מאמר שיטה

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

DOI:

10.3791/53154

⸱

22 בדצמבר 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, 2Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 3OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון מוצגות בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטרית על ידי שילוב של השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) עם מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-אקטיבי (PALM). מתואר כאן השימוש ב-BiFC-PALM להדמיית אינטראקציות Ras-Raf בתאי U2OS להמחשת אשכולות ודיפוזיה בקנה מידה ננומטרי של קומפלקסים בודדים של Ras-Raf.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן אירועים מולקולריים מרכזיים בביולוגיה. עם זאת, זה נותר אתגר לדמיין PPIs עם רזולוציה ורגישות מספיקות בתאים מכיוון שהרזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי מוגבלת בעקיפה ל~250 ננומטר. על ידי שילוב של השלמת פלואורסצנציה דו-מולקולרית (BiFC) עם מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-אקטיבי (PALM), ניתן לדמיין PPIs בתאים עם רגישות למולקולה בודדת ורזולוציה מרחבית ננומטרית. BiFC היא טכניקה נפוצה להדמיית PPIs עם ניגודיות פלואורסצנטית, הכוללת פיצול של חלבון פלואורסצנטי לשני מקטעים שאינם פלואורסצנטיים. PALM היא טכניקת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה עדכנית להדמיית דגימות ביולוגיות בקנה מידה ננומטרי ומולקולה בודדת, המשתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות הניתנות לפוטו-טרנספורמציה כגון חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים לפוטו-אקטיביים (PA-FPs). BiFC-PALM הודגם על ידי פיצול PAmCherry1, PA-FP התואם ל-PALM, בשל אופיו המונומרי, בהירות טובה של מולקולה בודדת, יחס ניגודיות גבוה ושימושיות למדידות סטוכיומטריה. כאשר מפוצלים בין חומצות אמינו 159 ו-160, ניתן להפוך את PAmCherry1 לבדיקה BiFC המתארגנת מחדש ביעילות ב-37 מעלות צלזיוס עם ספציפיות גבוהה ל-PPIs ובנייה מחדש נמוכה לא ספציפית. אינטראקציית Ras-Raf משמשת כדוגמה כדי להראות כיצד BiFC-PALM עוזר לחקור אינטראקציות בקנה מידה ננומטרי וברזולוציה של מולקולה בודדת. ניתן לעקוב אחר הדיפוזיה שלהם גם בתאים חיים באמצעות מעקב אחר מולקולה בודדת (smt-) PALM. בפרוטוקול זה נדונים גורמים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון חלבוני ההיתוך עבור BiFC-PALM, מוסברים שלבי הכנת דגימה, רכישת תמונה וניתוח נתונים, ומוצגות כמה תוצאות לדוגמה. מספק רזולוציה מרחבית גבוהה, ספציפיות ורגישות, BiFC-PALM הוא כלי שימושי לחקר PPIs בדגימות ביולוגיות שלמות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן יסוד לביולוגיה 1 ומוסדרות בחוזקה באמצעות מנגנוני חלל ובזמן על פני קשקשים רבים זמן ואורך. מחקרים על תא איתות על קרום התא, למשל, חשפו תאים דינמיים, ננו מרחבי המאפשרים PPIs ספציפי ותהליכים תאיים 2. לפיכך, היכולת לחקור PPIs במערכות ביולוגיות עם רזולוציות מספיק מרחב ובזמן, סגוליות גבוה, ורגישות גבוהה היא מפתח להשגת הבנת מכניסטית של ביולוגיה.

שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) היא אחד הכלים הקיימים כמה חזותיים PPIs בתא עם רזולוציה subcellular ולחיות תאי תאימות 3 - 5. הטכניקה היא פשוטה יחסית וכרוך פיצול של חלבון הקרינה לשני שברים שאינם ניאון; כאשר גנטי מתויג לשני חלבוני אינטראקציה והביא לקרבה, שברים יכולים לשקם כדי ליצור חלבון פלואורסצנטי מלא, מניב אות ניאון. כאשר מתוכננים כראוי, בדיקות BiFC לא צריכים באופן ספונטני מחדש בהעדר של PPI. ככזה, אות הקרינה בassay BiFC תקום רק בנוכחות של PPI, המאפשרת הדמיה ישירה של PPI עם סגוליות גבוהות. יתרונות נוספים של שימוש בקרינה כקריאת הנתונים הם רגישות גבוהה, רזולוציה subcellular, ותאימות עם תפוקה גבוהה ומבחני מיון תוכן גבוהים, בין יתר. ליתרונות אלה, מספר בדיקות BiFC מבוססות על חלבוני ניאון ההורה שונים פותחו. כמו בכל שיטות לזיהוי אחרות המבוססות על מיקרוסקופ אור הרגילה, לעומת זאת, ברזולוציה מרחבית של BiFC מוגבלת ל~ 250 ננומטר על ידי העקיפה של אור. זה עושה את זה אתגר ללמוד הרגולציה של PPI בקנה המידה ננומטרי, אשר, כפי שרמז קודם לכן ושהודגם על ידי רפסודות שומנים 6ND nanoclusters ראס 7, הוא בקנה מידה אורך קריטי להבנה רבות תהליכים תאיים כגון איתות.

BiFC כבר בשילוב עם מיקרוסקופ photoactivated הלוקליזציה (PALM) 8,9 להתגבר מגבלה זו ברזולוציה מרחבית הדמיה PPIs 10. PALM הוא טכניקת מיקרוסקופיה superresolution האחרונה שעוקפת את מגבלת העקיפה בהדמיה הקרינה באמצעות הפעלה אקראית ולוקליזציה subdiffractive של מולקולות ניאון בודדות. בכל מחזור הפעלה, מולקולת ניאון פולטת כמה מאה לכמה אלף פוטונים ויוצרת תמונת מולקולה בודדת בגלאי. בעוד התמונה היא עקיפה מוגבל (~ 250 ננומטר ברוחב), centroid ניתן לקבוע בדייקנות גבוהה הרבה יותר, בדרך כלל בסדר הגודל של 10-50 ננומטר בהתאם למספר הפוטונים זוהו. על ידי הפעלה ואיתור כל מולקולת ניאון במדגם, ניתן לשחזר תמונה ברזולוציה גבוהה. Performeד על תאי חיים, רכישת רישיונות נוספים PALM יחיד מולקולת מעקב (smt-) אלפי מסלולי דיפוזיה החלבון מתא בודד 11. חשוב לציין, PALM משתמש בדיקות ניאון מיוחדות כגון חלבוני ניאון photoactivatable (PA-FPS) כדי להשיג הפעלה סטוכסטיים. מאחר ששני חלבוני ניאון השימוש PALM BiFC ו, הם אוחדו על ידי פיצול PAmCherry1, PA-FP נפוץ עבור PALM, לשני שברים בין חומצות אמינו 159 ו -160.

מערכת BiFC מבוססת על PAmCherry1 המפוצל מציגה אות רקע נמוכה מכינון מחדש ספונטני של שני ברים. כאשר גנטי מתויג לזוג חלבוני אינטראקציה, שני שברים (RN = שאריות 1-159; RC = Met + שאריות 160-236) מחדש ביעילות כדי ליצור חלבוני PAmCherry1 מלאים אפילו על 37 מעלות צלזיוס וללא דוגרים בטמפרטורות נמוכות יותר, ש זה לא המקרה לזוגות BiFC אחרים 12 כמו ההורה 13 mCherry. Furthermoמחדש, חלבון PAmCherry1 מחדש נשמרים מאפייני photophysical של PAmCherry1 ההורה, כגון יחס ניגודיות גבוה, תשואת פוטון בינונית, וphotoactivation המהיר, ביניהם קריטיים ללוקליזציה מדויקת מולקולה בודדת והדמיה PALM ברזולוציה גבוהה, אחרים.

בפרוטוקול זה, השימוש בBiFC-PALM הדמיה אינטראקציות ראס-רף בתאי U2OS באמצעות PAmCherry1 (איור 1 א) פיצול מתואר. הצעד הראשון הוא לעצב מבנים לביטוי חלבוני היתוך בין שברי PAmCherry1 (כלומר, RN וRC) והחלבונים של עניין. בתאוריה, לכל זוג של חלבוני מועמד (A ו- B), יש שמונה זוגות של חלבוני היתוך להיבדק: RN-/ RC-B; RN-A / B-RC; RC-/ RN-B; RC-A / B-RN; -RN / RC-B; -RN / B-RC; RC-/ RN-B; ו- RC / B-RN. תהליך זה לעתים קרובות יכול להיות פשוט יותר על ידי לקיחה בחשבון את המאפיינים המבניים או ביוכימיים של חלבוני המועמד. במקרה של ראס, החלבון הואלאחר translationally שונה בתיבת CAAX C-מסוף (C = Cys; = אליפטי; X = כל), לאחר שמוטיב AAX הוא ביקע את. לפיכך, RN או RC ניתן התמזגו רק לN-הסופית של ראס; זה מפחית את מספר זוגות חלבון היתוך לארבעה (איור 1). לרף, ראס מחייב תחום (RBD; שאריות 51-131) משמשת ויכולות להיות מתויגת בשני קצותיו. ארבע תצורות היתוך אלה שנוצרו: RN-KRAS / RC-רף RBD; RN-KRAS / רף RBD-RC; RC-KRAS / RN-רף RBD; וRC-KRAS / רף RBD-RN.

בנוסף, מקשר בין שברים והחלבונים של ריבית צריך להילקח בחשבון. מקשר גמיש של כעשר חומצות אמינו משמש לעתים קרובות כפי שהוא מספק חופש מספיק להשלמה להתרחש. מקשר אחד כזה הוא X2 (GGGGS), אם כי יש רבים אחרים שיושמו בהצלחה, כוללים רצפים אקראיים שנוצרו מאתר מרובה שיבוט (MCS) 14. אורכו של linkers ייתכן שיצטרך להיות מותאם תלויG בגודל של החלבונים של עניין והאוריינטציות שלהם באינטראקציה.

שברי PAmCherry1 כלולים בעמוד שדרת שיבוט קטן עם איגוף MCSs (ראה חומרי רשימה). הגנים של עניין יכולים להיות מוכנסים דרך אתרי הגבלה או עם שיטת קשירה-עצמאית. לאחר אימות שיבוט ורצף, קלטת הביטוי מועברת לוקטור ביטוי באמצעות תגובת recombinase, תהליך שיבוט עם איכות גבוהה ויעילות גבוהה.

בשלב הבא, בונה הביטוי וכתוצאה מכך הם transfected לתוך קו תא המטרה או, אם קו תא יציב הוא רצוי, ארוזה לlentivirus להדבקת קו תא המטרה. transfection החולף מאפשר אימות מהירה של תצורות BiFC, אבל בעיות פוטנציאליות חייבים לציין. Transfection שימוש בכימיקלים לעתים קרובות מדגיש את התאים, וכתוצאה מכך גבוה autofluorescence; בעוד שהשימוש בסך הקרינה השתקפות פנימית microsco (TIRF)py יכול למתן אות רקע זה על ידי הגבלת נפח התאורה, אידיאלי TIRF כאשר PPIs יתקיים בקרום התא. בנוסף, transfections החולף לעתים קרובות להוביל לרמות גבוהות של ביטוי חלבון, עלה בהרבה על אלה של חלבונים אנדוגניים, אשר עלול לגרום לחפצים באיתור PPIs. לפיכך, מומלץ כי תוקמנה שורות תאי יציבות לאחר תצורת BiFC מתאימה נקבעה באמצעות בדיקה ראשונית. יש גם שורות תאי יציבות הפוטנציאל לביטוי מתכונן באמצעות האינדוקציה דוקסיציקלין 15.

לאחר הדבקה, תאים נבחרים עם אנטיביוטיקה, בדרך כלל puromycin ונאומיצין, אחד לכל מבנה. השלבים הבאים להכנת מדגם, רכישת תמונה, וניתוח הנתונים שיפורט בהרחבה בפרוטוקולים.

עם גישה זו, ההיווצרות של אשכולות ננו בתמונות BiFC-כף ראס-רף RBD הם נצפו באופן שיגרתי (איור 2 א </ Strong>). באופן עקבי, מסלולי SMT-כף ראס-רף RBD להראות הפצה הטרוגנית במדינות דיפוזיה (איור 2-D). תוצאות אלו מצביעות על כך שמתחמי ראס-רף קיימים במדינות רבות בקרום התא, ככל הנראה כמונומרים ואשכולות, עם השלכות ביולוגיות פוטנציאליות. עבודה זו ממחישה את העצמה של BiFC-PALM בהדמיה סלקטיבית של PPI בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטר ורגישות מולקולה בודדת, שתהיה קשה להשיג עם BiFC הקונבנציונלי, שיתוף לוקליזציה הקרינה, או העברת תהודת הקרינה אנרגיה (סריג).

בעת תכנון ניסויי BiFC ולפרש את התוצאות, חשוב לזכור כי התהליך הוא בלתי הפיך BiFC ברוב המקרים, כולל PAmCherry1 פיצול. ברגע ששני שברים לשלב וליצור חלבון PAmCherry1 מלא, ההצמדה בין שני הברים, ובכך הופך PPI קבוע. זה מגביל את השימוש בBiFC וBiFC-PALM לניטור הדינמיקה של PPIs (כלומר, קינטיקה מחייבת ולא את דינמיקת דיפוזיה של החלבון המורכב ברגע שנוצר) ולעתים אף עלול להוביל לmislocalization של מתחמי PPI.

גורם נוסף שיש לשקול בעת תכנון ניסויי BiFC-PALM הוא העיכוב בהבשלת כרומופור שטבוע בחלבוני ניאון. ברגע ששני חלבוני אינטראקציה ושברי FP באים ביחד, הם בדרך כלל לקפל על סדר שניות (בחץ המשרה של 60 שניות לEYFP 3). עם זאת, התבגרות כרומופור הבאה ואות ניאון לפתח על סדר דקות. בעוד הקרינה עלולה להתגלות בתוך 10 דקות לאחר הכינון מחדש של מפוצל ונוס, גרסת YFP מהירה מתקפלת, בחץ המשרה להבשלה באופן כללי הוא לעתים קרובות סביב 60 דקות 16. מפוצל PAmCherry1 נצפה יש שיעור דומה. לפיכך, BiFC וBiFC-PALM הם בחירות עניות כיום לניטור קינטיקה PPI בזמן אמת; שלי אחרthods, כגון סריג וחלבון פלואורסצנטי התלוי dimerization שפותח לאחרונה 17, עשוי להיות מתאים יותר למטרה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שיבוט

  1. לקבוע את התצורות לשבט ולבחור מקשר. חלבוני תג עם שברים על N- או C-הסופית כפי שיתוארו להלן, כדי שלא לשבש את הלוקליזציה הנכונה שלהם. השתמש במקשר גמיש כגון x2 (GGGGS).
  2. גנטי לתייג את החלבונים של עניין לברי PAmCherry1. כאפשרות אחת, להשתמש בפלסמידים השיבוט מופיעים ברשימת חומרים המכילה שברי RN (שאריות PAmCherry1 1-159) וRC (Met תוספת שאריות PAmCherry1 160-236) עם איגוף רצפי MCS.
    1. Linearize פלסמידים המכילים שברי RN וRC עם PCR ההפוך (או הגבלה לעכל) בנקודת הכניסה. צבעי יסוד להפוך PCR מפורטים בטבלה 1. להלן פרוטוקול PCR דוגמא בשימוש במעבדה של המחבר (ראה חומרי רשימה לחומרים מדויקים שימוש בפרוטוקול זה).
      1. מערבבים את תגובת PCR יחד, הביאה עד נפח סופי של 50 μl עם מים: לקיר דקצינור אד PCR, להוסיף את המים, 25 μl של תערובת אמן 2x, 0.5 μl כל אחד מצבעי היסוד קדימה לאחור (20 מיקרומטר המניה מדוללת, 0.2 מיקרומטר ריכוז סופי), וng 1 של תבנית. השתמשו בתנאי הרכיבה על אופניים הבאים: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 30 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 7 שניות ו -68 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, והארכה סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. PCR גנים של עניין לכניסה לפלסמידים ינארית מכילים שברי RN וRC. לבצע PCR כמו בשלב 1.2.1 עם זמן הארכה 68 ° C. השתמש בצבעי יסוד עם הסככות המכילות רצף מקשר גמיש, כגון x2 GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT ל( GGGGS), והומולוגית זוג 15 בסיס לקצוות של RN לינארית ופלסמידים RC לרקומבינציה.
      הערה: הסככות פריימר לחלבונים של עניין מוצגות בטבלה 2 אם באמצעות פריימרים בטבלה 1 לlinearize עמוד השדרה פלסמיד.
    3. לעכל PCRתגובה עם Dpn1 לחסל את תבנית ה- PCR. הוסף 0.5 μl של Dpn1 (20 U / μl) ישירות לμl 50 של תגובת PCR. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה ולהשבית חום 1 על 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אם תבנית רקע נמשכת בשלבים מאוחר יותר, להגדיל את כמות האנזים או להאריך את זמן העיכול.
    4. לטהר את מוצרי ה- PCR באמצעות טור ספין כפי שתואר על ידי היצרן.
    5. בצע תגובת קשירה העצמאית לשלב פלסמיד לינארית מכיל RN או בר RC עם הגן של עניין. למדוד את הריכוז של מוצרי ה- PCR המטוהרים: לשלב 50 ng של פלסמיד לינארית ו -50 ng של הגן של עניין עם 1 μl של premix האנזים ולהביא את הנפח הכולל עד 5 μl עם מים ללא יונים. לדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, מניח על קרח, ולהוסיף 20 μl של TE חיץ.
    6. להפוך פלסמידים רקומביננטי לחיידקים המוסמכים 18.
    7. בחר 2-4 + (כרצויות) מושבות לO / תרבות N. הוסף 5 מיליליטרשל מרק LB ו -5 μl של kanamycin (50 מ"ג / מיליליטר מניות) לתוך צינור מסביב לתחתית 14 מיליליטר פוליפרופילן, ולהוסיף את המושבה חיידקים נבחרה עם לולאת inoculating מעוקרת. לדגור על 37 מעלות CO / N תוך רעד ב225 סל"ד.
    8. להקפיא 1 מיליליטר של O / תרבות N למניית גליצרול 19 וminiprep היתרה כפי שתואר על ידי היצרן.
    9. בצע רצף כדי לקבוע שיבוט טוב. אם שימוש בפלסמידים השיבוט ברשימת חומרים, להשתמש M13 קדימה הפוך פריימרים (בתגובות נפרדות) כנדרש כדי להשיג הרצף של מבנה ההיתוך המלא. השווה עם הרצף הצפוי באמצעות כלי יישור כגון פיצוץ מהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (צמח השדה) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
    10. העבר את בונה-מאומת רצף לפלסמיד ביטוי באמצעות תגובת recombinase.
      1. להוסיף 75 ng של פלסמיד & # היעד8212; כגון pcDNA לtransfections החולף או pLenti לאריזת lentiviral 20 - 50 ng ושל פלסמיד רקומביננטי השיבוט לμl 1 של premix האנזים ולהעלות את הנפח הכולל עד 5 μl עם מים ללא יונים. לדגור על 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן להוסיף 5 μl של TE חיץ.
        הערה: אריזת lentiviral ודור שורת תאים יציב, להשתמש פלסמיד יעד שונה לכל מבנה, לדוגמא, אחד עם התנגדות puromycin ונאומיצין האחר. זה מאפשר לבחירה כפולה של תאי transduced. כמו כן לשקול את האמרגן לכל, כמו אמרגן ציטומגלווירוס המכונן (CMV) לרמות ביטוי גבוהות, או CMV עם מפעיל TETO לביטוי מוסדר דוקסיציקלין מתכונן.
      2. להפוך 5 μl לחיידקים המוסמכים וminiprep פלסמידים כבצעדים 1.2.6 ל1.2.8, אך שימוש באנטיביוטיקה המתאימה (בדרך כלל אמפיצילין).
  3. לקבוע האופטימליתצורת BiFC.
    1. פלסמידים שיתוף transfect ביטוי לתאי U2OS (או תא של בחירה).
      1. להוסיף 350 μl של DMEM האדום-החופשי וללא אנטיביוטיקה פנול בתוספת 10% FBS לבאר כל תא תחתון שקופיות זכוכית 8 היטב # 1.5. צלחת על 7.5 x 10 4 תאים לכל כך טוב תאים כ 70% -90% ומחוברות למחרת.
      2. היום לאחר פלסמידים ביטוי הציפוי, שיתוף transfect עם תצורות שונות בכל גם באמצעות מגיב המועדף וכפי שתואר על ידי היצרן.
        1. לכל היטב, להוסיף 125 ננוגרם של כל פלסמיד ביטוי לμl 50 של תקשורת מופחתת סרום ללא בצינור 0.6 מיליליטר ופיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. הוסף 1 μl של מגיב transfection את המרכז של הצינור וישירות לתקשורת. להתסיס בעדינות לתערובת ולתת התגובה לשבת במשך 30 דקות.
        2. להפחית את התקשורת בכל טוב של חדר שקופיות בכמחצית. מוסיף את תערובת dropwise transfection לבארות ולנער זently לערבב. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל24-48 שעות. לשנות את תקשורת היום לאחר transfection.
    2. תאי תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי כמו בפרוטוקול 2 מתחילים עם צעד 2.1.4.
      הערה: המדגם עשוי להיות צילם על מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי אם רמות הביטוי גבוהות והמצלמה היא רגישה מספיק לפלט הפוטון הנמוך יחסית של PAmCherry1. יכולות להיות מופעלות על מולקולות PAmCherry1 מחדש עם סט אולטרה סגול מסנן (405 ננומטר) לפני הדמיה עם סט מסנן עירור ירוק (561 ננומטר).
  4. במקרים רלוונטיים, ליצור שליטה שלילית על ידי, למשל, מציג מוטציה נקודה לאחד החלבונים של עניין שמשבש את האינטראקציה. בצע מכוון mutagenesis אתר 21 על פלסמיד השיבוט של החלבון שעבר מוטציה ושל התצורה שנבחרה.
  5. צור שורת תאים יציבה על ידי אריזת המבנים לויראליחלקיקים ותאים להדביק U2OS (או שורת תאים של בחירה). שקול מערכת מושרה ביטוי (טטרציקלין) 15 כך ביטוי יכול להיגרם לפני ההדמיה אם הפיכות ממושכות של BiFC היא נושא, או אם ביטוי מתכונן הוא רצוי.
    זהירות: עבודה עם וירוסים מסווגות כרמת בטיחות ביולוגית 2. בעוד הדורות האחרונים של מערכות אריזת ויראלי שצמצמו מאוד את הסבירות לייצור וירוסים שכפול-מוסמך, כמה סיכונים עדיין קיימים. ניתן למצוא אזכור בhttp://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
    1. חזור על שלב 1.2.10 באמצעות וקטור יעד lenti- או retroviral 20. להגדיל את O / תרבות N לmidiprep 100 מ"ל ובטהרה גדולה יותר של פלסמידים.
    2. ביום 1: פלייט על 2 x 10 6 293T / 17 תאים לתוך צלחת 10 סנטימטרים לכל מבנה להיות ארוזים.
    3. ביום 2: הכן את תגובת transfection באמצעות traמגיב nsfection של בחירה וכפי שתואר על ידי היצרן.
      1. הכן premix אריזה פלסמידים עם ריכוזים סופיים של 250 ng / μl לפלסמידים אריזת 1 ו -2, ו- 100 ng / μl אריזת פלסמיד 3 במים סטריליים. הוסף 10 μl של premix פלסמיד האריזה ו -2.5 מיקרוגרם של פלסמיד היעד ל1 מיליליטר של תקשורת מופחתת סרום ללא בצינור מסביב לתחתית 5 מיליליטר פוליפרופילן ופיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. הוסף 20 μl של מגיב transfection את המרכז של הצינור וישירות לתקשורת.
        1. להתסיס בעדינות לתערובת ולדגור על RT למשך 30 דקות. הסר כמחצית התקשורת מהתאים ולהוסיף את תערובת transfection באופן dropwise. לנער בעדינות לתערובת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. דגירה 10 מיליליטר של תקשורת לכל צלחת בצינור עם הכובע התיר לטמפרטורה ו- CO 2 איזון.
      2. ביום 3: בעדינות לשנות את התקשורת עם התקשורת לפני מודגרות וreturn התאים לחממה. דגירה צינור אחר של תקשורת עם הכובע משוחרר.
        הערה: Syncytia, או היווצרות של תאים-גרעיני רב גדולים, יכולה להיות סימן לכך שהאריזה הולכת טובה. עם זאת, תאים נמצאים במצב שביר ויכולים בקלות להיות מנותק. בעת שינוי תקשורת, להטות את pipettor כך שהוא אופקי ולהוסיף dropwise התקשורת לקצה אחד של הצלחת.
      3. ביום 4: קציר הווירוס על ידי הסרת התקשורת עם מזרק וסינון דרך מסנן גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית לתוך צינור 50 מיליליטר נקי. בעדינות להחליף את התקשורת עם התקשורת לפני מודגרות.
      4. ביום 5: קציר שוב כפי שנעשה בעבר בשלב 1.5.3.3 ולשלב תסנין נפוץ לתוך צינור 50 מיליליטר. הוסף 6 מיליליטר של רכז וירוס לכל צינור ומערבבים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות עד למשקעי הווירוס.
        הערה: בהתאם לבריאותם של התאים, ניתן לקצור וירוס בפעם שלישית.
      5. לרכז את הנגיף על ידי צנטריפוגה ב 1500 XGבמשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב250 μl של תקשורת. וירוס יכול לשמש מייד לזיהום או מאוחסן ב -50 aliquots μl ב -80 ° C עד שנה אחת.
      6. צלחת על 3 x 10 5 U2OS (או יעד) תאים לכל גם לתוך צלחת 6-היטב (2 מיליליטר של DMEM עם 10% FBS בכל טוב) לזיהום, ולכן תאים כ 50% ומחוברות בזמן של זיהום.
      7. למחרת, להסיר כמחצית תקשורת כל כך על 1 מיליליטר שרידים. Coinfect עם 50 μl של נגיף מרוכז עבור כל מבנה. הוסף 1 μl של polybrene (8 מ"ג / מיליליטר) לכל אחד. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. שינוי תקשורת למחרת ודגירה לעוד יום אחד לפני בחירת אנטיביוטיקה.
        הערה: כמות הנגיף להוסיף יכול להשתנות בהתאם לשיעור הרצוי של זיהום. ניתן טיטרציה וירוסים באמצעות qRT-PCR.
      8. להוסיף אנטיביוטיקה כדי לבחור עבור תאים נגועים. בארות נפרדות עם תאים נגוע שלא ראו viRus נדרש ככנרות כדי לבדוק את היעילות של הבחירה. דגירה של 2-7 ימים, או עד שהבחירה היא מוחלטת.
        הערה: ריכוזים אפקטיביים צריכים להיות טיטרציה בתחילה, אבל הם בדרך כלל 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר לpuromycin ו1.0 מ"ג / מיליליטר לנאומיצין.
      9. הרחב את התאים לתוך צלחת 10 סנטימטר גדול יותר ולהמשיך לפרוטוקול 2.

2. תאי הדמיה קבועה

  1. הכן מדגם הדמיה
    1. נקה # 1.5 קאמרי שקופיות זכוכית תחתונה 8-גם על ידי הוספת 250 μl של 1 M NaOH לשעה לפחות 1 ולשטוף ביסודיות עם PBS.
      הערה: שקופיות קאמריות אינה מטופלת בדרך כלל לגרום לאות רקע גבוהה. בנוסף, תאים עשויים להיות רגישים לNaOH וכישלון לנקות את משטח הזכוכית ביסודיות (רבים ככל 10x שוטף) עלול להפוך הידבקות תא קשה שייר. במידת צורך, דגירה השקופיות קאמריות ניקו עם PBS O / N לאחר כביסה. לשורות תאים רגישות, ציפוי בצפיפות גבוהה(לדוגמא, ב 50% -60% confluency הראשוני) עשויים לעזור.
    2. צלחת על 5.5 x 10 4 תאי הביטוי יציב U2OS לכל גם ב350 μl של DMEM האדום ללא פנול עם 10% FBS כך שתאים בריאים ולא על מחוברות כאשר הדמיה.
    3. לבצע טיפולים דרושים לניסוי, כגון הוספת טטרציקלין לגרום ביטוי חלבון.
    4. תקן את התאים באופן מיידי לפני ההדמיה.
      1. לפני הקיבעון, להכין paraformaldehyde הטרי פתרון (PFA) - 3.7% PFA ב1x PHEM עם glutaraldehyde 0.1% (GA). במשך 10 מיליליטר פתרון PFA, שוקל 0.37 גרם של PFA ולהעביר לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים ו -30 μl של 1 M NaOH ומערבולת. חום על 70 מעלות צלזיוס ומערבולת כל 1-2 דקות עד PFA נמס לגמרי.
      2. העברה מומסת PFA לצינור חרוטי 15 מיליליטר ולהוסיף 3.8 מיליליטר מים מזוקקים, 5 מיליליטר 2x חיץ PHEM, 20 μl של glutaraldehyde 25%, ומערבולת לערבב. המניה, חיץ PHEM 2x הוא 120 צינורות מ"מ, 50 מ"מ HEPES, 20 מ"מ EGTA, ו -16 מ"מ MgSO 4, עם חומציות מותאמת ל7.0 עם 10 M KOH. פתרון מקבע זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.
        זהירות: PFA וGA שניהם מסוכנים. הכן את הפתרון במנדף וללבוש ציוד מגן מתאים כאשר טיפול הן הכימיקלים. הימנע משאיפת או מגע עם עור ישיר.
      3. הסר את מדיום הגידול. לשטוף במהירות עם 500 μl של PBS ולהוסיף 250 μl של מקבע PFA בכל טוב. דגירה התאים במשך 20 דקות ב RT.
    5. הסר את מקבע PFA מהמדגם ולהוסיף 350 μl של PBS או חיץ הדמיה (100 מ"מ טריס עם 30 מ"מ NaCl ו -20 מ"מ MgCl 2, pH 8.5) בכל טוב.
    6. 100 חלקיקי זהב ננומטר מערבולת כדי לשבור את אגרגטים ולהוסיף 35 μl לכל גם (10x דילול סופי) למעקב אחר נדידת שלב במהלך הדמיה.
  2. לרכוש תמונות
    1. הפעל את המיקרוסקופ. כוח על 405 והלייזרים 561 ננומטר, אבל לשמור את התריסים(פנימי או חיצוני) נסגר בשלב זה. הפעל את המצלמה EMCCD ולאפשר לו להתקרר. ודא 561 המסננים ננומטר נמצאים במקום.
    2. פתח את תוכנת הרכישה ולקבוע את זמן חשיפה ל -100 אלפיות שניים ורווח EMCCD 300 (טווח 1 - 1,000).
    3. להוסיף שמן טבילה למטרה ולאבטח את המדגם לבמה מיקרוסקופ.
    4. עם או שדה בהיר או לייזר 561 ננומטר ב( ~ 1 קילוואט / 2 סנטימטר), להביא את המדגם אל מוקד.
    5. הדמיה ראס וחלבוני קרום אחרים, להשתמש במטרת TIRF Apochromat 60X עם 1.49 צמצם מספרי ולהביא מיקרוסקופ לתצורת TIRF. התאם את לייזר העירור כך שזה כאשר להכות את הצמצם האחורי של מטרת TIRF מרוכז מ; זה גורם לליזר כדי להסיט בהגיעם למדגם. שמור התאמת הלייזר עד לזווית הקריטית והליזר הוא להיות מוחזר. חפש תא לתמונה עם כמה חלקיקי זהב בתצוגה. הגדר אזור של ענייןשסוגר את התא (או אזור בתוך התא) וחלקיקי זהב.
      הערה: TIRF מקטין את עומק החדירה של לייזר העירור ומפחית את האות מתוך רקע מוקד. בנוסף, תיקון להיסחף עשוי להיות מדויקים יותר כאשר יותר חלקיקי זהב נמצאים בתצוגה.
    6. אם זמין, לעסוק מערכת פוקוס אוטומטי כדי לתקן את סחיפת מדגם בZ-הכיוון. אחרת, לשנות את הפוקוס באופן ידני בכל הרכישה אם התמונה יוצאת של התמקדות.
    7. בגין רכישה עם לייזר 405 ננומטר את וליזר 561 ננומטר ב( ~ 1 קילוואט / 2 סנטימטר) בהפעלה מספקת מקרה מתרחש כבר (בדרך כלל אם רמות הביטוי גבוהות). אחרת, להפעיל את לייזר ננומטר 405 בהגדרת כוח המפעל הנמוך ביותר (0.02 mW או 0.01 W / 2 סנטימטר) ולהגדיל בהדרגה (0.1 mW בכל פעם) צריך, עד שיש כמה עשרות מולקולות לכל מסגרת או כך שמולקולות בודדות מופרדים היטב.
    8. כרכישת נתונים ממשיכה, גראדually להגדיל 405 כוח לייזר ננומטר כדי לשמור על צפיפות הנקודה בערך קבוע.
      הערה: בכוח עירור 405 ננומטר נמוך יותר, יכול להיות כבר מופעל כמה PAmCherry1. כמולקולות אלה photobleach, האוכלוסייה שנותר מולקולות PAmCherry1 photoactivatable יורדת, דורש שטף פוטון גבוה יותר כדי לשמור על אותה הצפיפות של מולקולות פולטות הקרינה בכל מסגרת.
    9. המשך רכישת תמונה עד ההספק גבוה 405 ננומטר (2.5-10 W / 2 סנטימטר) אינו מפעיל יותר אירועי הפעלה.
      הערה: סך הכל זמן הרכישה תלוי ברמת הביטוי והיעילות של ההשלמה.
  3. לעבד את התמונות
    הערה: יש הרבה אפשרויות תוכנת קוד פתוח לעיבוד תמונה. דוגמאות לכך הן סופת רעמים (https://code.google.com/p/thunder-storm/) וQuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). תהליכי עיבוד נתונים האופייניים מומחשים כאן בקצרה באמצעות חבילת Matlab מותאמת אישית בשם wfiread לעיבוד נתונים PALM כדוגמא. עם זאת, שינויים בעתיד ייתכן שלא בדיוק אחרי מה שמתואר כאן. לעיבוד תמונה עם תוכנות אחרות, עיין בתיעוד למשתמש.
    1. הורד את תוכנת עיבוד תמונה (קובץ קוד נוסף) או את הגרסה האחרונה בhttp://www.ohsu.edu/nan. פתח Matlab ולטעון את תוכנת wfiread (שכבר לשים בנתיב ברירת המחדל).
    2. צפה רצף תמונת הגלם ולקבוע את האזור של עניין. בחר את האזור של הערימה להיות מעובד על ידי לחיצה על ימין ועל גרירת תיבה מסביב לאזור הרצוי. אם האזור של עניין לא הופחת במהלך רכישה (כ 256x256 פיקסלים), בחר אזור קטן יותר כדי להפחית את זמן המחשוב. כדי לבטל את בחירת אזור ומעבד את כל המסגרת, לחץ לחיצה ימנית בכל מקום בהתמונת דואר.
    3. הזן את מגוון מסגרות לעיבוד.
    4. בחר חלקיקי זהב (אחד כי הוא מבודד ואחיד בצורה) על ידי לחיצה השמאלית על התמונה וגרירת תיבה קטנה סביבו. תחת חלקיקים מעקב, לחץ על לחצן המסלול. גרף יופיע המציג את עמדתו של חלקיק הזהב נבחר על פני הערימה של תמונות, המתאר את היקף להיסחף.
    5. חזור על תהליך זה כדי לעקוב אחר חלקיקי זהב רבים ככל האפשר ולקבוע את אלה העוקבים אחר יחד (החלקיקים יהיו בצבע מקודד). באופן אידיאלי להיסחף הכולל הוא בסדר הגודל של פיקסל אחד לכל היותר.
    6. בנפרד לבחור את חלקיקי הזהב שאתרו ביחד אחד בכל פעם, ולחץ על כפתור הוספת מרקר תחת חלקיקים מעקב. צלב ירוק יופיע מסמן שנוסף כסמן וישמש לתיקון לסחיפה.
    7. התאם את טווח Sigma, טווח החלקה וסף כנדרש על ידי שינוי הערכים מעט. לחץ על החלקיקים מצאכפתור כדי לבדוק את ההגדרות. החלקיקים שיעובדו יהיו התאגרפו ואלה שאינם יישארו בחוץ. מולקולות PAmCherry1, החלקיקים שהם יחסית עגולים בהירים ו, ​​יש לבחור.
    8. התחל עיבוד התמונות על ידי לחיצה על כפתור קובץ coord לבצע ולשמור את הקובץ.
      הערה: התכנית תעבור כל מסגרת בטווח המסגרת המוגדרת, למצוא את כל כתמי הניאון, ולבצע התאמת גאוס כדי למצוא את קואורדינטות centroid. קובץ .cor יופק אחסון כל הקואורדינטות והפרמטרים מתאימים אחרים של תמונות מולקולה בודדות מעובד.
  4. לאחר תהליך התמונות ולהבהיר את תמונת PALM
    הערה: תוכנה אחר עשויה להבהיר את התמונה ישירות לאחר תיאום חילוץ.
    1. ב- Matlab, להשיק את החבילה "דקל" ולטעון את קובץ .cor עתה יצר.
    2. לפני טיוח תמונת PALM באמצעות הקואורדינטות, למיין את הקואורדינטות בודדות (כל אחד מ'localizatiבאירוע "). ערכי המיון אופטימליים עשויים להשתנות בהתאם להגדרת וfluorophore.
      1. לPAmCherry1, להשתמש בערכים הבאים: מסגרת שילוב - 8; מרחק (ננומטר) שילוב - 100; RMS מינימום - 4; אלוהים מינימום Fit - 0.25; ומקס. אקסצנטרי - 1.4. עיין בסעיף הדיון להסבר נוסף של פרמטרים אלה.
    3. לחץ על לחצן מיון כדי ליצור קבוצה חדשה של קואורדינטות מוכנות לעיבוד תמונות ברזולוציה גבוהה.
    4. הזן את הערכים לעיבוד נכון של התמונה הסופית כגון גודל גלם פיקסל (ננומטר), גודל הרצוי התכונה (ננומטר) בתמונה שניתנו, וגודל פיקסל לתמונה שניתנו.
      הערה: גודל פיקסל הגלם צריך להיקבע עבור כל התקנה. גודל התכונה שניתנו ניתן להגדיר באופן שרירותי, אלא מוגדר בדרך כלל בערך גבוה במעט מדיוק הלוקליזציה הממוצע. לPAmCherry1, דיוק הלוקליזציה הממוצע הוא סביב 18 ננומטר, כך גודל תכונה של 20 - 30 ננומטר הוא appropriaטה. ראוי לציין, דיוק הלוקליזציה חושבה על ידי לקיחת סטיית התקן של המגוירות של אותה המולקולה על פני מסגרות מרובות 22 ולא על ידי חלוקת גבול ההשתברות עם השורש הריבועי של מספר המזוהה של פוטונים. באשר לגודל פיקסל של התמונה שניתנו, 10 ננומטר היא נקודת התחלה טובה; הגדרת ערך זה נמוך מדי תגרום לקבצי תמונה גדולים שלא לצורך לנוף לא מוגדל.
    5. לחץ על הכפתור לדקלם כדי ליצור את תמונת PALM. השתמש בסמלי מגדלת +/- בסרגל הכלים של חלון הדמות ללהתקרב ולהתרחק.
    6. ניתוח אשכולות בצעו של התמונה המשוחזרת PALM או באמצעות בדיקת K של ריפלי או מנגנונים אחרים כגון DBSCAN בעזרת הסימולציה 23 (SAD): אופציונאלי. שים לב: בחבילת הכף המותאמת אישית, שניהם K של ריפלי וניתוח SAD כבר נבנו ב; לקואורדינטות שנוצרו מתוכנה אחרת, באותו הניתוח ניתן לבצע עם סקריפטים מותאמים אישית נוספים.

3. מולקולה בודדת מעקב בתאים חיים

  1. פנק את משטח תרבית הרקמה וצלחת התאים כפי שתואר בפרוטוקול 2. מאז הטמפרטורה והשלב או / CO 2 מבוקר עשויים לדרוש צלחת תרבות מסוימת, להבטיח בטוח שיש לו את coverglass העובי המתאים (0.17 מ"מ) להתקנת מיקרוסקופ.
    1. Transfect תאים אם עושה ביטוי חולף ולבצע כל טיפולים דרושים לניסוי, כגון טטרציקלין לגרום לביטוי, ודגירה במידת צורך. זהו גם אותו, כמתואר בפרוטוקול 2.
    2. מניחים את צלחת התרבות על חממה על הבמה. בואו הצלחת להתיישב על הבמה לכמה עד שהטמפרטורה וריכוז CO 2 דקות לייצב בכל פעם לאחר ההרכבה המנה התרבות או לעבור לאזור חדש של עניין. לייזרי בלוק בשלב זה. אם CO 2 שליטה אינה זמינה, לשנות לCO 2 תקשורת עצמאית ממש לפני ההדמיה, כגון LeibovL-15 של הריץ.
      הערה: הבינוני פנול-אדום-חופשי מומלץ לקרינת רקע מדכאת.
  2. לרכוש תמונות כמו בפרוטוקול 2. עם זאת, נקבע זמן חשיפה מתאים (בדרך כלל 25-50 msec עבור PAmCherry1).
    הערה: צפיפות המולקולה חייבת להיות נמוכה יותר מאשר לתאים קבועים כך שניתן להקליט מסלולים ללא חפיפה אחד עם השני. כמה עשרות המוגדר של מולקולות אופייניים לרכישת 256x256 פיקסל בגודל פיקסל של כ -160 ננומטר. צפיפות כוח הלייזר 561 ננומטר הייתה מוגדרת 0.8 קילוואט / 2 סנטימטר כדי לשמור על יחס אות לרעש טוב תוך הפחתת phototoxicity לתאים ולהגדיל את אורך המסלול הממוצע.
  3. לעבד את התמונות.
    1. לחלץ קואורדינטות של מולקולות בודדות עם חבילת wfiread כפי שתואר בפרוטוקול 2, או עם חבילה אחרת.
    2. לשחזר מסלולי חלקיקים בודדים באמצעות חלקיק יחיד שונים מעקב חבילות (SPT) המבוסס על אלגוריתמים שונים מצאובמקום אחר 24. הערה: לחלופין, צעד זה עשוי להיות מושלם באמצעות חבילת Matlab בנה את הבית (ואולי זמינה בגרסות עתידיות בhttp://www.ohsu.edu/nan.
    3. אופציונאלי: לאחר שחזור, השתמש חבילת SPT 24 לחשב קבועי עקירה ודיפוזיה מהמסלולים. בנוסף, לשימוש חד-חלקיקי הוריאציה ייס מעקב (vbSPT) 25 כדי לקבוע מדינות דיפוזיה של חלבוני היעד. ניתן למצוא חבילת vbSPT Matlab ותיעוד באתר הרשמי שלה Sourceforge: http://vbspt.sourceforge.net/.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמא BiFC-PALM המוצג היא המוטציה KRAS G12D אינטראקציה עם ראס מחייב תחום (RBD) של craf (איור 1 א). כפי שנאמר, RN או שברי RC לא מתויגים לC-הסופית של ראס כי זה היה לשבש את לוקליזציה הקרום ולכן הפעילות הביולוגית של ראס. זה הפחית את הצירופים האפשריים משמונה עד ארבעה (איור 1). כל אחד מארבעת שילובים אלה הוכנס לתאי U2OS באמצעות זיהום lentiviral. התאים היו קבועים כמפורט בפרוטוקול, ואותות BiFC הוערכו באמצעות התקנת PALM. תאים עם אותות BiFC חיוביים זוהו על י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC היה טכניקה נפוצות לאיתור וחזותי PPIs בתאים, ואילו PALM הוא הטכניקה האחרונה יחידה superresolution המולקולה מיקרוסקופית המאפשרת הדמיה בקנה מידה ננומטרי של דגימות ביולוגיות בשלמותה. השילוב של BiFC עם PALM השיג הדמיה סלקטיבית של PPI בתוך תא עם רזולוציה מרחבית ננומטר ורגישות מולקולה בודדת. BiFC-PALM מרחיב את השירות של שני הטכניקות, וכפי שהודגם בעבודה זו, מראה הבטחה גדולה בחושפים את הפרטים המולקולריים של PPI בהקשר הסלולרי האם שלהם. בפרט, הרזולוציה ננומטר מאפשרת חקירה מפורטת של הרגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר סטיבן צ'ו וג'ו גריי על הדיונים המועילים, להנרי מאר על עבודתו הראשונית בפרויקט BiFC-PALM, ולאלקסיס שומייקר על הסיוע הטכני שלה. עבודה זו נתמכת על ידי קרנות סטארט-אפ ל-X.N. מ-OHSU. המחקר במעבדת נאן נתמך גם על ידי NIH 5U54CA143836-05, קרן דיימון ראניון לחקר הסרטן, קרן הצדקה M. J. Murdock וחברת FEI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסגרת מיקרוסקופNikonTi-U
60X שמן טבילה TIRF אובייקט עם 1.49 NANikon CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD מצלמהAndoriXon Ultra 897
561 ננומטר לייזרOpto EngineMGL-FN-561
405 ננומטר לייזרקוהרנטיCUBE-405 50mW
561 ננומטר מראהדיכרואיתסמרוק  Di01-R405/488/561/635-25x36
561 ננומטר מסנןSemrockFF01-525/45-25
405/561 ננומטר מסנן חריץSemrockNF01-405/488/568-25
טמפרטורה ו-CO2 שלב מבוקרTokai HitINUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCSAddgene60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCSAddgene60546
pcDNA3.2-DESTLife Technologies12489-019
pLenti-DESTAddgenehttp://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High Fidelity DNA PolymeraseThermo ScientificF-531
In-Fusion HD שיבוטClontech639649
LR ClonaseLife Technologies11791
Vira Power Lentivirus PackagingLife TechnologiesK497500
X-tremeGENE Transfection ReagentRoche13873800
Lab-Tek II Chambered CoverglassThermo Scientific155409#1.5 כלי זכוכית תחתונים
תאי U2OSATCCHTB-96
293T/17 תאיםATCCCRL-11268
DMEM עם פנול אדוםLife Technologies11995
DMEM ללא פנול אדוםLife Technologies21063
סרום בקר עובריLife Technologies10082
L-15 של לייבוביט, ללא פנול אדוםLife Technologies21083-027
סרום מופחתבינוני Life Technologies31985
פוספט חוצץמלח Life Technologies14040
מזרקBD Biosciences309604
מסנן מזרקMilliporeSLHV033RB
רכז LentiviralClontech631231
רכז רטרו-ויראליClontech631455
תרבית 10 ס"מ צלחתBD Biosciences353003
צלחת תרבית 6 בארותBD Biosciences353046
PolybreneSigma107689
PuromycinLife TechnologiesA11138
G-418Calbiochem345812Neomycin
DoxycylineFisherBP2653
Tris baseפישרBP152
EDTASigmaEDS
נתרן הידרוקסידSigmaS5881
ParaformaldehydeSigma158127
GlutaraldehydeSigmaG6257
צינורותSigmaP6757
HEPESH4034
EGTASigma3777
מגנזיום גופרתיSigmaM2643
אשלגן הידרוקסידSigma221473
נתרן כלוריFisherBP358
מגנזיום כלורידFisherM33
חלקיקי זהב 100 ננומטרBBI SolutionsEM. GC100
מים בדרגה מולקולריתטכנולוגיות חיים10977
Dpn1ניו אינגלנד BiolabsR0176
ערכת טיהור PCRQiagen28104
ערכת MiniprepQiagen27104
ערכת MidiprepMacherey-Nagel740410
0.6 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהפישר05-408-120
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לפישר05-408-137
צינורות 15 מ"לפישר05-539-12
צינורות תחתונים עגולים מפוליפרופילן 5 מ"ל BDBiosciences352063
14 מ"ל צינורות פוליפרופילן עגולים תחתונים BDBiosciences352059
שפופרת 50 מ"לBD Biosciences352070
צינור PCRGeneMateC-3328-1
SOC בינוניטכנולוגיות חיים15544
LB מרקBD Biosciences244610
Kanamycin סולפטפישרBP906
תאים מוכשריםTechnologiesC4040
MatlabMathworks
Life

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
  3. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  4. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  5. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
  6. Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
  7. Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  10. Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589(2014).
  11. Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
  12. Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
  13. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  14. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  15. Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171(2013).
  16. Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
  17. Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
  18. Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D(2001).
  19. Morrison, S. L. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Coligan, J. E., et al. Appendix 3, Appendix 3M(2001).
  20. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529(2009).
  21. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
  22. Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
  23. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  24. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
  25. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  26. Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
  27. Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ras Raf

מאמרים קשורים