הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

13.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53182

⸱

20 באוקטובר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Hematology/Oncology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Molecular Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

כתב יד זה מפרט שיטה המשמשת ליצירת קסנוגרפלים שמקורם בחולי סרטן הערמונית (PDX) מתאי גידול במחזור (CTCs). יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חלופי לחקר סרטן הערמונית; הגידול המאובחן השכיח ביותר וסיבת מוות שכיחה מסרטן אצל גברים.

תקציר

מודלים של קסנוגרפט שמקורם בחולה (PDX) צוברים פופולריות בחקר הסרטן ומשמשים להערכת תרופות פרה-קליניות, זיהוי סמנים ביולוגיים, מחקרים ביולוגיים ואסטרטגיות רפואה מותאמת אישית. תאי גידול במחזור (CTC) ממלאים תפקיד קריטי בגרורות גידול ובודדו מחולים עם מספר סוגי גידולים. לאחרונה נעשה שימוש ב-CTCs ליצירת מודלים ניסיוניים PDX של סרטן השד והערמונית. כתב יד זה מפרט את השיטה ליצירת מודלים PDX של סרטן הערמונית מ-CTCs שפותחו על ידי קבוצתנו. היתרונות של שיטה זו על פני מודלים קונבנציונליים של PDX כוללים עצמאות מאיסוף דגימות כירורגיות ויצירת מודלים ניסיוניים בשלבי מחלה שונים. צנטריפוגה בשיפוע צפיפות ואחריה ליזה של תאי דם אדומים ודלדול ציטומטריית זרימה של תאים חד-גרעיניים חיוביים CD45 משמשת להעשרת CTCs מדגימות דם היקפיות שנאספו מחולים עם מחלה גרורתית. לאחר מכן מוזרקים ה-CTCs לעכברים מדוכאי חיסון; ניתן להשתמש ב-Xenografts שנוצרו לאחר מכן למחקרים פונקציונליים או לקצור לאפיון מולקולרי. המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שיטת הברירה השלילית המשמשת להעשרת CTC. למרות מגבלה זו, יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חדשני ליישום בחקר סרטן הערמונית.

מבוא

xenografts נגזר מטופל הם מודלים ניסיוניים יותר ויותר פופולריים המשמשים לחקר הסרטן. הם יכולים לשמש לאפיון של סמנים ביולוגיים ומסלולים ביולוגיים, הערכה טרום-קלינית של יעילות תרופה, ויצירה של avatars לטיפולים בסרטן אישית 1,2. בעבר, קבוצות מחקר אחרות פיתחו מודלים PDX או על ידי השתלה או הזרקת השעיות תא הסרטני בודדות או explants כל גידול לעכברים דיכוי חיסוני 1. PDX אלה מודלים דורשים אוסף כירורגית של גידול מוצק טרי, מיימת הממארת או תפליט פלאורלי ממטופל עובר הליך כירורגי שהוא גם יקר וחושף את המטופל לסיכון מוגבר לתחלואת iatrogenic.

התפתחות האחרונה משמעותית בחקר הסרטן כבר זיהוי, הבידוד ואפיון תאים סרטניים במחזור. תאים הסרטניים אלה לברוח ממסת הגידול הראשונית ולהיכנס במחזורשבו הם משחקים תפקיד קריטי בגרורות ולהרע, הגורם השכיח ביותר של סרטן הקשורים תמותה 3. ההערכה והאפיון של CTCs מכמה סוגים מוצקים גידול סיפקו מידע קליני לאבחון, פרוגנוזה, וניטור מחלת שייר 3. מגוון של גישות המשמשות כיום להסתמך על שני מאפיינים הפיזיים, הביטוי של סמנים ביולוגיים, או מאפיינים פונקציונליים של CTCs יכול לשמש כדי לבודד יעילות 4 CTCs. שיטות בידוד קיימים macroscale CTC כוללות צנטריפוגה צפיפות שיפוע, סינון פיזי עם נקבוביות מסנן והפרדה נגד מולקולות פני השטח. מתודולוגיות בידוד CTC הנפוצות ביותר מבוססות על לכידה מבוססת נוגדן של CTCs. שתי סלקציה חיובית ושלילית של סמנים פני התא יכולה להיות מועסק כדי לבודד CTCs מהדם היקפי. סלקציה חיובית לCTCs במחזור ההיקפי נפוצה משתמשת סמני אפיתל (למשל, EpCAM) שמחדש הביע בCTCs אבל תאים לא hematopoietic. החסרון של שיטה זו הוא שCTCs עם פוטנציאל גרורתי לעתים קרובות עבר אפיתל לmesenchymal מעבר (EMT), שdownregulates סמני משטח אפיתל 3. כדי לבודד CTCs עם פוטנציאל גרורתי, מתודולוגיה סלקציה שלילית המעסיקה את סמן משטח הדם, CD45, לרוקן את אוכלוסיית התאים הנורמלית של כדוריות דם לבנות ניתן להשתמש 5.

סרטן הערמונית הוא הסרטן הנפוץ ביותר שאובחן וגורם עיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן בגברים 6. המנגנונים של התקדמות גידול ותוקפנות אינם מובנות לחלוטין, ולכן הדור והאפיון של מודלים ניסיוניים כי לשחזר הטרוגניות המולקולרית של סרטן הערמונית הם עניין משמעותי. המודלים PDX של סרטן הערמונית היו נוצר בעבר על ידי קליטתם של תאי סרטן הערמונית אנושיים לimmunocomעכברים הבטיחו 7,8. עם זאת הדור של מודלים כאלה כבר הקשו על ידי השיעור הנמוך engraftment של סרטן הערמונית בעכברים דיכוי חיסוני, אשר נבע בעיקרו האופי העצל של המחלה. לאחרונה, CTCs כבר השתמש כדי ליצור סרטן השד 9, סרטן סרטן הריאות וערמונית 10 11 דגמי PDX. מחקרי הוכחה של קונספט אלה הציגו את האפשרות של יצירה עצמאי דגמי PDX של הצורך באיסוף דגימה כירורגית. במאמר זה אנו מתארים בפירוט שיטה לייצור מודל ניסיוני הרומן הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה נערך במוסד שלנו עם אישור מהלוח האתיקה מחקר המוסדי ועומד בכל הנחיות מוסדיות, לאומיות, ובינלאומיות לרווחת אדם.

1. אוסף של דם היקפי מחולים עם סרטן הערמונית מתקדם

הערה: בחר בחולים עם סרטן הערמונית גרורתי. לקבל את הסכמת מטופל בכתב ולתעד את המאפיינים קליניים של חולים, כולל גיל בבידוד וכימותרפיה קודמת וטיפולים הורמונליים. חולים עם מחלה גרורתית יהיו פוטנציאל יש ריכוז הגבוה ביותר של CTCs בדם היקפי.

  1. לאסוף דגימות דם לאחר הסכמה מדעת ותחת Institutional Review Board המתאים אושר פרוטוקול. ללבוש כפפות לטקס ומעיל מעבדה לאורך כל ההליך.
  2. חבר מחט 25 G פרפר וצינורות לבעל מחט. השתמש בספוגית אלכוהול כדי לנקות שטח שלוריד antecubital בין שריר הזרוע ואמה, ולאחר מכן להחיל חוסם עורקים לזרועו של המטופל.
  3. הכנס מחט פרפר לתוך וריד antecubital ולדחוף צינור איסוף דם לבעל מחט להתחיל אוסף. לאסוף כ 10 מיליליטר של דם בצינורות אוסף המכילים חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כדי למנוע קרישה.
  4. הסר מחט פרפר מהמטופל ולהפעיל לחץ עם כרית גזה סטרילית על אתר של ניקור וריד דקות 1. אתר מכסה בתחבושת סטרילית.

2. בידוד של תאי mononuclear

הערה: הדם שנאסף מהשלב 1 יכיל תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) (לדוגמא, לימפוציטים ומונוציטים) בנוסף לCTCs mononuclear.

  1. כל דם טפטפת לתוך צינור חרוטי קלקר 50 מיליליטר עם טפטפת סרולוגיות 5 מ"ל ולהוסיף מלח פתרון מאוזן הנקס (HBSS) ביחס של 1: 1. בעדינות תערובת פיפטה homogenize.
  2. להוסיף 15 מיליליטר של תמיסה מוכנה מסחרי (Ficoll-Paque) להפריד מרכיבי דם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מהירות נמוכה לצינור חרוטי 50 מיליליטר קלקר ריק.
  3. בעדינות פיפטה כל דם ותערובת HBSS, מהשלב 2.1, לתוך צינור הקלקר מהשלב 2.2, כדי ליצור שכבה עליונה ברורה. פיפטה סט להגדרה הנמוכה ביותר כדי למזער ערבוב של פתרונות, זה יבטיח הפרדה יעילה.
  4. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות ב RT (25 מעלות צלזיוס). האטה מוגדרת ההגדרה הנמוכה ביותר כדי למנוע ערבוב של פתרונות לאחר הפרדה. ההאצה ניתן להגדיר לכל מהירות.
  5. לאחר צנטריפוגה, לזהות את הפס לבן-אפור הדק של שכבת PBMCs וCTCs דחוק בין הפלזמה על פתרון עליון והפרדה בחלק התחתון של הצינור.
  6. לאסוף את התאים מהפס הלבן-אפור בשלב 2.5 לתוך צינור קלקר 50 מיליליטר בעזרת פיפטה העברה פלסטיק.
  7. להוסיף HBSS 50 צינור חרוטי מיליליטר קלקר עם PBMCs וCTCs וגentrifuge שוב ב 400 XG במשך 10 דקות RT לשטוף.
  8. למזוג גלולה נוזלית וגלולה ב 50 מיליליטר של HBSS ו צנטריפוגות שוב ב 400 XG במשך 3 דקות ב RT לשטוף.
  9. בטל supernatant, resuspend גלולה שנותר עם 5 מיליליטר של תאי דם אדומים תמוגה חיץ דגירה הפתרון למשך 5 דקות על RT.
  10. הסר את מאגר תמוגה תא דם האדום על ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 3 דקות ב RT.
  11. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מיליליטר PBS 1x בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) כדי לחסום לפני מכתים נוגדן.

3. תאי מכתים mononuclear עם CD45-FITC נוגדן לסלולרי קרינה המופעל מיון (FACS)

  1. לכמת את מספר תאי קיימא (trypan הכחולים-שליליים) (מצעד 2.11) באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי. הכן 10 6 תאי השעיה 1 x / מיליליטר (ב PBS 1x עם 10% FBS) ולמקם אותו על קרח עבור שעה 1.
  2. להפיץ לכמתהשעיה תא מהשלב הקודם לשני צינורות. צינורות תווית כשליטה וצביעת CD45.
  3. בצינור השליטה, להוסיף IgG1κ-FITC (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) בדילול של 1: 250. בצינור מכתים CD45, CD45 להוסיף FITC נוגדן ראשוני מצומדת (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) בדילול של 1: 250 ודגירת השעיות תא על קרח למשך 30 דקות. תיוג אנטיגן CD45 משמש להוציא תאי hematopoietic.
  4. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 3 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant.
  5. לשטוף את התאים פעמיים, על ידי השעיית כל גלולה עם סטרילי 1 x PBS בתוספת 10% FBS ואחריו צנטריפוגה ב 400 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
  6. Resuspend תאי פתרון 1 מיליליטר של 1x PBS המכיל 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
  7. סנן את הפתרון הסופי באמצעות כמוסות מסננת 35 מיקרומטר לצינורות 12 מ"מ x 75 מ"מ פוליסטירן.

4. בידוד של הערמונית CTCs ידיFACS

הערה: לנצל cytometer זרימה לאסוף CTCs השלילי CD45 החי.

  1. בקרות שנקבעו פיצוי באמצעות תאים מהצינור שכותרתו, "שליטה".
  2. צור שערים שלא לכלול פסולת ואשכולות של תאים באמצעות פרמטרים קדימה-פיזור וצד-פיזור מתאימים.
  3. להקים את שערי FITC באמצעות השעיות תא מהצינור שכותרתו, "CD45-FITC."
  4. תאי שער קיימא (DAPI שלילי) באמצעות כחול-ערוץ האוקיינוס ​​השקט.
  5. לאסוף אוכלוסייה שלילית CD45 לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר פוליסטירן חרוטי המכיל 2 מיליליטר של רוזוול פרק זיכרון מכון (RPMI) 1,640 בתוספת 10% FBS.
  6. צנטריפוגה ההשעיה תא גידול בערמונית מסודרים ב 400 XG במשך 3 דקות, ואז resuspend את כדורים ב200-500 μl של RPMI בתוספת 10% FBS.

5. הזרקה של CTCs לעכברים וניטור של xenograft צמיחה

הערה:לנהל את כל הליכי בעלי החיים בעמידה בפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים המוסדית. פרוטוקול זה נערך במוסד שלנו תחת בעלי חיים משתמשים בפרוטוקול ספציפי שאושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים שלנו בהתאם ועמידה בכל סוכנויות, תקנות רגולציה ומוסדיות הרלוונטיות והנחיות.

  1. מערבבים את ההשעיה תא גידול בערמונית מסודרים עם מטריקס ביחס של 1: 1 ומניחים על קרח.
  2. הרדימי עכבר לפני ההשתלה תת עורית בתא אספקת 5% (נ נ /) isoflurane בשאיפה בL 1 / דקה של חמצן. להבטיח הרדמה מתאימה על ידי בדיקה לאובדן של רפלקס קרנית ובוהן בעכבר.
  3. באמצעות מחט 25 G ומזרק 1 מיליליטר, להזריק 250 μl של תאי גידול ערמונית ותת עורי השעיה תא מטריקס לשני אגפים העליונים של עכבר immunodeficient זכר 8-10 בן שבוע. להזריק 250 μl ללא קשר לריכוז CTC כנפח ההזרקה הוא אניערך mportant. ממשל SQ מרבי בעכבר הוא לא יותר מ 1 מיליליטר.  
  4. צג עכברים על ידי ביצוע מישוש שבועי של אתרי הזרקת עכבר לצמיחה של צפיפות קשרי תת עורי ועל ידי מדידת משקל עכברים פעמיים בשבוע.
  5. להרדים עכברים בחנק פחמן דו חמצני ואחריו נקע בצוואר הרחם והסרטן xenografts קציר תת עורית ערמונית אנושית כאשר גודל גידול הוא יותר מ -0.5 סנטימטרים ופחות מ 1 סנטימטר הקוטר הגדול ביותר על מנת להבטיח רקמת גידול מספיק לניתוחים מולקולריים והמעבר סדרתי. להרדים עכברים עם סימנים של מצוקה או ירידה במשקל של 15%, למרות גידול לא מוחשי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה יוביל לדור של דגמי PDX מCTCs סרטן ערמונית המבודד CD45 שלילי. בהתבסס על שיטת הסלקציה השלילית בשימוש בפרוטוקול שלנו יש צורך להוציא תאים מתים באמצעות כתם DAPI. אחוז התאים השליליים CD45 זוהה על ידי cytometry זרימה משתנה ותלוי בניטל הגידול של המטופל (איור 1 א). מכתים Immunofluorescent של תאים ממוינים באמצעות CD45 וDAPI (לזהות גרעין תא) חושף תאים שליליים CD45, כפי שצוין על ידי החצים הלבנים (איור 1). באיור 1C, ניתן לראות צפיפות קשרי תת-עורי ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כתב יד זה מתאר שיטה לייצור המודלים PDX סרטן הערמונית מCTCs. השימוש בCTCs לדור של PDX יש דגמים כמה יתרונות חשובים פוטנציאליים בהשוואה לשיטות קיימות. ראשית, אוסף נגיש של CTCs מהדם היקפי מאפשר את הדור של דגמים ניסיוניים מאותו המטופל בשלבי מחלה שונים. שנית, איסוף דם מייצג שיטה בטוחה יותר וזולה לבודד תאים סרטניים בהשוואה לשיטות קיימות הדורשות הליכים כירורגיים לאוסף של תאים סרטניים.

שיטות מרובות של ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מודים לד"ר ג'ורדי אוצ'נדו מהמשאבים המשותפים של Flow Cytometry במרכז הרפואי הר סיני על עזרתם בניתוח ציטומטריית זרימה. אנו מודים לד"ר רומנה הוק ממתקן המשאבים המשותפים למיקרוסקופיה במרכז הרפואי הר סיני על סיוע ההדמיה. המחברים מודים לקרן TJ Martell על תמיכתה בפרויקט זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640Gibco Life Technologies11875-093
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco Life Technologies10437-028
פניצילין סטרפטומיציןGibco Life Technologies15140-122
פוספט חוצץ מלח (PBS)Corning Cell Gro21-031-CM
35 & micro; m מסננת תאיםBD Falcon352340
50 מ"ל צינור חרוטי פוליסטירןקריסטלגן23-2263
מאגר ליזינג תאי דם אדומיםSigmaR7757
DAPIInvitrogend3571
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440
צינורות פוליסטירן 12 מ"מ x 75 מ"מ עם מכסה מסננת תאיםBD Falcon
352235 BD Vacutainer צינורות איסוף דם לבנדר עם
BD עם כפתור לחיצה על מחט נסיגה 23 מד
BD שואב אבק מחזיק
פעמי לטקס חוסם
לטקס או כפפות
שאינן לטקסספוגיות
2 x 2 רפידות
תחבושת
25 גרם מחט
1 מ"ל מזרק
סט איסוף דם מכונף EDTA מחט חדעורקיםאלכוהולגזה כותנהדבק

מקורות

  1. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).
  2. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer research. 73, 5315-5319 (2013).
  3. Joosse, S. A., Gorges, T. M., Pantel, K. Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO molecular medicine. 1, 1-11 (2014).
  4. Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
  5. Liu, Z., et al. Negative enrichment by immunomagnetic nanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients. Journal of translational medicine. 9, 1-9 (2011).
  6. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics , 2013. CA: a cancer journal for clinicians. 63, 11-30 (2013).
  7. Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer cell. 22, 373-388 (2012).
  8. Klein, K. A., et al. Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice. Nature Medicine. 3, 402-408 (1997).
  9. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
  10. Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nature medicine. 20, 897-903 (2014).
  11. Vidal, S., et al. A Targetable GATA2-IGF2 Axis Confers Aggressiveness in Lethal Prostate Cancer. Cancer cell. 27, 223-239 (2015).
  12. Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
  13. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature. 17, 1514-1520 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:

Veronica Rodriquez-Bravo

to:

Veronica Rodriguez-Bravo

תגיות

PDXCD45
דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.