אנו מתארים כיצד להעביר חלבונים ומולקולות קטנות אטומות לתאים לתאי יונקים מתורבתים על ידי פרוטוקול דגירה משותפת פשוט עם מגיב הגורם לאברונים אנדוציטיים לדלוף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT
במאמר זה
סיכום
תקציר
אסטרטגיות משלוח macromolecular בדרך כלל לנצל את מסלול endocytic כתוואי כניסה סלולרית. עם זאת, מלכוד endosomal מגביל מאוד את היעילות שבה מולקולות גדולות לחדור את מרחב cytosolic של תאים. לאחרונה, יש לנו לעקוף בעיה זו על ידי זיהוי מגיב dfTAT, קשר דיסולפיד דימר של תאת פפטיד שכותרתו עם tetramethylrhodamine fluorophore. יש לנו נוצר דימר כותרתו fluorescently של תאת הטיפוסית פפטיד חודר תאים (CPP), dfTAT, שחודר לתאים חיים, ומגיע לחלל cytosolic של תאים עם יעילות גבוהה במיוחד. משלוח cytosolic של dfTAT מושגת בשורות תאים מרובות, כוללים תאים ראשוניים. יתר על כן, משלוח אינו ניכר להשפיע על כדאיויות תא, התפשטות או ביטוי גנים. dfTAT יכול לספק מולקולות, פפטידים, נוגדנים, אנזימים פעילים ביולוגי קטנים וגורם שעתוק. בדו"ח זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים מעורבים בdfTAסינתזת T ומשלוח סלולארי. כתב היד מתארת כיצד לשלוט בכמות החלבון שנמסר למרחב cytosolic של תאים על ידי שינוי כמות החלבון מנוהלת extracellularly. לבסוף, המגבלות הנוכחיות של הטכנולוגיה החדשה הזו והשלבים כרוכים באימות משלוח הם דנו. הפרוטוקולים תיארו צריכים להיות מאוד שימושיים עבור מבחני מבוססי תאים, כמו גם למניפולצית vivo לשעבר ותכנות מחדש של תאים.
מבוא
המשלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות תא חדיר לתאים חיים הוא לעתים קרובות רצוי ביישומים רבים ביולוגיים או ביוטכנולוגי (הדמיה סלולרית, מבחני פונקציונליים, תכנות מחדש של תאים, וכו '.) 1-4. גישות משלוח רבות כבר דווחו, כולל microinjection, electroporation, או שימוש בסוכנים מובילים (לדוגמא., פפטידים חודרים תאים כגון TAT, שומנים) 5-7. כל טכניקה יש בדרך כלל יתרונות וחסרונות ספציפיים שעשויה להפוך את הגישות אלה מתאימים ליישומים מסוימים אך לא לאחרים. בעיות נפוצות כרוכות יעילות ירודה משלוח ו / או חוסר שליטה של כמה חומר מועבר 8,9, רעילות או השפעה פיזיולוגית מזיקה 10,1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. SPPS: CK TATG סינתזה (TMR) (fTAT)
הערה: dfTAT מיוצר בשני שלבים: סינתזה של fTAT מונומר בסינתזה פפטיד השלב מוצקה ואחרי דיסולפיד אג"ח dimerization כדי ליצור dfTAT.
- להתנפח 500 מ"ג של שרף MBHA אמיד החלקה בdimethylformamide (DMF) בכלי SPPS 50 מיליליטר סטנדרטי עבור שעה 1.
- בצע deprotection FMOC ידי דוגרים שרף FMOC המוגן בפתרון piperidine 20% (20% בpiperidine DMF, 10 מיליליטר (0.30 mmol). לבצע צעדי deprotection פעמיים (באמצעות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להעריך את ההבדל בין fTAT וdfTAT, תאי הלה מודגרת עבור שעה 1 עם כל פפטיד כדי לקבוע את ההבדל בלוקליזציה הסלולרית שלהם. ההפנמה של שני CPP של הוערכה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 2 מראה כי fTAT (20 מיקרומטר) localizes בהפצת punctate. התפלגות זו עולה בקנה אחד עם פפטיד שנותר לכוד בתוך endosomes. בניגוד לכך, אות הקרינה של dfTAT (5 מיקרומטר) מציגה חלוקה הומוגנית ברחבי cytosol והגרעין. איור 3 מראה כי חלוקת cytosolic של dfTAT הוא ציינה במספר שורות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התאים המשמשים למשלוח dfTAT לא צריך להיות יותר מדי מחוברות (> confluency 90%) מאז זה עשויים להשפיע על יעילות המשלוח. התאים צריכים להיות גם בריאים: תאים מתים בתרבות יכולים לשחרר ברים אפופטוטיים עם שdfTAT יכול לקיים אינטראקציה (לדוגמא, ה- DNA מגרעינים מושפלים). זה בתורו יכול להפריע ליעילות משלוח ואת איכות ההדמיה. תאים יש לשטוף ביסודיות כדי להסיר FBS לפני הוספת dfTAT. הווה BSA בFBS יכול להיקשר לdfTAT וזה יכול להפחית את היעילות של משלוח dfTAT. שטיפות עם זאת, יש לבצע עם כוח .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מאמר זה נתמך על ידי פרס מספר R01GM087227 מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית, תוכנית המחקר המתקדם של נורמן אקרמן וקרן רוברט א. וולש (מענק A-1769).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| הפרין | סיגמא | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX כחול | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX ירוק | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) ציסטאין | Hyclone | הזמנה מיוחדת | |
| חומצות אמינו מוגנות FMOC | Novabiochem | ||
| dfTAT | דגימות יסופקו על פי בקשה (צור קשר: pellois@tamu.edu) | ||
| ארון | |||
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך | אולימפוס | דגם IXB1 | מצויד בחימום stage הנשמר ב -37 מעלות; C ועם מצלמת Rolera-MGI Plus עם תאורה אחורית של התקן מכפיל מטען (EMCCD) (Qimaging). |
| 37 מעלות; סינתיסייזר פפטיד או כלי < 5% COsub>2 | |||
| לביצוע סינתזה |
מקורות
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Del....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
