כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המסדירים גרורות הגידול, הוצעו מבחני שונים באמצעות העכבר כחיה מודל. . הנה, נדגים וזמינותו פשוט להעריך הגידול תא extravasation או micrometastasis. ב הזה assay, תאים סרטניים הוזרקו דרך הווריד של הזנב, ו לאחר תקופה קצרה, הריאות היו גזור מתעכל לספור את תאי הגידול שכותרתו שהצטברו. Assay זה מדלג על השלב הראשוני של הגידול העיקרי הפלישה לתוך כלי דם ואסטמה ומקילה על המחקר של אירועים באיבר מרוחק שבו מתרחשת גרורות הגידול. ניתן למטב את מספר התאים מוזרק לתוך כלי הדם להתבונן במספר מצומצם של גרורות. בעבר דווח כי סטרומה תאים באיבר מרוחק לתרום גרורות. לפיכך, וזמינותו הזה יכול להיות כלי שימושי כדי לחקור תרופות טיפוליות או התקנים למניעת גרורות הגידול.
מבוא
גרורות הגידול חשבונות עבור תמותה גבוהה במחלות הקשורים לסרטן. מנקודת מבט של חקירות ברמה המולקולרית, גרורות ניתן לחלק מספר השלבים: גידול חניכה הגידול העיקרי באתר, הגידול העיקרי ו הפלישה לתוך סביב רקמות, intravasation, זרימת הדם דרך כלי הדם , extravasation איברים רחוקים, וכן גידול מחדש את הצמיחה. כל שלב כרוך סטים שונים של מולקולות/אותות1.
מחקרים עד כה מעורב עם אירועים המתרחשים באיברים מרוחקים לפני לתאי הגידול במחזור הדם, אשר נקרא גם שלב גרורתי מראש2,3,4,5, 6....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים שבוצעו עם עכברים אושרו על-ידי האוניברסיטה לרפואה חיה מחקר הוועדה של טוקיו של הנשים.
1. הזנב הזרקה לווריד של לואיס ריאות (LLC) קרצינומה של תאים
- לשמור על LLC בתאים DMEM בתוספת 10% FCS, ב- 5% humidified חממה2 CO ב 37 º C. תאים צריך להכיל מערכת ביטוי חלבון פלואורסצנטי (למשל, ה-GFP).
- להסיר תאים מקערה תרבות באמצעות ריאגנט דיסוציאציה תא הלא-אנזימטי. פעלתי לפי הנהלים של היצרן
- איסוף תאים 15 מ"ל שפופרת, ולאחר צנטריפוגה ב 400 x g עבור 3 מינימלית Resuspend התאים 5 מ של PBS מאת pipetting, centrifuge את הצינור (400 x גרם, 3 דקות). לאחר מכן, הסר את תגובת שיקוע.
- חזור על שלב זה כביסה עוד פ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הריאות מציגים GFP-אינק הרבה תאים 2 h לאחר ההזרקה (איור 1 א'). יצוין, כי המקומות פלורסנט זוהה גם במסנן אדום לא להיות כלולים ספירת מספר. הרוב המכריע של תאים LLC נעלמים מן הריאות 24 שעות לאחר ההזרקה (איור 1C).
כדי לאשר את מספר ה-GFP-LLC בריאות, לאחת האונות יכול לשמש עבור ניתוח תזרים cytometric (איור 2).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טיפול קדם של עכברים עם נוגדנים, תרופות, תזונה עתירת שומן או ממוזגים-גידול בינוני לפני הזרקת תאי הגידול הוא אפשרי. השלב הקשה ביותר זה וזמינותו היא הזריקה וריד הזנב. הזרקת לא שלם תוצאות חד משמעיות נתונים. וריד הזנב ב- C57BL/6 קשה במיוחד לזהות, וכתוצאה מכך זריקות שנכשלו. הנחת העכבר על כרית החימום (37 מעלות צלזיוס) מסייע להתרחב את הווריד הזנב כך הזרקת הופכת קלה יותר.
Assay זו משתמשת תאים סרטניים מספר (1 x 104 - עונה 1 פרק 105) גדול, שזה הרבה יותר מורכב מזה שנמדדו בדם החולה. ז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קולגנאז | סיגמא | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | ללא סידן, ללא מגנזיום |
| דאוקסיריבונוקלאז I | Sigma | DN-25 | כמות עקבות |
| מאגר ליזה RBC | Sigma | R7757 | |
| מסננת תאים | BD | 352340 | רשת 40 מיקרומטר |
| ערכת תיוג פלואורסצנטית | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μ m מסנן מזרק | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. תרכובת | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
מקורות
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
