מאמר שיטה

לומד את ההרכב של עוריות Growth Factor Receptor בתאים השלמים באמצעות מתאם מיקרוסקופית

11.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53186

⸱

11 בספטמבר 2015

 , 
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את התיוג של קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) על תאי פיברובלסטים COS7, ולאחר מכן מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם של תאים שלמים במצב לחות. התווית הכילה נקודות קוונטיות פלואורסצנטיות. ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לחקור את הסטויכיומטריה של EGFR ברמת המולקולה הבודדת.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר את התיוג של הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) בתאי פיברובלסטים COS7, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הגומל לאחר מיקרוסקופית סריקה סביבתית אלקטרון (ESEM) של תאים בכל מדינת התייבשות. נקודות פלורסנט קוונטים (QDs) היו מצמידים את EGFR באמצעות פרוטוקול תיוג שני שלבים, מתן תיוג חלבון יעיל וספציפי, תוך הימנעות אשכולות מושרה תווית של קולט. מיקרוסקופ פלואורסצנטי סיפק תמונות סקירה של המקומות הסלולריים של EGFR. הגלאים מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים סריקה (STEM) שימש כדי לזהות את תוויות QD עם רזולוציה של ננו. תמונות גומלות וכתוצאה מלספק נתונים של ההפצה הסלולרית EGFR, וstoichiometry ברמה המולקולרית היחידה בהקשר הטבעי של התא שלם התייבשות. תמונות ESEM הגזע חשפו את קולט להיות נוכח כמונומר, כhomodimer, ובקבוצות קטנות. תיוג עם שני QDs שונה,כלומר, אחד פולט ב655 ננומטר וב 800 חשף תוצאות אופייניות דומות.

מבוא

גישה חדשה הוצגה לאחרונה, לכל תאי תמונה עם חלבונים שכותרתו במצב נוזלי באמצעות גזע 1-3, או מיקרוסקופ פלואורסצנטי הגומל וגזע 4-7. מתודולוגיה זו היא מסוגלת ללמוד את הפריסה המרחבית של חלבונים בממברנה וקומפלקסי חלבונים כוללים stoichiometry ברמת המולקולה בודדת בממברנות הפלזמה שלמות של כל תאים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מעורב תיוג ספציפי שני שלבים של חלבוני הקולטן עם נקודות קוונטיות ניאון (QDs) 8, ומיקרוסקופ אור הגומלת וESEM-גזע. כדוגמא, למדנו EGFR, חלבון קרום ששייך לsuperfamily קינאז החלבון. על יגנד מחייב, קולט מפעיל ולאחר מכן יוצר דימר עם עוד EGFR הופעל; מפל האות הבא מניע תא התפשטות 9. מוטציות שמובילות לביטוי EGFR החריג או פעילות לשחק תפקיד מרכזי בסוגים רבים של סרטן 10. ת'מחקרז הסידור המרחבי של הקולטן קרום זה בכל תאים מספק מידע חשוב על הקשר תפקודו ושינויים האפשריים 11-14. אבל הוא נשאר מאתגר לחקור את ההפצה של מונומרים EGFR, הדימרים, ואשכולות ישירות ברמה תאית (משנה) עם שיטות מיקרוסקופיה biochemical- או קונבנציונליות 15. השיטה שלנו מסוגלת לדמיין EGFRs עם רזולוציה מרחבית של כמה ננומטרים כך שמיקומם של חלבונים במתחם ניתן לקבוע. והכי חשוב, המידע שהושג על חלוקת stoichiometric מתייחס למצב המקורי של החלבון בתא ללא פגע.

על מנת להשיג מרחק קצר בין התווית והקולט, EGFR תויג ישירות דרך EGF ליגנד, באמצעות אג"ח ביוטין-streptavidin לQD. תווית זו יכולה להיות מזוהה גם עם מיקרוסקופ אלקטרונים וfluorescence-. יש לנו בשימוש בתווית זו להדמיה מתאם של תאי COS7 בהנוזל הסגור בתא microfluidic 1,16,17 בעבר. עם זאת, על חשבון מספר רב של מולקולות streptavidin לQD, תווית זו עשויה לגרום לאשכולות קולט, שמוביל ליעילות תיוג נמוכה או ניסויים יקרים למדי, ולא ניתן להסיק על ההרכב של החלבון הנחקר. ניתן להימנע מאשכולות קולט מושרה תווית לגמרי על ידי שימוש בהליך תיוג שני שלבים שהוצג כאן, וכתוצאה מכך בדיקה הכוללת EGF biotinylated שרק אחד נקודת streptavidin-קוונטים (STR-QD) בשילוב. התאים מודגרת ראשון עם EGF biotinylated, ולאחר מכן קבוע. צעד הקיבעון קובע את נקודת הזמן שבה תהליכי החלבון הם עצרו (בהתאם למהירות של קיבעון). STR-QD מיושם לאחר מכן כצעד שני של פרוטוקול התיוג. אשכולות אינם מתקיימים מאז תנועת קרום הדינמית של החלבונים היא הפריעה פעם החלבונים קבועות. יתר על כן, פתרון STR-QD, המהווה אתרוב הרכיב היקר של הניסוי, יכול להיות מיושם בריכוז נמוך מותאם, וצעד שני זה של תיוג הוא לא בזמן קריטי, כלומר, QD יכול להיות יחד בכמה דקות.

כדי לחקור את ההרכב של EGFR כמופץ בכל תאים, דגימות סלולריות הוכנו על השבבים סיליקון 18. לאחר החלת תיוג שני שלבי QD, וההקלטה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התאים היו שטופים במים טהורים, וצלמו במדינת התייבשות באמצעות ESEM-גזע 19. תמונות גומלות וכתוצאה מלספק מידע על ההפצה הסלולרית EGFR, וstoichiometry בהקשר הטבעי שלהם של תאי התייבשות. שיטה דומה שימשה ללמוד חלבוני HER2 בתאי סרטן השד במחקר שנערך לאחרונה 7.

פרוטוקול

1. הכנת תיוג וקיבוע ריאגנטים

  1. הכן חיץ תיוג (BSA-GEL-PBS) באמצעות בופר פוספט autoclaved, pH 7.4 (PBS). מוסף עם BSA 1% (V חלק אלבומין שור, ללא יוטין) וג'לטין 0.2% (GEL, מעור דג מים קרים) ומערבולת / לנער היטב.
    הערה: ניתן לאחסן ל~ 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן חיץ כביסה (BSA-PBS) מופר פוספט autoclaved, pH 7.4. מוסף עם BSA 1% ומערבולת / לנער היטב. הערה: ניתן לאחסן ל~ 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכן 50 מ"מ חיץ borate (BB) 200 מ"מ ממניות פתרון חומצה בור, pH 8.3 מותאם לעם 200 tetraborate נתרן מ"מ. הערה: ניתן לאחסן ל~ 12 חודשים על 4 מעלות צלזיוס.
  4. הכן מאגר M 0.1 cacodylate (CB) מ0.2 פתרון מניות cacodylate M נתרן, pH 7.4 מותאם ל, בתוספת 0.1 M סוכרוז.
    הערה: פתרון מניות נפתח יכול להיות מאוחסן במשך ~ 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס.
  5. הכן 0.1 M גליצין ב PBS (GLY-PBS).
    הערה: ניתן לאחסן ל~ 2 חודשים על 4 מעלות צלזיוס.
  6. הכן paraformaldehyde 3% בCB (3% PFA) מבקבוקון טרי או פתח של 16% PFA, פתרון מניות, כיתה EM.
    הערה: פתרון מניות נפתח יכול להיות מאוחסן במשך ~ 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס.
  7. הכן glutaraldehyde 2% בCB (2% GA) מעשה טרי (או פתח בקבוקון של) 25% מניות פתרון GA, הכיתה EM.
    הערה: פתרון מניות נפתח יכול להיות מאוחסן במשך ~ 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס.
  8. הכן פתרון תיוג 300 ננומטר EGF ביוטין
    1. לדלל פתרון מניות EGF ביוטין 6 מיקרומטר בBSA-GEL-PBS, להשתמש בהיקף של 100-200 μl לשבבים. להשתמש תוך כמה שעות.
  9. הכן 10 פתרון תיוג ננומטר STR-QD
    1. צנטריפוגה פתרון מניות streptavidin-QD במשך 4 דק 'ב 8000 XG, לקחת supernatant ולדלל 1:10 ב BB. סוגים שונים של QDs יכולים לשמש, למשל, QD655, או QD800. לדלל את ריכוז סופי בBSA-GEL-PBS, להשתמש 75-100 μl לשבבים. השתמש בכמה שעות.

2. הכנת הסיליקון מייקרו סכמות ממברנה Nitride

  1. נקה שקופיות זכוכית מיקרוסקופ, כמשמש למיקרוסקופ אור, עם רקמת חדר נקייה וכרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) אתנול כיתה.
  2. בשולחן עבודת זרימת אוויר למינרית עם רמת אבק נמוכה, לפתוח בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ, ולהניח את זכוכית מיקרוסקופ ניקתה לתוך הצלחת; לעזוב את המנה פתוחה.
  3. עם פינצטה נקייה, מעדיף מצופה בסיבי פחמן או ציפוי אחר, לקחת 4-10 שבבים עם ממברנות סיליקון ניטריד דקות (50 ננומטר), אחד אחרי השני, מתוך תיבת האחסון שלהם ועל שקופיות הזכוכית. תפוס את השבבים בעדינות בצדדים שלהם ולהימנע מלגעת בצד העליון השביר, בהיקף של קרום סיליקון ניטריד הדק. קח בזהירות רבה תמיד לשמור בצד קרום ולא לגעת בו.
    הערה: השבבים צריכים להיות מלבניים ויש לי קצוות שטוחים בניצב לסיליקון ניטריד מכוסהפנים, כך שהם יכולים להיות בקלות אחזו.
  4. סגור את המכסה של צלחת פטרי ולהביא אותו למכסת מנוע קטר. קבל רקמת חדר הנקי חדשה ולהפקיד אותו ליד צלחת פטרי. הכן שתי כוסות זכוכית 200 מיליליטר נקייה על ידי מילוי אחד עם 50-70 מיליליטר אצטון, ואחר עם נפח דומה של אתנול, שניהם הכיתה HPLC. העבר את השבבים משקופיות הזכוכית הראשונה על רקמת החדר נקייה.
  5. מהרקמה, להעביר שבבים אחד אחד לתוך הכוס הראשונה עם אצטון להסרת שכבת מגן להתנגד. חכה 2 דקות, תוך כדי התנועה בעדינות את הכוס כמה פעמים כדי להבטיח שהשבבים הם שטופים היטב.
  6. העבר את השבבים ישירות לתוך הכוס עם אתנול, בלי לתת להם להתייבש. חכה 2 דקות. לאחר מכן להעביר את הכוס לשולחן עבודת זרימת האוויר למינרית. קבל רקמת חדר הנקי חדשה.
  7. העבר את השבבים על הרקמות ולתת להם להתייבש במשך כמה דקות. העבר את השבבים לשקופית הזכוכית בצלחת פטרי, לסגור את הצלחת,ולהביא אותו לשואב הפלזמה.
  8. להפקיד את שקופיות זכוכית עם השבבים לתוך שואב הפלזמה. להפעיל תכנית ניקוי 5 דקות כדי להבהיר את פני השטח של הידרופילי קרום סיליקון ניטריד.
    הערה: הגדרות מתאימים הגישו בקשה לשואב הפלזמה שלנו הן: 70 mTorr, זרימת גז של 11.5 SCCM לO 2 ו35.0 SCCM לAr, יעד 50 W תדר רדיו קדימה (RF), טווח RF 5 W ומקסימום. משתקף RF.
  9. שים את שקופיות זכוכית עם השבב בחזרה לצלחת פטרי, ולסגור את המכסה שלו. דואג לשמור על השבבים סטרילי מעתה והלאה.
  10. בדוק את אזורי החלון של השבבים תחת מיקרוסקופ אור לקרעי קרום אפשריים או חלקיקי לכלוך שנותרו.
  11. להביא את צלחת פטרי לשולחן עבודת זרימת האוויר למינרית.
  12. הנח את הפריטים הבאים בשולחן עבודת זרימת האוויר למינרית: צינורות / בקבוקים המכילים מעוקרים 0.01% פולי-L ליזין פתרון (. PLL, mol WT 150,000-300,000, ותרבית תאים נבדקה-מסונן סטרילי), HPLCמים כיתה, הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי, DMEM ללא סרום, רקמת חדר הנקי חדשה, צלחת 24 גם סטרילי (גם צלחת 12 גם יכולה לשמש), סטרילי 96 גם צלחת, טיפים pipet סטרילי, פיפטה, ושטוח, קצה מעוגל, פינצטה.
  13. קח את צלחת 24 גם, ולמלא אחד גם עם PLL, ושתי בארות מים כיתה HPLC, להשתמש כ. נפח של 1 מ"ל לכל טוב. קח את הצלחת 96-היטב ולמלא עבור כל שבב שתי בארות עם סרום בתוספת DMEM ואחד גם עם הסרום ללא DMEM, להשתמש כ. נפח של 200 μl בכל טוב.
  14. מעתה והלאה פינצטה שימוש עם טיפים סטריליים לטפל השבבים. להשיג זאת, למשל, על ידי בוער בקצרה ולאחר מכן צינון הטיפים של פינצטה.
  15. להעביר ראשון שבבים משקופיות הזכוכית על רקמת החדר נקייה.
    מהרקמה, להעביר עד שישה שבבים למלאו-PLL גם, דגירה השבבים במשך 5 דקות.
    לאדואר: לניסוי עם יותר שבבים, למלא בארות נוספות בצלחת 24 גם.
  16. בהמשך לכך יש לשטוף את השבבים על ידי הצבת אותם, אחד על אחד, לתוך באר מלאה המים הראשונים, ומשם למלא מים שני גם. אל תשאירו את השבבים במי זמן רב יותר מאשר כדקה, כדי למנוע ההסרה של PLL.
  17. לבסוף מניח אותם בנפרד לתוך הבארות מילאו-DMEM של צלחת 96-היטב. אחסן את הצלחת 96-היטב בחממת CO 2 עד ההשעיה התא מוכנה.

3. הכנת התאים במייקרו סכמות

  1. בצע תת של תאי COS7 להכין השעיה תא בריכוז של כ. 5 × 10 5 תאים / מיליליטר. ודא תאי פיזור מונו.
  2. קח את צלחת 96-היטב עם השבבים ולהוסיף טיפה אחת של השעיה תא לכל שבב. חכה 5 דקות.
  3. התחל לבחון את אזורי החלון של השבבים עם מיקרוסקופ הפוך לצ'וOSE הרגע הנכון להעברתו לבאר חדשה עם הסרום ללא DMEM.
    הערה: צפיפות טובה של תאים שהושגה עם כ תא אחד לכל 2,500 אזור מיקרומטר 2, מתאימה ל -24 תאי COS7 על גודל חלון 150 x 400 מיקרומטר של. יש צפיפות תא גבוהה יותר את הסיכון ללעכב השטחה מקסימלי של התאים. להיות מודע לכך שלאחר תא יש התיישב על הממברנה SIN, הוא צריך 3-5 דקות כדי לפתח מספיק הידבקות להתנגד צף את במהלך העברה לתוך הבאר החדשה.
  4. העבר את השבב ולבא, כאשר תאים מספיק דבקו אל החלון. שמור את השבבים תמיד עם התאים פונים כלפי מעלה ולהימנע מכל נגיעה של צד זה.
  5. לאחר ההעברה, לבחון כל חלון שבב שוב. אם יותר מדי תאים נשטפו משם ומספר התאים הנותרים אינו מספיק, מחדש triturate ההשעיה התא (כדי לשבור את גושי תאים חדשים שנוצרו) וחזור על השלבים 3.1-3.5.
  6. כאשר כל השבבים הועברו לו מספיקהקפדה על תאי אזורי החלון שלהם, להעביר את השבבים לתוך הבאר שעברה עם הסרום ללא DMEM. מניחים את הצלחת 96-גם בחזרה לתוך חממת CO 2 ולתת התאים להתאושש ולשטח על כמה שעות, O הטוב ביותר / N.

4. EGFR תיוג, קיבוע, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. לשלבים הבאים, השתמש 96-היטב וצלחת 24 גם. טרום למלא בארות עם הפתרונות המתאימים, ולהשתמש בשורה אחת או עמודה לשבבים. הצלחת גם 24- משמשת מתחת למכסת מנוע קטר לצעדי קיבעון עם CB, PFA וGA. תמיד להעביר שבבים עם התאים פונים כלפי מעלה ולהימנע מכל נגיעה של צד זה.
  2. יש לשטוף את שבבים על ידי הצבת השבבים בהיטב עם BSA-GEL-PBS הטרי, ואז למקם את הצלחת 96 גם בחממה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. דגירה עם 300 פתרון EGF ביוטין ננומטר במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס. הכיוון שהתאים יתחילו אנדוציטוזה של EGFRs כותרת EGF, להמשיך מהר ככל האפשר לSTEעמ '4.4.
  4. לשטוף 3 פעמים עם PBS, ופעם 1 עם CB (עכשיו הצלחת גם 96 היא שוב בRT).
  5. דגירה ב 3% PFA במשך 10 דקות.
  6. יש לשטוף את השבבים פעם 1 עם CB, ופי 3 עם PBS.
  7. דגירה בגלאי-PBS למשך 2 דקות, לשטוף 2 פעמים עם הזמן 1 PBS.
  8. דגירה 10 ננומטר בSTR-QD במשך 10 דקות.
  9. יש לשטוף 4 פעמים עם BSA-PBS.
  10. לצלול שבב בצלחת 35 מ"מ זכוכית תחתונה מראש מלא בארגון ה- BSA-PBS ב RT.
  11. לרכוש התערבות ההפרש לעומת תמונות (DIC) ותמונות הקרינה של תאים שכותרתו-QD.
    1. השתמש במטרת אוויר 40X עבור תמונות סקירה של תאים שכותרתו עם QD655. השתמש במטרת טבילת שמן (לדוגמא, 63X) כדי לאפשר הגבייה היעילה ביותר של אור הקרינה הנפלטת; זה נחוץ במיוחד כאשר הדמיה תאים שכותרתו עם QD800.
    2. השתמש בקוביית מסנן שחושפת את QDs לעירור הקרינה אור בין 340 ו 380 ננומטר, ומאפשר איסוף של אור הנפלט מעל 420 ננומטר סוישולחן עבור רוב QDs (קוביית סינון במקרה זה).
    3. למזער את עוצמת האור כדי למנוע אור חזק מדי שעלולה לפגוע במדגם. קבע את זמן חשיפה ללפחות 300 אלפית שני, כך שהאותות של כל QDs נלכדים, וציין כי הקרינה של QDs יש התנהגות מהבהבת.
    4. התאם את עוצמת האור, וההגברה לספק תמונות בהירות ללא רעש תמונה גלוי, תוך מזעור עוצמת האור.
      הערה: לחלופין, זמן חשיפה קצר יותר יכול לשמש אם סדרת תמונה נלקחות מאותו האזור. סדרות אלה יכולים להיות מעובד להניב תמונת הקרנה המרבית, שמוביל להפחתת רעש מיצוע ובכך של התמונה המתקבלת.
  12. מניחים את השבב צילם בחזרה (תאים פונים כלפי מעלה) לתוך באר של צלחת 96-היטב מלאים בארגון ה- BSA-PBS.
  13. יש לשטוף את שבבים 1 פעמים בCB.
  14. דגירה ב 2% GA במשך 10 דקות.
  15. יש לשטוף פעם 1 בCB, ופי 3 עם BSA-PBS.
  16. שבבים חנות עד שESEMmaging, בBSA-PBS מלא מראש בארות של צלחת 96-גם חדשה. לכל שבב למלא שורה של ארבע בארות במי HPLC כיתה.
    הערה: אפשר לשמור הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות, לעומת זאת, התוצאות הטובות ביותר מושגות כאשר סדרת הדמיה המלאה מתבצעת בתוך יומיים. QDs יתחיל לאט להתנתק מהמדגם, לכן לא מומלץ להמתין יותר מ -10 ימים לפני ההדמיה ESEM נעשה.
    הערה: תמונות פלואורסצנטי מאוחסנות לניתוח בעתיד. עמדותיהם של התאים בתמונות יכולות בקלות להיות מתואמות עם תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות איתור הפינות של חלון החטא ומדידת העמדות ביחס לפינות.
    הערה: מומלץ להדפיס תמונות באיכות גבוהה הקרינה ולהשתמש בם למטרות התמצאות בעת הקלטת תמונות ESEM.

5. הרטוב ESEM-גזע של תאים שלמים

  1. הכן את ESEM לגזע רטוב
    1. הר ד האלקטרונים המשני הגזיםetector (GSED), ושלב פלטייה, המכיל גלאי גזע (הממוקם מתחת לדוגמא).
    2. התחל את זרימת קירור מים דרך הבמה, ולהגדיר את הטמפרטורה עד 3 מעלות צלזיוס.
    3. הגדר את XY שלב הקואורדינטות לאפס, ולהתאים את מרחק העבודה לכ 6 מ"מ.
  2. במהלך ההדמיה ESEM, לשמור על צלחת 96-היטב עם השבבים מגניבים, למשל באלמנטי קירור קפוא, בקופסא קלקר.
  3. לטעינת מדגם לשלב ESEM גזע precooled, לקחת את צלחת 96-היטב מיכל הקירור ולמקם אותו בסמוך לבמת ESEM נפתחה. שים רקמת חדר הנקי חדשה לצד זה.
  4. מהירות לשטוף שבב (עם התאים פונים כלפי מעלה) על ידי טבילתו ארבע פעמים, בכל פעם למשך כשני, למלא היטב עם מים HPLC כיתה.
  5. למחוק את הישבן של השבב בקצרה על רקמת החדר נקייה ומניח את השבב לשלב precooled. ודא כי התאים נשארים רטובים, זה יכול להיותמוכר על ידי משטח מחזיר (ייבוש תוצאות בשטח משעמם).
  6. להרטיב את פני השטח המדגם עם 3 μl מים HPLC כיתה מקוררת (לוודא שלא לגעת במשטח עם קצה pipet), ולתקן את המדגם בשלב.
  7. הנח שלוש טיפות מים 3 μl נוספות על הבמה הקרובה למדגם.
  8. סגור את תא הדגימה
  9. לטהר את תא הדגימה ידי רכיבה על אופניים בלחץ חמש פעמים בין 800 ל -1,500 אבא. די לרכיבה על אופניים עם 800 אבא.
  10. לעבור אלומת האלקטרונים (30 ק) ובלבחון את הדגימה תחת הגדלה הנמוכה ביותר בשני גלאים, כלומר, GSED, וגלאי גזע כדי לחפש את המיקום של חלון השבב האלקטרוני.
    הערה: אם שכבת המים עבה מדי, החלון לא יכול להיות גלוי. במקרה זה, להתחיל להוריד את הלחץ לאבא 760 ולחכות כמה דקות. החלון הופך לגלוי עם GSED הראשון.
  11. מקם את חלון קרום החטא במרכז התמונה על ידי הזזת SPECIMen הבמה ולהפחית את הלחץ לאבא 750-720.
    הערה: כאשר שכבת המים דקה מספיק, החלון גם הופך לגלוי עם גלאי גזע.
  12. מעתה והלאה ישתמשו בקטע השדה הכהה של גלאי גזע להקליט תמונות. ראשית, לרכוש אחד או שתי תמונות המציגות את כל התאים באזור החלון המלא.
  13. השוואה בין תמונות ESEM אלה עם תמונות מיקרוסקופ אור, לאתר את הפינות של חלון החטא.
  14. לתאם לתאם מסגרות של שתי שיטות מיקרוסקופיה ידי השוואת הגדלה, סיבוב, והשיקוף אפשרי. אתר את אותם תאים בשני התמונות.
  15. בחר חלקיקי לכלוך קטנים מאוד או אזור תא עם תכונות קטנות כדי להתאים את הגדרות הדמיה, כגון גובה eucentric, להתמקד בסדר והתיקון של stigmatism עדשה. עבודה בהגדלה של לפחות 50.000X, להשתמש נוכחית בדיקה אלקטרון סביב 0.6 NA, זמן פיקסל להתעכב של 30 מייקרו-שני, וגודל תמונה של 1024 x 884 פיקסלים.
    הערה: הגדרות אחרות עשויות גם bהדואר משמש כל עוד גידול של מינון האלקטרון הוא נמנע.
    הערה: גם כאשר עובדים מאוד נקי, משטחי השבב בפועל תמיד מכילים כמה חלקיקי לכלוך, כי הפרוטוקול אינו מבוצע בסביבת חדר נקייה.
  16. כדי להקליט תמונות גזע מהתאים שכותרת QD, עיין בתמונות הקרינה ולבחור תא של עניין.
    הערה: עדיף להתחיל עם תא מראה אותות QD חזקים.
  17. להקליט תמונת סקירת גזע של תא זה.
  18. עבור לאזור פריפריה שבי גבול התא גלוי ולהגדיל להגיע הגדלת 50.000X.
  19. תמונות מראים שיא QDs הבודד, להשתמש פעמים להתעכב פיקסל של 20-30 μsec. על מנת להימנע מניזקי קרינה, תמונה כל אזור רק פעם אחת עם הגדלה גבוהה.
    הערה: בדרך כלל, בשלב זה הן, המיקוד והתיקון של stigmatism, צריך קצת כוונון עדין.
  20. לאחר ההקלטה של ​​מספר מספיק של תמונות בהגדלה גבוהה, זום-אאוט, וACמקהלה אחרת תמונת סקירת גזע, המתאר את האזורים רק נרשמו עם הגדלה גבוהה כמלבנים כהים.
    הערה: תמונות סקירה אלה מאוחר יותר ישמשו כדי לתאם תמונות ESEM וקרינה וכדי לקבוע את המיקום המדויק של תמונות בהגדלה הגבוהה בהקשר הסלולרי.
  21. המשך לתא הבא של עניין, תתחיל עם תמונת סקירה, להקליט סדרה של תמונות בהגדלה גבוהה, ומסתיים בתמונת סקירה.
  22. בסוף פגישת הדמיה ESEM, להגביר את הלחץ לאבא 850-900 לפני שמתחיל לפרוק את החדר.
    הערה: גידול זה של לחץ משפר את הסיכוי של מחלים השבב האלקטרוני עם משטח עדיין רטוב; עם זאת, זה לא תמיד יכול להיות מושגת. מדגם שמעולם לא התייבש ניתן לשחזר בBSA-PBS ו, אם תרצה בכך, ובדק בESEM בשלב מאוחר יותר בזמן.

תוצאות

איור 1 ו -2 להראות תמונות של נציג QD655 EGFR שכותרתו, קרום הנכנס דמיינו ב, COS-7 התייבשות מלאה תאים שלמים. תמונת DIC באיור 1 נותנת רושם של הטופוגרפיה הקרום של התאים, ותמונת הקרינה המקבילה באיור 1b מתארת ​​את חלוקת EGFR לאחר 3 דקות של הדגירה. איור 1 א EGF-ביוטין ו- B כל מאוחה משני תמונות שתועדו במטרת אוויר 40X. EGFR מופעל EGF מופץ על פני כל הסלולרי. ברוב תאי שיפור קל של הקרינה (איור 1) ניתן לראות בקצות התא, המצביע על שכיחות מוגברת באופן מקומי של EGFR 20. ניסויים שנערכו בקרה באמצעות פרוטוקול דומה מאומתים תיוג EGFR ספציפי (מידע לא מוצג). בקרות אלה כללו: 1) תיוג שליטה ללא דגירה קודמת של ceLLS עם EGF ביוטין, כלומר, דגירה רק עם STR-QDs, ו -2) דגירה עם EGF שאינה biotinylated וSTR-QDs.

שלושה התאים מסומנים במלבנים נחקרו נוסף עם ESEM-גזע. תמונות ESEM הגזע מתוארות בתרשים 1C - E להראות סקירות הגדלה נמוכות של תאים אלה. תמונות אלה משקפים שידור תאים שלמים במדינת התייבשות בשכבה דקה של מים המתגוררים מעל לתא ממוקם על שבב סיליקון עם סיליקון ניטריד חלון (חטא) צפייה. תא הוואקום באדי המים מיקרוסקופ הכיל, והאיזון בין טמפרטורה ולחץ מדגם הותאם כדי לשמור על שכבה דקה של נוזל על פני התאים. יכולים להיות מוכרים התאים הבודדים בקלות על חשבון צורתם והמיקום על חלון קרום החטא. תמונות ESEM הגזע נמוכה ההגדלה לחשוף מבנים עדינים, כגון filopodia, המשתרעות מקצה התא לתאים שכנים, וכמה מבניםבתוך אזורי התא דקים יותר. אזורים סלולריים מרכזיים עבים כוללים הגרעין מופיעים לבנים כי שידור דרך המדגם לא ניתן לאלקטרונים של האנרגיה המשמשת (30 אנרגיה של keV).

תמונות ESEM גזע ברזולוציה גבוהה נרשמו באזורים דקים יותר, ההיקפיים. הרזולוציה מרחבית לESEM-גזע של חלקיקים באזורים הדקים של תאים בשכבת נוזל דקה נקבעה במחקר קודם 6 להסתכם 3 ננומטר. ארבע תמונות ברזולוציה גבוהה המוצגות באיור 2 א - ד נרשמו במיקומים של המלבנים הקטנים באיור 1 ג - א משמש הגדלה הייתה מספיק כדי להבחין QDs הבודד, המופיע מוטות בהירות כ, בצורת כדור, כל אחד מחויב ליחיד EGFR. יש QD655 ממדים אופייניים של 6 x 14 ננומטר 2.

איור 2 א (המקביל לאזור המלבני הצביע על התא בFiguמחדש 1C) מראה תוויות QD על קרום לקפל באלכסון חוצות את התמונה. יש מבנה קרום זה צפיפות EGFR גבוהה מאזורי הקרום שמסביב. בכמה מקומות, שתי תוויות היו בקרבת מקום. שתי דוגמאות עם מרחקים של 20 ו -24 ננומטר מצוינים עם ראשי חץ. זוגות אלה של תוויות מתפרשים כשייכים להדימרים EGFR. איור 2 נותן דוגמא מקצה תא (איור 1D, מלבן משמאל), ניתן לראות מונומרים EGFR והדימרים גם כן. איור 2C (איור 1 ג, מלבן מימין) נרשם באזור עם אות נמוכה הקרינה, כלומר, צפיפות נמוכה EGFR. עם זאת, EGFR נמצא גם כאן בהדימרים גם כן. בנוסף, שני אשכולות של 10 או 11 EGFRs נכחו (ראה אליפסות). איור 2 ד מציג דוגמא נוספת לקיפול קרום (איור 1E) עם אשכולות קטנים יותר, כולל 5-6 EGFRs, בנוסף לכמה מונומריםוהדימרים.

כדוגמא לסוג של מידע שניתן להשיג מהנתונים אלה, גרם פונקצית 21 מתאם זוג (x) נקבע לכל עמדות התווית באיור 2. שימו לב שניתוח זה אינו חלק מפרוטוקול זה וההליך שתואר במקום אחר 6,7. g (x) הוא מדד של הסיכוי של חלקיק להימצא בתוך x מרחק רדיאלי מסוים מחלקיקי התייחסות. g (x) = 1 מייצג הפצה אקראית, וערך גדול יותר הוא ראיות לאשכולות. העמדות של כולל של 210 תוויות היו מזוהות באופן אוטומטי בארבע תמונות של איור 2 א-ד, ו-ז '(x) חושב באמצעות סל גודל של 5 ננומטר ומסנן החלקה עם רוחב פס של 10 ננומטר. עקומת g (x) (איור 3) מראה מרחק QD מועדף מרכז למרכז של 25 ננומטר. EGFRs בכך לא באופן אקראי בכיוון אבל חלק ניכר מהם מתגורר במרחק מועדף זה. מapproximatמודל מולקולרי דואר 6 (איור הבלעה 3) אנו מעריכים כי מרחק מרכז למרכז בין הכיס מחייב EGF QD ומסתכם ~ מרחק 14 ננומטר, ומרכז למרכז בין שני QDs מחובר לדימר EGFR ל להיות ~ 27 ננומטר (ערך זה עשוי להשתנות לפי ננומטרים ספורים בשל הגמישות של מקשר). מרחק התווית המועדפת הוא בקנה אחד עם כך שמרחק התווית הצפוי לדימר EGFR בתוך הדיוק של השיטה. ז העקומה (x) היא גדולה יותר מאשר אחדות למרחק של עד 300 ננומטר, המעידה על הנוכחות של אשכולות, עולה בקנה אחד עם הנתונים. ניתוח זה מראה כי ההרכב של EGFR ניתן ללמוד עם השיטה שלנו.

איור 4 מראה תוצאה דומה כמו איור 2, פרט לכך שהתיוג בוצע עם EGF-QD800, ומטרת טבילת 63X שמן שימשה לתמונת הקרינה. הנתונים אלה מאשרים כי תוצאות טיפוסיות אלה נמצאים גם כאשרתיוג EGFR נעשה עם QDs, אשר פולט בספקטרום האדום ליד. איור 4 א הוא תמונת הקרינה של תא נציג, איור 4 מציגה את אותו התא במצב סקירת ESEM גזע ואיור 4C הוא תמונה בהגדלת 150,000 x, נרשמה בגבול העליון של קרום התא (ראה מלבן באיור 4). בדומה לאיור 2 א ו- D, התמונות ללכוד EGFR כותרת QD על פי קרום ומראה קולטנים monomeric, dimeric, והתקבצו. שים לב שליבת QD הצפוף האלקטרון מופיעה מעט קטן יותר ועגולה יותר הליבות של QDs פולטות ב655 ננומטר, עולה בקנה אחד עם הגודל שלהם קטן יותר הליבה של 22 ~ 5 ננומטר.

figure-results-1
איור 1. המתאם דסק"ש, הקרינה וESEM-גזע של EGF-QD655 כותרת EGFR על COS-7 התייבשות מלאה תאים Rong>. תמונה () דסק"ש של התאים שגודל באזור חלון קרום החטא, נותנים רושם טופוגרפי של קרום הפלזמה. תמונת פלואורסצנטי (B) מראה תאים בחלון קרום SiN במיקום המרכזי (מסומנת במלבן המקווקו). (C - E) שלוש תמונות בהגדלה נמוכה ESEM-גזע מהתאים המסומנים במלבנים בA ו- B. תמונות סקירת תא אלו משמשות כדי לקבוע את המיקום המדויק של תמונות ברזולוציה גבוהה שנרשמו לאחר מכן. המיקום של ארבע תמונות ברזולוציה גבוהה (שמוצגים באיור 2 א-ד) מסומנים במלבנים לבנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
2. תמונות ESEM גזע ברזולוציה גבוהה איור המתארים EGFRs קרום מחויב. מיקרוסקופ () בהגדלה 75,000X של האזור המסומן באיור 1. מונומרים רבים גלויים. כמה הדימרים מצוינים עם ראשי החץ. (ב) ותמונות (ג) שנרכשו בהגדלה 50,000X של השמאל, אזורי בהתאמה הנכונים, קרום מסומן בתרשים 1C. אשכולות של EGFRs מפורטים. תמונה (ד) נרשמה עם הגדלה 50,000X במיקום המסומן באיור 1D. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3. g פונקצית מתאם הזוג (x) כפונקציה של המרחק הרדיאלי x נקבע לבין-Parti מרחקי CLE של כל 210 התוויות זוהו באיור 2 א-ד. השיא של 25 ננומטר מצביע על כך שיש מרחק QD מרכז למרכז סיכוי הרבה יותר גבוה של המתרחש מ אקראי, לפי AG (x) = 1 מציינת סיכוי אקראי. הקו המקווקו הוא מדריך לז העין מייצגת (x) של הפצה אקראית. הבלעה מציגה מודל מולקולרי משוער של דימר EGFR עם EGF הכפות וQDs streptavidin המצופה המחובר באמצעות ביוטין. המודלים של streptavidin, EGF וEGFR התקבלו ממודלים של CPK 1stp (streptavidin), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO ו2GS6 (EGFR) מבנים בחלבון חלבון RCSB מאגר, שנוצר על ידי Jmol גרסה 12.2.15. מודל ביוטין הוא כפי שצייר בRCSB יגנד Explorer גרסת 1.0. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/53186/53186fig4.jpg "/>
איור 4. תא מופת COS-7 שכותרתו עם EGF-QD800 וצלם עם הקרינה גומלת וESEM-גזע. (א) תמונת הקרינה, (ב) תמונת ESEM גזע סקירת הגדלה נמוכה. תמונה ברזולוציה גבוהה שנרשמה במיקום של המלבן בב ב150,000X הגדלה (C). EGFRs monomeric, dimeric, והתקבץ מזוהים דומה לתיוג עם EGF-QD655. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

לומד את הפריסה המרחבית והרכב של החלבונים בממברנה, כגון EGFR, בכל תאים מספק מידע חשוב על הקשר תפקודו ושינויים האפשריים 11-14. זה מאתגר ללמוד ההפצה של מונומרים, הדימרים, ואשכולות ישירות על רמת subcellular באמצעות שיטות ביוכימיות נפוצות, שמידע הולך לאיבוד על הלוקליזציה של החלבון בתא או הבדלים בין תאי 15. שיטות התיוג ומיקרוסקופיה המתוארות כאן מאפשרות ההדמיה של קומפלקסי חלבונים בקנה מידת אורך של ננומטרים ספורים, כך שstoichiometry ניתן ללמוד בהקשר של תאים בודדים, שלמים 4-7. זה לא אפשרי עם (רזולוציה סופר) מיקרוסקופ אור 23 כי החלטתה אינה מספיקה כדי להבחין מולקולות העוסקות בחלבון מורכב. העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג) היא טכניקת מיצוע הרכב 24, ולא בהכרח לזהות את הדימרים ואשכולות מסדר גבוהים יותר כתוצאה מהטווח הקצר של העברת אנרגיית 25. מבחני קשירת קרבה 26 לא באמת למדוד מרחקים ולכן אינם מסוגל להבחין בין אזור סלולארי עם צפיפות גבוהה של חלבון, באופן בלתי נמנע מוביל למספר קרבה זוהתה במקרה אקראי, מאזור סלולארי עם צפיפות חלבון דומה אבל מכילים חלבון מתחמים מציגים מרחקים שונים בין התוויות. הרזולוציה הגבוהה הנדרשת כדי להמחיש את המרכיבים של קומפלקסי חלבונים מושגת על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM). עם זאת, TEM הקונבנציונלי של כל תאים מוגבלים על ידי הדרישה של דגימות / חלקים דקים חותכים את קרום הפלזמה 27, או קריעת קרום פלזמה או ניתוק 28,29 וכתוצאה מכך נוצרו באופן אקראי חתיכות קטנות של קרום. קרום הפלזמה ובכך לא הוא צילם בכללותו, שהוביל לחוסרמידע הקשר סלולארי של אולי מכריע.

אתגרים ניסיוניים אחרים ללימוד stoichiometry חלבון בתאים נובעים מתיוג החלבון שימושי. בדרך כלל immunolabeling משמש נושא את הקושי שstoichiometry אחד-על-אחד בין קולט ותווית יכול להיות מושגת רק עם בדיקה חד ערכי; זה לא המקרה כאשר נוגדנים ראשוניים ומשניים נדרשים. כדי לקבל מידע על stoichiometry החלבון, נדרש כי בדיקה נקשר באופן ייחודי לאפיטופ אחד על קולט ויש אתר קישור אחד לבדיקת ניאון או ננו-חלקיקי מספר אטומיים גבוהים בצד השני. שנית, דיוק השגה עם נוגדן תיוג מוגבל על חשבון הגודל הגדול שלהם 30-30 ננומטר, כך שאפליה בין חלבונים השכנים יחידים, homodimers, או אשכולות גדולים היא לא ריאלי, לפחות לא לקולטנים של משפחת EGFR. תוויות ספציפיות הרבה יותר קטנות ידועות בספרות ובCAn להיות מיושם גם לתיוג תאיים 31 אבל אלה אינם נפוצים. אורכו של כל התווית (EGF ביוטין-streptavidin-QD) הוא מממד דומה כמו EGFR, וקטן מספיק כדי להיות מסוגל לזהות את דימר. יתר על כן, הליך תיוג שני שלבים המתוארים ימנע אשכולות קולט תיוג מושרה.

השיטה שלנו היא לא מאוד קשה, לא הרבה יותר ממיקרוסקופ פלואורסצנטי של חלבונים שכותרתו. עם זאת, ניסוי צריכה להתבצע בזהירות רבה, שכן את מספר הצעדים מוסיף ושגיאה באחד מהשלבים עלולה להוביל לכישלון מוחלט בניסוי. טיפול השבבים הוא לא יותר מאשר מייגע הטיפול ברשתות TEM אבל כמה שבבים ריקים אימון מומלץ. ESEM-גזע של תאי התייבשות כל הוא כנראה ההיבט הקשה ביותר, ודורש לפחות מפעיל מיומן וכמה ימים של תרגול כדי להגיע להחלטה סביב 3 ננומטר לפי צורך כדי להמחיש את QDs. סכר קרינהגיל של הדגימה תחת החקירה מציג סיכון. הלחץ והטמפרטורה צריכים להיות במעקב בזהירות כדי לשמור על שכבת מים. יתר על כן, עובי שכבת המים עשוי להשתנות בין תאים. מומלץ לעקוב אחר הנוכחות של שכבת המים באמצעות גלאי אלקטרונים גזים מעל הדגימה, כפי שתואר במקום אחר 6. אזורים סלולריים רק צריכים להיות צילמו פעם או פעמיים, כדי למנוע נזק.

מגבלה העיקרית של השיטה היא שהמידע ברזולוציה גבוהה על ultrastructure נעדר. טכניקות אחרות, למשל, TEM cryo, יש צורך ללמוד את מבנה החלבון, וultrastructure הסלולרי 15. שנית, לומדים את יחסי הגומלין הדינמיים של מספר רב של חלבונים בתא חי במיקרוסקופ הזמן לשגות הוא לא ריאלי על חשבון נזקי קרינה, ודורש מדינה של האמנות מיקרוסקופ אור 23. נכון לעכשיו, השיטה שלנו היא לא מסוגלת לקבוע את הרמה המוחלטת של הדימרים מאז lיעילות abeling אינה ידועה, אך אנו מצפים להוסיף נתונים כאלה בעתיד. זה בכל זאת אפשרי לדעת אם הדימרים נמצאים או לא. מהספרות ידועה זה, שגם יעילות תיוג כ -15% היא מספיק כדי לזהות הדימרים עם מובהקות סטטיסטיות מספקות 32.

אפשר בקלות ללמוד קולטני קרום הנכנס אחרים באמצעות יגנד, באמצעות שברי Fab biotinylated של נוגדנים ספציפיים, או באמצעות linkers הקטן האחר 7 באמצעות פרוטוקול תיוג שני שלבים שתואר. מאז יש לנו כבר הוכחנו ששני צבעים שונים (גדלים) של QDs יכולים לשמש, ותיוג ננו-חלקיקי הזהב שימש בעבודה לפני 6, נראה ריאלי לתייג מיני חלבון מרובים באותו הניסוי. האתגר המרכזי לחקר ההרכב של מיני חלבון מרובים הוא להבטיח יעילות תיוג דומה בשני המינים או לפחות נורמליזציה של stoichiometry היחסי שהושג בכבודive יעילות תיוג. עם זאת, לא נראה שני QDs שונה ששמש במחקר זה לשונה בהרבה ביעילות תיוג (ראה איורים 2 ו -4). השיטה המתוארת מעורבת תיוג שני שלבים עם QDs, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הגומל וESEM גזע מציגה שיטת קיימא ללמוד את יחסי הגומלין המורכבים של חלבוני קרום בקרום הפלזמה שלם של כל תאים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים ל-E. Arzt על תמיכתו באמצעות INM, M. Koch על העזרה ב-ESEM, ו-DENS Solutions על אספקת השבבים. המחקר נתמך בחלקו על ידי תחרות לייבניץ 2013.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךLeicaAF6000 + DMI6000B
ESEMFEI CompanyQuanta 400 FEG
DMEM (1x) + GlutaMax + גלוקוז + פירובטGibco31966-021
DPBS (1x) - סידן כלורי - מגנזיום כלורידGibco14190-144
סרום בקר עוברי, Performance Plus (FBS)Gibco16000-036
CellstripperMediatech, Inc.25-056 Cl
מים, chromasolv Plus עבור HPLCSigma-Aldrich34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBSCarl Roth1058.1
אתנול, רוטיזולב HPLC כיתהקארל רוטP076.2
אלבומין Fraction V, ללא ביוטין (BSA)Carl RothO163.2
ג'לטין, מעור דגי מים קריםSigma-AldrichG7041-500G
גליציןקארל רוטT873.1
גורם גדילה אפידרמליבדיקות מולקולריותE3477ביוטין-XX מצומד (ביוטין EGF)
נתרן טרבוראט דקהידראטסיגמא-אולדריץ'S9640-500G
חומצה בוריתסיגמא-אולדריץ'B6768-500G
Qdot 655 סטרפטווידיןמצומד בדיקות מולקולריות
מולקולריותמצומדות Q10121MP Qdot 800 סטרפטווידיןQ10173MP
שבבי סיליקון עם ממברנות סיליקון ניטריד בעובי 50 ננומטר ומידות של 50 מיקרו; פתרונות DENS m x 0.40 מ"מבהתאמה
בדיקות אישית

מקורות

  1. Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid. ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).
  2. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).
  3. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).
  4. Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
  5. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).
  6. Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy. Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).
  7. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy. Science Advances. under revision, (2015).
  8. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).
  9. Herbst, R. S. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).
  10. Normanno, N., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366, 2-16 (2006).
  11. Hofman, E. G., et al. EGF induces coalescence of different lipid rafts. J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).
  12. Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib. J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).
  13. Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).
  14. Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding. FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).
  15. Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).
  16. Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).
  17. Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).
  18. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
  19. Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase. Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).
  20. Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464, 783-787 (2010).
  21. Stoyan, D., Stoyan, H. Estimating pair correlation functions of planar cluster processes. Biom. J. 38, 259-271 (1996).
  22. Gao, J., et al. In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots. Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).
  23. Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).
  24. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).
  25. Warren, C. M., Landgraf, R. Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control. Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).
  26. Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).
  27. Hoenger, A., McIntosh, J. R. Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).
  28. Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy. Micron. 37, 14-34 (2006).
  29. Pinto da Silva, P., Kan, F. W. Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces. J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).
  30. Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments. Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).
  31. Orlov, I., et al. Live cell immunogold labelling of RNA polymerase. II. Sci. Rep. 5, 8324(2015).
  32. Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy. Front. Immunol. 4, 427(2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EGFRCOS7

מאמרים קשורים