיספיחה.
6. בעקבות הזיהום, להסיר את inocula המדולל ולשטוף בעדינות את הבארות עם 200 μl של PBS פעמיים.
   הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים.
7. החל ממדיום בסיס 100 μl היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
8. נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב'2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי '.

4. Assay הקובץ המצורף ויראלי

הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שונים המופיעות באיור 2 א, 'קובץ מצורף'. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU.

1. זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 ⁴ תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO ₂ O / N להשיג שכבה.
2. טרום צמרמורת monolayers התא בצלחות ב 4 ° C FOR 1 שעה.
3. שיתוף לטפל בתאים עם הבידוד HCV (משרד הפנים = 0.01) ותרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, לבידוד נגיף 90 μl המכיל 1 x 10 ² FFU, להוסיף 10 μl של דילול עובד 500 מיקרומטר CHLA; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר וזיהום על ידי HCV במשרד הפנים = 0.01 על monolayer התא.
   הערה: חשוב לבצע את הניסוי על 4 מעלות צלזיוס שכן הוא מאפשר לוירוס מחייב אך מונע כניסה אשר מתרחשת באופן יעיל ביותר על 37 מעלות צלזיוס. בצע את התוספת של תרכובות וירוס ובדיקה על קרח והדגירה שהתפתחה במקרר 4 ° C על מנת להבטיח שהטמפרטורה נשמרת על 4 מעלות צלזיוס.
4. הסר את supernatant ולשטוף בעדינות את monolayer התא עם 200 μl של PBS קר כקרח פעמיים.
   הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים <./ Li>
5. החל ממדיום בסיס 100 μl היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
6. נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב'2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי '.

5. כניסה / Assay Fusion ויראלי

הערה: דוגמא לתקופות דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שונים המפורטות ב'הכניסה / היתוך 'איור 2 א. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU.

1. זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 ⁴ תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO ₂ O / N להשיג שכבה.
2. טרום צמרמורת monolayers התא בצלחות על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
3. להדביק את התאים עם HCV (משרד הפנים = 0.01) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, השתמש הבידוד נגיף 100 μl המכיל 1 x 10 ² FFU.
   הערה: בצע addition של הבידוד הנגיפי על קרח והדגירה שהתפתחה במקרר 4 ° C כדי לשמור על הטמפרטורה 4 ° C, המאפשר כניסה מחייבת אך לא ויראלי.
4. הסר את supernatant ולשטוף בעדינות monolayers התא עם 200 μl של PBS קר כקרח פעמיים.
   הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים.
5. פנק את הבארות עם תרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, להוסיף 10 μl של דילול עובד 500 מיקרומטר CHLA 90 μl של תקשורת, לערבב, וטיפול בבארות; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר.
   הערה: המעבר מ4 מעלות צלזיוס עד 37 מעלות צלזיוס עכשיו מקלה אירוע כניסה / היתוך הנגיפי ולכן מאפשרת הערכה של ההשפעה "תרכובות בדיקה בשלב מסוים זה.
6. לשאוב supernatant המכיל סמים ולהסיר הלא הפניםוירוסים תאיים או על ידי שטיפה עם 200 μl של חיץ ציטרט (נתרן ציטרט 50 מ"מ, 4 מ"מ אשלגן כלורי, pH 3.0) או PBS. החל ממדיום הבסיס 100 μl לפני דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
7. נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב'2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי '.

באיור 1, 'assay איון ויראלי' בוצע לבחון האם שתי CHLA הספציפי טבעי התרכובות וPUG יכולים להשבית הווירוסים עטפו השונים במדינה ללא תא ולמנוע זיהום שלאחר מכן. תגובת המינון הרעילה ואנטי של תרכובות אלה נקבעה קודם לביצוע מחקר מכניסטית 31. היו מראש שטופלו הווירוסים עם תרכובות בדיקה ולאחר מכן תערובות הסמים וירוס היו בדילול לריכוזים תת-טיפוליים לפני החיסון על monolayer התא המתאים לכל מערכת וירוס. כפי שניתן לראות באיור 1, שני CHLA וPUG הופיעו לאינטראקציה עם virions ללא הסלולרי, וכתוצאה מכך השפעות בלתי הפיכות שהגנה על monolayer התא מהזיהום שלאחר מכן. שתי תרכובות המבחן השיגו עיכוב 100% ליד נגד HCMV, HCV, וDENV-2, ואילו 60 - בלוק 80% נצפה נגד MV וRSV. סג תוצאות אלוest שיש לי CHLA וPUG השפעה ישירה על חלקיקי הנגיף הללו בחינם על ידי inactivating ונטרול infectivity.

באיור 2, את הקובץ המצורף וכניסה / מבחני היתוך בוצעו כדי לחקור את ההשפעה של CHLA וPUG נגד אירועים אלה מוקדם נגיפיים הקשורות לכניסה מHCMV, HCV, DENV-2, MV, וRSV. CHLA וPUG שני מנעו מחייב של הווירוסים נחקרו על התא מארח בהתאמה, כפי שמוצגים על ידי עיכוב בזיהום נגיפי וכתוצאה מכך (איור 2, 'קובץ מצורף': פסים אפורים בהירים). ההשפעה המעכבת על קובץ מצורף וירוס על ידי שני התרכובות דומה נגד HCMV (איור 2), HCV (איור 2 ג), DENV-2 (איור 2 ד), וRSV (איור 2F), הנע 90-100%. מצד השני, PUG הופיע להיות יעיל יותר מאשר CHLA נגד MV המחייב (איור 2E), עם שיעור העיכוב מTWתרכובות o משתנות בין 50 - 80%. הפרין טיפול שליטה, אשר ידוע לחסום כניסה של וירוסים רבים, גם קובץ מצורף עכבות של HCMV, DENV-2, RSV, מודעת MV, אבל היה פחות יעיל נגד HCV. "Assay כניסה / היתוך ויראלי 'שלאחר מכן בדק האם CHLA וPUG שמרו את פעילותם במהלך שלב כניסת וירוס / היתוך (איור 2,' כניסה / היתוך ': פסים אפורים כהים). שוב, שתי CHLA וPUG נצפו לפגוע ביעילות צעד כניסה / היתוך הנגיפי של הווירוסים שנבדקו (איור 2 ב - F), מניב 50 - 90% השפעה מגנה על monolayer התא המתאים. הפרין גם כניסה / היתוך בעצמת עכבות בDENV-2 וזיהומי RSV, אך היה פחות יעיל נגד HCMV, HCV, וMV (<עיכוב של 40% בממוצע).

טבלה 1:. סוג התא מארח לזיהום ויראלי סוג התא המשמש לכל מערכת זיהום ויראלי שתוארה בתוצאות הנציג מצויינים. ניתן למצוא פרטים נוספים על התאים בהתייחסות 31.

איון איור 1. של זיהומים נגיפיים על ידי CHLA תרכובות בדיקה וPUG טופלו וירוסים שונים עם תרכובות הבדיקה לתקופה ארוכה. (טופחה במשך 1.5-3 שעות לפני טיטרציה; ברים אפורים בהירים) או תקופה קצרה (בדילול מייד; אפור כהה ברים) על 37 מעלות צלזיוס לפני דילול לConcentra תת-טיפוליtion וניתוח שלאחר מכן של זיהום בתאי המארח המתאים. (א) שרטוטים של הניסוי (מוצג משמאל) עם ריכוז הווירוס הסופי (PFU / טוב או משרד הפנים), לטווח ארוך תקופת דגירה סמים וירוס (i), וזמן דגירה לאחר מכן (ii) מצויינים עבור כל וירוס בטבלה בצד הימין. הניתוח לHCV HCMV (ב), (ג), (ד) DENV-2, (E) MV, וRSV (F) מצוין בכל לוח נוסף. תוצאות הם זממו נגד טיפול DMSO השלילי שליטה לזיהום בנגיף והנתונים המוצגים הם אמצעי ± שגיאות תקן של הממוצע (SEM) משלושה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה מהתייחסות 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. הערכה של פעילות אנטי של CHLA תרכובות בדיקה וPUG נגד מצורף וירוס וכניסה / היתוך. (א) ההליך ניסיוני, ריכוז וירוס (PFU / טוב או משרד הפנים), והזמן של חיבור וטיפול בתרכובות הבדיקה (I, II, III) מוצגים לכל וירוס בשרטוטים והשולחנות הקשורים. בניתוח קובץ מצורף וירוס (פסים אפורים בהירים), monolayers של סוגי תאים שונים היו מראש מקורר-על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן טופל בשיתוף עם וירוסי בהתאמה ותרכובות מבחן על 4 מעלות צלזיוס (1.5-3 שעות; i) לפני הכביסה את מחסן ותרכובות מבחן לדגירה לאחר מכן (37 ° C; ii) ובדיקה של זיהום בנגיף. בכניסת וירוס / ניתוח איחוי (פסים אפורים כהים), monolayers תא זרע היו טרום צונן על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולאחר מכן קרא תיגר עם וירוסי בהתאמה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1.5-3 שעות (i). תאים היו אזשטף וטופל בתרכובות המבחן לתקופת דגירה נוספת (ii) שבמהלכה הטמפרטורה הועברה 37 ° C כדי להקל על אירוע כניסה / היתוך ויראלי. בסוף הדגירה, וירוסים תאיים הוסרו על ידי שני חיץ ציטרט (pH 3.0) או שוטף PBS והתאים הודגרו נוספים (iii) לניתוח של זיהום בנגיף. תוצאות עבור HCV HCMV (ב), (ג), (ד) DENV-2, (E) MV, וRSV (F) מצוינות בכל לוח נוסף. הנתונים הם זממו נגד טיפול ביקורת השלילי DMSO של זיהום בנגיף ומוצגים כאמצעי ± SEM משלושה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה מהתייחסות 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.