מאמר שיטה

הערכה של הפעלת תא Perigenital רגישות וערמונית תורן במודל עכבר של הפרדה אימהית עובריים

DOI:

10.3791/53181

⸱

13 באוגוסט 2015

 ,  ,  , 
1Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודדים הפעלת perigenital מכאנית רגישות ותורן תא בערמונית של C57BL / 6 עכברי זכרים שעברו הפרדיגמה מתח בתחילת חיים - הפרדה אימהית יילודים, על מנת לגרום למודל פרה-קליני של תסמונת ערמונית כרונית / כרוני כאבים באגן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ערמונית כרונית / תסמונת כאב כרונית באגן (CP / CPPS) יש שכיחות לאורך חיים של 14%, והוא אבחון האורולוגים הנפוץ ביותר עבור גברים מתחת לגיל 50, ובכל זאת היא הפרעת כאבי אגן לפחות הבינה ולמד כרונית. משנה משמעותי של חולים עם כאבי אגן כרוני דו"ח שחווה מתח מוקדם חיים או התעללות, אשר במידה ניכרת יכול להשפיע על התפקוד והרגולציה של ציר ההיפותלמוס בלוטת יותרת המוח-יותרת הכליה (HPA). הפעלת תא פיטום, שהוכחה להיות מוגבר בשני השתן והביעה הפרשות של הערמונית של חולים / CPPS CP, מוסדרת באופן חלקי על ידי הפעלה במורד הזרם של ציר HPA. הפרדה אימהית יילודים (NMS) הייתה בשימוש כבר למעלה משני עשורים ללמוד את התוצאות של מתח בתחילת חיים במודלים של מכרסמים, לרבות שינויים בציר HPA והרגישות קרביים. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בNMS כמודל פרה-קליני של CP / CPPS בC57BL / 6 עכברי זכרים. אנו מתארים את המתודולוגיהלביצוע NMS, הערכת אלודיניה perigenital המכנית, וראיות היסטולוגית של הפעלת תא פיטום. כמו כן אנו מספקים ראיות לכך שלחץ פסיכולוגי מוקדם יכול להיות השפעות ארוכות טווח על המערכת ואברי המין הגברית בעכברים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאבי אגן כרוניים הוא לא בעצמו מחלה, אלא לטווח הקשורים לכאב המתמשך הספונטני ו / או עורר של חולים שאובחנו עם תסמונת מעי רגיז (IBS), דלקת שלפוחית ​​השתן / תסמונת שלפוחית ​​השתן כואבת ביניים (IC / PBS), vulvodynia, או ערמונית כרונית / תסמונת כאב כרונית באגן (CP / CPPS). תסמונות אלה לעתים קרובות נלווים וחולקים מאפיינים רבים שבאין להם פתולוגיה קשורה או אטיולוגיה הבסיסית מזוהה, למרות בעיות בתפקוד במערכת החיסונית, מערכת עצבים מרכזית, ומערכת עצבים היקפית הוכחו לתרום לתחזוקה וההתקדמות של הפרעות אלה 1 -3. חולים עם כאבי אגן כרוניים נוטים יותר להציג עם סימפטומים של נוסף, הפרעות תפקודיות כאב והפרעות במצב רוח, כולל חרדה, דיכאון, והפרעת פאניקה 4-6, אשר נקשרה עם תפקוד שינה של hypothalamic- שאינו קשור-אגן- pituitary-ציר יותרת הכליה (HPA) 7-10. חשיפה ללחץ חיים מוקדם או טראומה מהווה גורם סיכון משמעותי לפיתוח הפרעות HPA ותסמונות כאב כרוניים קשורות 10,11 ו, כאמורים, משנה משמעותי של חולים עם הפרעות כאבי אגן פונקציונליות מדווח על אירועי ילדות שליליים כגון התעללות או הזנחה חווה 12-14.

מודלים של מכרסמים של הפרדת ילוד אימהית (NMS), הכולל הסרת הגורים מסכרם לתקופה קצובה של זמן במהלך תקופת preweaning, שימשו במשך שני העשורים האחרונים כדי ללמוד את התוצאות של מתח בתחילת חיים. באופן כללי, NMS הוכח להגדיל הפעלת HPA ציר, והתנהגויות כמו חרדה-תוצאה, ישירות על ידי המשפיע על ביטוי גנים בהיפותלמוס, כמו גם שיבוש רגולציה במורד הזרם ממבנים הלימבית 15-18. שיבוש תפקוד ציר HPA הנכון הוכח לתרום למעי גס עלה 19-22 ונרתיק 16 רגישות המוצגת על ידי מודלים NMS מכרסמים, אך למרות אפיון נרחב של ההשפעה לטווח הארוך של דלקת בשלפוחית ​​השתן לאחר לידה 23-25, את ההשפעה של לחץ בתחילת חיים במידה רבה הלכה לא נחקרה באיברים ואברי המין. לכן, המחקר הבא יתאר כיצד לבצע NMS בעכברים, ולאחר מכן להעריך רגישות perigenital מכאנית וחדירת תא תורן / הפעלה בערמונית כדי לאמת את השימוש בעכברי NMS גבריים כמודל פרה-קליני עבור CP / CPPS.

של כל הפרעות כאבי אגן אובחנו כרוניות, CP / CPPS היא אולי תסמונת לפחות מוכרת היטב ומאופיינת, למרות שיש שכיחות לאורך חיים של כ 14% -26 ועלויות מטופל שנתיות נאמדו ב$ 4400 (כפול מזו של כאב גב תחתון או שגרונית דלקת פרקים 27). חולים עם CP כאב דו"ח / CPPS בחיץ הנקבים, רקטום, ערמונית, איבר מין, אשכים, ו / או 28 בטן, לחוות הייתוארן גר בלחץ פסיכולוגי בהשוואה לחולי שליטת 29, ובהווה נפוץ עם סימפטומים של או אובחן עם הפרעות נלוות כרוניות אגן כאב או מצב רוח 5,29-31. זיהום חוזר ונשנה, האפיתל הדולף, דלקת עצבית, ואוטואימוניות יש כל שיערו כגורמים אפשריים הבסיסיים של CP / CPPS 2,32,33, כמו גם הפעלת תא פיטום וdegranulation 34. הפרשות של הערמונית הביעו מהגברים עם CP / CPPS עלו רמות tryptase תא פיטום וגורם גדילה עצבית (NGF) 34, ומחקר מאוחר יותר אישר כי tryptase וקרבוקסיפפטידאז (CPA3), סמן של הפעלת תא פיטום, גם הוגדלו ב שתן של חולי CP / CPPS 35. התפקיד הפוטנציאלי לתאי פיטום בתחילה והתחזוקה של CP / CPPS היה מוקד עיקרי של מחקר בבעלי חיים בתסמונת זו עד כה. המודל המכרסם הנפוצה ביותר מועסק בשימוש ללמוד CP / CPPS הוא ערמונית אוטואימוניות ניסיונית (EAP) המודל generated על ידי הזרקה תת עורית של אנטיגן הערמונית באדג'ובנט של פרוינד המלא, מה שגורם בדרגות שונות של דלקת ערמונית תלוי במין וזן המשמש 34,36-39. חדירת תא פיטום והפעלה / degranulation הוכח להגדיל אינדוקציה של EAP 34,35,40 הבאה. עכברים מהונדסים חסרים או תאי פיטום 34 או קולט tryptase 35 PAR2 לא לפתח רגישות ערמונית טקטיקה הבאה EAP, בניגוד לעכברי EAP wildtype. בעוד מודל פרה-קליני זה משכפל רב של המאפיינים של CP האדם / CPPS, פרוטוקול האינדוקציה הוא לא מעיד על מצבו של האדם, שבו יש אטיולוגיה מגוונת ולעתים קרובות אינו כרוכות דלקת ישירה, זיהום או פציעה של הערמונית.

ההשפעה של מתח בתחילת חיים על התפתחות CP / CPPS בבני אדם במידה רבה הלכו נחקרת; עם זאת, מחקר על ידי הו, et al. 41, הוכיח כיn שדיווח על היסטוריה של ילדות פיזית, רגשי, ו / או התעללות מינית היתה באופן משמעותי סיכוי גבוה יותר לחוות סימפטומים המעידים על CP / CPPS. יתר על כן, הם הראו כי הן כאב ועשרות שתן היו גבוהים יותר בחולים עם היסטוריה של התעללות פיזית ורגשית. אנחנו הוכחנו בעבר כי באותו הפרדיגמה NMS בC57BL / 6 נקבות עכברים מייצרת רגישות יתר בנרתיק וביטוי גנים לא תקין בשני נרתיק ושלפוחית ​​שתן מרמז על תפוקת ציר HPA מתפקד 16. עדות זו בשילוב עם השכיחות הגבוהה של CP חולים / CPPS הצגה עם מחלות רקע אחרים 42, כוללים IC / PBS והפרעות במצב רוח, שברורים יותר הוכחו להיות מקושר עם חשיפת מתח חיים המוקדמים 12-14, מספקת רציונל לשימוש ב מודל NMS לחקור CP / CPPS בעכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה תואמים את הנחיות NIH בהתאם להנחיות שצוינו על ידי המרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

1. הפרדת ילודים אימהית (NMS)

  1. צג סכרים בהריון יומי ללידות המלטה.
    הערה: יום ההמלטה נולדה נחשבת P0.
  2. על P1, להסיר את הסכר מהכלוב בבית ואת המקום לתוך מיכל המשני נקי.
  3. לשפשף את קומץ המצעים בין ידיים בכפפות נקיות כדי לשמור על ריח של הכלוב בבית.
  4. להוסיף עומק של 1 - 2 סנטימטר של מצעי כלוב בבית לנקי, כראוי שכותרת 2 כוס זכוכית L. להוסיף כמחצית מכל חומר נוסף להעשרת מצעים שנמצא בכלוב בבית, למשל, נייר nestlet, להתקמט, לכוס הזכוכית.
  5. מניח בעדינות את כל הגורים מהמלטה אחת, בנפרד, באותו הכוס.
  6. מייד למקוםהכוס בחממה שנערכה בלחות 33 מעלות צלסיוס ו -50% עבור 180 דקות.
  7. הסר את הסכר מיכל המשני ולהחזיר אותה לכלוב בבית. להחזיר את הכלוב בבית למיקום הדיור המתאים בתוך ביבר.
  8. חזור על תהליך זה עבור כל המלטה עוברת NMS, באמצעות כפפות נקיות ומכולות המשניות עבור כל המלטה / סכר.
  9. בסוף תקופת ההפרדה 180 דקות, להחזיר את ההמלטות לכלובים בביתם באותו סדר כפי שהם הוסרו.
  10. אחזר את הכלוב בבית של ההמלטה הראשונה שהופרדה מוקדם יותר ביום. הסר את הסכר מהכלוב בבית ואת המקום לתוך מיכל המשני נקי.
  11. הסר את הכוס הראשונה מהחממה ולשפשף קומץ של מצעים בין ידיים בכפפות נקיות כדי לשמור על ריח של הכלוב בבית בזמן טיפול הגורים.
  12. בעדינות להזיז את הגורים, בנפרד, מהכוס לכלוב בבית.
  13. לחזור כל העשרה ומצעים שנותר בכוס להכלוב בבית.
  14. להחזיר את הסכר מיכל המשני לכלוב בבית ולהחזיר אותו למיקום הדיור המתאים בתוך ביבר.
  15. יש לשטוף את הכוס עם מים ולהחזיר אותו לחממה. השתמש באותה כוס לכל המלטה לאורך כל הליך ההפרדה.
  16. חזור על תהליך זה עבור כל המלטה עוברת NMS באותו סדר כפי שהם הושמו באינקובטור.
  17. חזור על הליך כל זה עבור כולם מצויה המלטה NMS כל יום דרך P21.
  18. לגמול את גורי NMS ונאיביים על P22 על ידי הצבת המלטה מאותו המין יחד בכלובים נקיים מלאים במזון ובמים. צריכים להיוולד גורים נאיביים ושוכנו באותם תנאים כמו עכברי NMS, אבל לא לעבור טיפול נוסף מחוץ למשימות גידול בעלי חיים נורמלים.

2. Perigenital מכאני רגישות

  1. התקנת מכשירי פון פריי
    1. להביא את העכברים לחדר הבדיקות ולאפשר להם להסתגל ל30דקות בעוד שנותרו בכלובים בביתם.
    2. הכן את אזור הבדיקה על ידי הצבת underpad סופג מתחת שולחן מוגבה רשת תיל העליון (79 סנטימטרים X 28 סנטימטרים) שמספק מספיק מקום על מנת לאפשר לחוקר להתקרב מן החלק התחתון בלי להבהיל את העכברים, כ 55 סנטימטר בגובה.
    3. הנח עד 12 עכברים, בנפרד, תחת תאי פלסטיק שקופים, מחוררים (11 סנטימטרים X 5 סנטימטרים X 3.5 סנטימטרים) בחלק העליון של טבלת רשת תיל. מניחים חפץ כבד על גבי התאים כדי למנוע עכברים לברוח.
    4. להסתגל לעכברים 30 דקות נוספות על המסך לפני הערכת סף נסיגה.
  2. הערכת Perigenital מכאנית רגישות
    1. בצע את השיטה למעלה למטה באמצעות סט סטנדרטי של monofilaments פון פריי המדורג 43. השתמש בmonofilaments הבא: 1.65 גר ', 2.36 גר', 2.83 גר ', 3.22 גר', 3.61 גר ', 4.08 גר', 4.31 גר ', וגרם 4.74.
      1. החזק את הבסיס של monofilament גרם 3.22 ולחשוף את מונו חזר בונימה.
        הערה: בדגמים מסוימים לא יכולים להיות חוט חד חזר.
      2. למקם את החללית כדי שהחוט חד הוא בכיוון אנכי וכאשר העכבר הוא ערני, חסר תנועה, ומשקל הגוף שלה מחולק באופן שווה בין רגליו האחוריות להחיל אותו אל צד ימין או השמאל של כיס האשכים, הימנעות קו האמצע, עד קל העיקול הוא ציין בנימה.
      3. החזק את החוט חד במקום במשך 10 שניות או עד שהחיה מראה תגובה חיובית.
        הערה: תגובה חיובית נחשבת לאידיוט או לקפוץ נמרצים בתגובה לבקשת monofilament או ליקוק או נשיכת התנהגות המכוונת לחוט חד. אם מהלכי העכבר במהלך יישום monofilament 10 שניות מבלי להציג התנהגויות אלו, monofilament יש הערכה מחדש לאחר תקופה שאר 1 דקות ארוכות מינימום. אם עכבר לא מהלכים ולא מציג כל מעל התנהגויות המופיעות ביישום monofilament 10 שניות, זה נחשב תגובה שלילית.
      4. רשום את התגובה, שלילי או חיובי, במחברת מעבדה או מחשב נייד ולחזור על הליך זה על כל העכברים שנותרו באמצעות החוט חד 3.22 גר '.
      5. לבדוק את כל העכברים שוב באמצעות החוט חד המתאים הבא. הערה: אם העכבר הציג תגובה שלילית לmonofilament 3.22 גר ', להחיל את החוט חד 3.61 גר', באותו אופן ולהקליט את התגובה. אם העכבר הציג תגובה חיובית לmonofilament 3.22 גר ', להחיל את החוט חד 2.83 גר' ולהקליט את התגובה.
    2. המשך בדיקה של כל עכבר באמצעות החוט חד גדול יותר או קטן יותר הבא, כפי שמתאים, ל4 אפליקציות נוספות לאחר התשובה החיובית הראשונה הוא ציינה.
    3. חזור עכברים בכלובים הביתה.
    4. השתמש בשווי של החוט חד פון פריי הסופי שיושם בסדרת המשפט ביחידות יומן לחשב 50% סף נסיגה גרם כפי שמתואר בet al Chaplan. 43.
כותרת "> 3. מכתים תא acidified toluidine הכחול הפיטום

  1. עיבוד רקמות
    1. לנתח רקמת ערמונית 44 מעכברים שכבר perfused intracardially עם paraformaldehyde 4% קרים כקרח 45. Postfix הרקמה paraformaldehyde 4% עבור שעה 1 ב RT ואז cryoprotect בסוכרוז 30% ב1x PBS על 4 מעלות CO / N.
    2. הכן אמבט (30 מיליליטר) קטן של heptane ולמקם אותו על קרח יבש.
    3. יש לשטוף את רקמת הערמונית ב1x PBS ולייבש באמצעות אור החובה למחות.
    4. הכנס את רקמת הערמונית לheptane הקר עד שהוא קפוא.
    5. מייד למקם את רקמת הערמונית הקפואה בcryomold מכיל תקשורת ומקום לתלייה על קרח יבש עד שקפא.
    6. חנות cryomolds ב -20 ° C.
    7. רוחבי לחתוך את רקמת הערמונית ל7 cryosections מיקרומטר עבה באמצעות cryostat.
    8. הנח 8-12 cryosections אינו סידורי כי היקף האורך של הרקמה, על גבי שקופיות מיקרוסקופ חיובי טעונים.
    9. חנות סיימה שקופיות ב -20 ° C עד עיבוד נוסף.
  2. הכנת acidified toluidine הכחול
    1. להוסיף 1 גרם של toluidine הכחול O 100 מיליליטר 70% אתנול ו מערבולת עד בפתרון להכין פתרון מניות 1%. פתרון המניות יכול להיות מאוחסן על RT עד שלושה שבועות.
    2. הוסף 1 גרם NaCl למים 100 מיליליטר בכוס מונחת על גבי צלחת ומערבבים.
    3. התאם את ה- pH של תמיסת NaCl באמצעות 12 M HCl עד טווח pH של 0.5-1.0 מושגת.
    4. הכן את פתרון toluidine הכחול 0.25% עובד על ידי שילוב של 8 מיליליטר של פתרון מניות toluidine הכחול ו -32 מיליליטר של 1% פתרון NaCl. פיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח שילוב כולל של פתרון מניות toluidine הכחול ומערבבים בעזרת מערבולת. הפתרון עובד חייב להיעשות טרי ומושלך לאחר השימוש.
  3. מכתים cryosections הערמונית
    1. הסר את השקופיות להיות מעובד מהמקפיא ולאפשר לאזן לRT לכ -30 מ 'ב.
    2. שטוף את חלקי רקמות על ידי בנפרד טבילת השקופיות עבור כ 1 שניות לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל נפח מספיק של 1x PBS על מנת להבטיח כי סעיפי רקמות רכוב שקופיות יהיו שקועים לחלוטין. לאפשר שקופיות לאוויר יבשות במגבת נייר.
    3. מגלשות מקום בצנצנת מכתימה זכוכית המכילה 0.25% פתרון toluidine הכחול עובד מספיק כדי להבטיח שסעיפי רקמות רכוב שקופיות יהיו שקועים לחלוטין ודגירה במשך 10 - 15 דקות ואילו על כיסא נדנדה פלטפורמה נקבעה על 15 סל"ד.
    4. טובלים שקופיות ב1x PBS כ 1 שניות כדי לשטוף את עודף toluidine הכחול.
    5. מניחים שקופיות בתיבת שקופיות או מדף בצורה כזו כי השקופיות על צדם, כדי לאפשר ניקוז.
    6. ייבש את השקופיות בתנור על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 2 שעות או O / N ב RT.
    7. מייבשים שקופיות באמצעות אלכוהול במהירות, מה שמאפשרים את השקופיות להתייבש לחלוטין בין חשיפות אלכוהול. מגלשות יבשים על ידי ניקוז על מגבת ניירND גב וקצות מנגב עם אור חובה למחות.
      1. לטבול את השקופיות ב -95% EtOH כ 1 שניות ולאפשר לו להתייבש לחלוטין. חזור על תהליך זה 1 - 10 פעמים עד שהרקמה מתייבשת יותר כחולה יותר מסגול.
      2. לטבול את השקופיות בEtOH 100% לכ 1 שניות ולאפשר לו להתייבש לחלוטין. חזור על תהליך זה 1 - 10 פעמים עד שהרקמה היא כהה לכחול בינוני, אבל לא סגולה.
    8. תקן את הכתם על ידי דוגרים שקופיות קסילן 100% במשך 3 דקות. לאפשר לו להתייבש.
    9. Coverslip השקופיות עם גליצרול, PBS, או תקשורת הרכבה קבועה מבוסס קסילן. מסננים תקשורת וחנות עודפות בRT.
  4. תאי פיטום כימות
    1. דמיינו את סעיפי רקמות כחולים-הצבעוניים toluidine בהגדלה 20X באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 2).
    2. לספור את המספר הכולל של תאי הפיטום הנוכחיים בתחום דמיין ולהבדיל בין תאי פיטום הלא degranulated וdegranulated. מגניפיקט 40Xיון עשוי להיות נחוץ כדי לאשר מעמד פרור בכמה תאי פיטום.
      הערה: תאי פיטום ללא degranulated תערוכה metachromasia הצפוף עם קלוש אין או מתווה גרעינית ו / או לא חול גרגירים סביב התא. תאי פיטום Degranulated התערוכה metachromasia פחות אינטנסיבי ויש לי מתווה ברורה ברורה של הגרעין ו / או גרגירים חופשיים בתוך הציטופלסמה ומחוץ לגבול התא.
    3. תמשיך להעריך את המספר הכולל של תאי פיטום הלא degranulated וdegranulated בשלמות של סעיף הרקמה הנוכחי. חזור על הליך זה על לפחות 7 סעיפים נפרדים נוספים, המשתרע לכל האורך כל רקמה.
    4. חישוב אחוזי degranulated (DG) לסך תאי פיטום לכל רקמה / עכבר על פי המשוואה הבאה: (תאי פיטום DG / תאי פיטום סה"כ) x 100.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים שעברו NMS הראו ראיות התנהגותיות מעידות על CP / CPPS. כאשר נבדק עם סדרה מדורגת של monofilaments פון פריי, עכברי NMS 8 שבוע-ישנים (n = 4) מוצג אלודיניה המכנית perigenital בהשוואה לעמיתיהם נאיביים (n = 5, איור 2). עדות לכך שהפחתה משמעותית (p <0.01; מבחן t) בסף הנסיגה המכני שעורר תגובה התנהגותית חיובית, נרשם כאידיוט נמרץ או לקפוץ בתגובה לבקשת monofilament או ליקוק או התנהגות נשיכה מופנה כלפי monofilament .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה לשימוש בלחץ בילוד, בצורה של NMS, כדי לגרום לsymptomology מעיד על CP / CPPS בעכברי זכרים בוגרים. כמבוגרים, עכברי NMS להציג אלודיניה המשמעותית perigenital המכנית, כמו גם ראיות של degranulation תא תורן ברקמת ערמונית. השימוש בNMS הוא גישה חדשנית לפיתוח מודל פרה-קליני של CP / CPPS בכך שהוא משכפל את המתח בתחילת החיים, כי הוא דיווח לעתים קרובות על ידי חולים עם כאבי אגן כרוניים 12-14, כמו גם שילוב אינדוקציה לא פולשנית, כ בניגוד לשימוש נפוץ יותר, ומער...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לג'אנל ריאלס, רייצ'ל סופל ופרנק וואנג על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), מענק המרכז למצוינות במחקר ביו-רפואי (COBRE) P20 GM104936 (JAC), קרנות סטארט-אפ ותמיכת ליבה מפרס הפיתוח המוסדי של קנזס (IDeA) P20 GM103418, תמיכת ליבה מ-Kansas IDDRC P30 HD002528, ותוכנית המלגות העצמית של מדיסון ולילה (ANP).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברים נקבות C57BL/6 בהריון צ'ארלס ריבר027יש לעקוב מדי יום אחר נקבות הרות מתוזמנות או לא מתוזמנות ללידה בבית.
כוסות זכוכית 2 ליטרסיגמא-אולדריץ'CLS10002Lכל המלטה NMS תוחזק באותה לאורך כל תקופת ההפרדה של 21 יום.
חממת אוויר מאולצת VWR, בסיסיתVWR International414005-124החממה צריכה להיות מוחזקת ב-33 מעלות; C ו-50% לחות.
מעריך חושי מבחן מגע, ערכה של 20 (אסתזיומטר Semmes-Weinstein Von Frey להערכת מגע)Stoelting58011יש להשתמש במונופילמנטים הבאים להערכת רגישות סביב המין: 1.65 גרם, 2.36 גרם, 2.83 גרם, 3.22 גרם, 3.61 גרם, 4.08 גרם, 4.31 גרם ו-4.74 גרם.
מתחם בעלי חיים (12 עכברים, 6 חולדות)IITC435הקפד להניח חפץ כבד על גבי מכלאות בעלי החיים האקריליות כדי למנוע מעכברים לברוח.
מעמד רשת לעכברים וחולדות (12 עכברים 6 חולדות)IITC410מקם מעמד על שולחן יציב לגישה נוחה.
מי מלח עם חוצץ פוספטSigma-AldrichP5493מדללים את מלאי ה-10x PBS ל-1x PBS.
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'P6148יש צורך בתמיסת פרפורמלדהיד של 4% כדי לחלחל עכברים תוך קרדיאלי ורקמת פוסט-פיקס כהכנה לצביעה של תאי פיטום.
סוכרוזSigma-AldrichS5016Cryoprotect רקמה קבועה בתמיסת סוכרוז 30% ב-4° C בן לילה.
הפטןסיגמא-אולדריץ'246654מצננים את הפטן על קרח יבש כדי להקפיא רקמות.
קריומולד סטנדרטי VWR International4557כדי לסייע בהקפאת רקמת הערמונית לפני חתך קריוסטט
Tissue-Tek OCT CompoundSakura458312 x 125 מ"ל
VWR Superfrost Plus Micro SlideVWR International48311-70375 x 25 x 1 מ"מ
Toluidine Blue OSigma-Aldrich198161מאושר על ידי הוועדה לכתמים ביולוגיים. מתאים לשימוש ככתם מטאכרומטי לתאי פיטום.
אתנול, אבסולוט (200 הוכחה)פישר סיינטיפיקBP2818-4ביולוגיה מולקולרית כיתה, פישר ביוריאגנטים; יהיה צורך בתמיסות של 95% ו-100% לייבוש קריוסקציות מוכתמות לפני הדמיית תאי פיטום.
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9888יש להכין תמיסת NaCl מחומצת לפני צביעת קריוסקציה.
GeneMate סטרילי 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה BioExpressC-3394צינורות חד פעמיים המשמשים לערבוב אלמנטים כחולים של טולדין או לטבילת שקופיות ב-1xPBS.
צלחת מכתים קופלין ל -10 שקופיות, עם כיסוי זכוכית טחוןפישר סיינטיפיק08-815החזק עד 10 סטנדרטי 3 x 1 אינץ '. (75 x 25 מ"מ) מחליק גב אל גב. השתמש בכלים נפרדים עבור תמיסת עבודה Toluidine Blue, 95% EtOH, 100% EtOH וקסילן.
קסילנים (היסטולוגיים)Fisher ScientificX3Pלאחר התייבשות, הרקמה מנוקה עם קסילן.
קופסאות שקופיות מיקרוסקופ, 100 מקומותVWR International82003קופסאות יכולות לשמש לאחסון והובלה של שקופיות.
קופסת שקופיות מיקרוסקופ פישרברנדפישר סיינטיפיק22-363-400קופסאות שקופיות אלה בדרך כלל קטנות מספיק כדי להתאים לתוך קריוסטייט.
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516גליצרול הוא מדיום הרכבה מסורתי.
מדיום הרכבה, ריצ'רד-אלן סיינטיפיקVWR International4111מדיום הרכבה מחבר היטב את הכיסוי לשקופית.
משקפי Micro Cover, מלבניים, מס' 1VWR International48393-106כיסוי מונח על הרקמה המיובשת והנקייה כדי להגן על הדגימה.
מיקרוסקופ אורNikonמיקרוסקופ המחקר האוטומטי המתקדם Eclipse 90i, המשמש את המעבדה שלנו, הופסק והוחלף Eclipse Ni-E.   

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
  2. Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
  3. Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
  4. Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
  5. Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
  6. Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
  7. Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
  8. Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
  9. Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
  10. Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
  11. Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
  12. Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
  13. Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
  14. Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
  15. Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
  16. Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
  17. Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
  18. Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
  19. Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
  20. Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
  21. Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
  22. Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
  23. DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
  24. Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
  25. Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18(2011).
  26. Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
  27. Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
  28. Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
  29. Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
  30. Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
  31. Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
  32. Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
  33. Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
  34. Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
  35. Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
  36. Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
  37. Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
  38. Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
  39. Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
  40. Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
  41. Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
  42. Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
  43. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
  44. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3791(2012).
  45. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  46. Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51212(2013).
  47. Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Von FreyToluidine Blue

מאמרים קשורים