כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Summary

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

Abstract

קוצים הדנדריטים הם בליטות קטנות שמתאימות לתאי פוסט-סינפטי של סינפסות מעוררות במערכת העצבים המרכזית. הם מופצים יחד דנדריטים. המורפולוגיה שלהם תלויה במידה רבה בפעילות עצבית, והם דינמיים. קוצים הדנדריטים לבטא קולטנים glutamatergic (קולטני AMPA וNMDA) על פני השטח שלהם וברמות של צפיפות פוסט-סינפטי. כל עמוד השדרה מאפשרת נוירון כדי לשלוט בפעילות מקומית ואת מדינתו באופן עצמאי. מורפולוגיות עמוד השדרה נחקרו רבות בתאים פירמידליים glutamatergic של קליפת המוח, באמצעות שני גישות in vivo ותרבויות עצביות המתקבלות מרקמות מכרסמים. יכולים להיות קשורים לתנאי נוירו אינדוקציה עמוד השדרה שינו והתבגרות, כפי שמוצגים בנוירונים בתרבית מכרסמים וניתוח כמותי חד-ממדי ^1. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לניתוח כמותי של מורפולוגיות עמוד השדרה 3D באמצעות cortic אדםנוירונים אל שמקורם בתאי גזע עצביים (אבות קליפת המוח מאוחר). תאים אלה בתחילה התקבלו מתאי גזע pluripotent מושרה. פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של מורפולוגיות עמוד השדרה בתקופות תרבות שונות, ועם השוואה אפשרית בין תאי גזע pluripotent מושרה מתקבלים מאנשים שליטה עם אלה המתקבלים מחולים במחלות פסיכיאטריות.

Introduction

קוצים הדנדריטים של תאי עצב בקליפת המוח הם פירמידה בליטות קטנות ודקים אשר מופצות לאורך הדנדריטים הבסיסיים ופסגה של תת העצבי אלה במכרסמים, קופים, ומוח אנושי. הם האתרים של רוב סינפסות מעוררות ולהציג פונקציות מרכזיות בלמידה ובתהליכים קוגניטיביים. המבנים מפורטים של קוצים הדנדריטים אדם נחקרו מבחינה טכנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים ^2. עם זאת, גישה כזו היא זמן רב ומייצגת עומס עבודה כבדה. לאחרונה, שחזור תלת ממדים (3D) במורפולוגיה של קוצים הדנדריטים דווח בקליפת המוח אנושית באמצעות תוכנה ספציפית בשילוב לניתוח בעמוד השדרה במדריך גדול ^3.

טכנולוגיה ירוקה חלבון פלואורסצנטי (GFP) מצמידים את immunofluorescence מייצגת כלי מדויק לזיהוי עמוד השדרה ומדידת צורה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישה זו יכולה להיות מיושמת בקלות לנוירונים בתרבית. האוVer, אין נתונים דווחו על הניתוח של התבגרות עמוד השדרה ומורפולוגיה על נוירונים אנושיים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC).

מטרת המחקר הייתה לתאר את פרוטוקול, המאפשר הדמיה בעמוד השדרה הדנדריטים מתאי עצב אנושיים בתרבית במבחנה. תיוג GFP, מיקרוסקופיה confocal וניתוח 3D עם מודול נימת Tracer של תוכנת Imaris שמשו בפרוטוקול הנוכחי. צעדי תרבות שנחוצים כדי להשיג תאי עצב בקליפת המוח glutamatergic של שכבות השניה לIV מתאי גזע עצביים (המל"ל) הם גם תאר בקצרה כאן. הפרוטוקול כולו לייצור המל"ל אדם כבר פורסם במקום אחר ^4.

Protocol

1. עצבי תרבות

הערה: תכנות מחדש פיברובלסטים בתאי גזע pluripotent, מחויבת לשושלת telencephalon הגב, גזירה, הגברה, ובנקאות של אבות קליפת המוח מאוחר (LCP) תוארה באל Boissart et ^4. בידול עצבי של תאים כמו LCP-גם ביצע על פי אל Boissart et ⁴ עם שינויים קלים. נהלים אחרים פותחו עבור תכנות מחדש ישיר של fibroblasts לתאי גזע pluripotent המושרה ואחריו הבידול שלהם לתאי עצב. פרוטוקול זה נשמר שכן הוא מאפשר ייצור סלקטיבית של תאי עצב glutamatergic פירמידה.

1. פנק את תרבות צלחות 6-גם עם coverslips זכוכית עם פולי-ornithine (בדילול ל1/6 בDPBS, ריכוז המניה 0.01%) O / N, ואחריו שלושה שוטף בDPBS. לאחר מכן להוסיף laminin (ריכוז מניות 1 מ"ג / מיליליטר, בדילול 500 פעמים בDPBS) לפחות 10 שעות תחת מכסה המנוע הזרימה .
2. צלחת ולשגר המל"ל בצפיפות נמוכה (50,000 תאים / ² סנטימטר) בתרבות צלחות 6-גם עם coverslips זכוכית ב 3 מיליליטר של מדיום התרבות המורכב DMEM / F12 (500 מיליליטר), 2 בקבוקונים (5 מיליליטר כל אחת) של תוספת N2, 2 בקבוקונים (10 מיליליטר כל אחד) של תוסף B27, 10 מיליליטר של העט, סטרפטומיצין (פניצילין = 10,000 יחידות / מיליליטר וסטרפטומיצין = 10,000 יחידות / מיליליטר), 1 מיליליטר של 2-mercaptoethanol (פתרון במלאי: 50 מ"מ) וlaminin (1 / 500), ללא גורמי גדילה. שלב קריטי: לבצע את הצעד הזה בזהירות על ידי הוספת תאים עם תנועות סיבוב איטיות על מנת לצמצם אשכולות תא.
3. הסר את מדיום התרבות. הוסף בינוני N2B27 טרי המכיל 2 מיקרוגרם / מיליליטר של פתרון laminin הטרי כדי לשמור על תא העצב מצורף על coverslips הזכוכית ולהימנע clumping. לשנות הבינוני כל 3 ימים. שמור חלק מבינוני שנותר (200 μl) לפני הוספה בינונית טרי כדי למנוע את התא מהתייבשות. לחלופין, להמשיך במהירות ולשנות את הנפח הכולל (3 מיליליטר).

e_title "> 2. lentiviral התמרה

הערה: וקטורי lentiviral GFP נמסרו באדיבות על ידי ד"ר Uwe Maskos מעבדה במכון פסטר (פריז) והוכנו על פי הפרוטוקול שפורסם ^5. הביטוי של GFP הוא מונע על ידי האמרגן קינאז phosphoglycerate העכבר (PGK). במחקר זה, כייל נגיף היה של 400 ng / μl (פתרון מניות בPBS 1x).

1. Transduce נוירונים נגזר iPSC אדם בכל צעד של התבגרות על ידי חלקיקים נגיפיים על ידי הוספת 1 μl של פתרון המניות המכיל 40 ng של וקטור GFP lentiviral לתרבות ו( 6-גם צלחות) ודגירה של 48 שעות במדיום תרבות טרי. הערה: פרוטוקול זה, משך הדגירה מאפשר תיוג טוב של מבני עמוד השדרה.

3. Immunofluorescence

הערה: על מנת לשפר את התיוג של כל מורפולוגיה עמוד השדרה, תיוג immunofluorescence בוצע באמצעות נוגדן אנטי GFP בתנאי permeabilized.

1. הסר בינוני תרבות ולתקן את תאי transduced על coverslips paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב1x PBS (10 דקות כל אחד).
2. coverslips טובלים בPBS בתוספת 0.05% טריטון (100x) ו -10% בסרום סוס עבור שעה 1 ב RT, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב1x PBS.
3. להוסיף של 1x PBS 100 μl בתוספת 4% בסרום סוס ונוגדן ראשוני (1/1000) שהועלה נגד GFP ומדולל בפקטור של 1000 על כל coverslip. דגירה בO תיבה כהה / N ב 4 ° C, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם 1X PBS.
4. לדלל נוגדן אלקסה פלואוריד 488-מצומדת (1/200) בPBS בתוספת 0.5% מTween 20 ו דגירה עבור שעה 1 ב RT. לאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב1x PBS והר coverslips על שקופיות זכוכית עם ההרכבה בינונית למיקרוסקופ פלואורסצנטי.

4. דנדריטים השדרה הדמיה

1. לבצע הדמיה confocal דרך מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal.
2. בחר נוירונים בריאים עם מורפולוגיה פירמידהND arborization הדנדריטים מלא, ולכמת לפחות 10 נוירונים לכל מצב מניסויים נפרדים. לכמת 60-100 מיקרומטר לדנדריט.
3. לרכוש תמונות באמצעות שמן 40X NA = 1.3 אובייקטיביים וקו לייזר 488 ננומטר לעירור GFP, עם שיא כוח טיפוסי במדגם רמה סביב 20 μW. גודל פיקסל הגדר סביב 80 ננומטר לטעום כראוי קוצים הדנדריטים.
   הערה: שיחת הניתוח שלאחר מכן לתמונה שברעש אינו מתפשר הפילוח הנכון של דנדריטים וקוצים. עם הגדרות דגימה והכוח במרחב שהוזכרו לעיל, שצפינו כי פיקסל להתעכב זמן של 3.15 מייקרו-שני הוא מספיק כדי לאסוף מספיק פוטונים לבנות תמונה כזו. עבור דגימות עמומות, ניתן לשפר את איכות תמונה על ידי חישוב ממוצע 2 עד 4 סריקות. ייתכן שתהיה צורך הרכישה של כמה אריחי XY כדי לכסות את האזור של עניין, אשר לאחר מכן יש מאוחה לפני העיבוד.
4. כדי לטעום את כל נוירון הנפח, לרכוש Z-ערימה, עםZ ריווח החל 150 ננומטר ל -300 ננומטר, מניב 20 עד 30 פרוסות Z.
   הערה: הרזולוציה מרחבית הרוחב הושגה עם הגדרות אלה היא 234 ננומטר והרזולוציה הצירית היא 591 ננומטר. הדגימה שנבחרה כאן היא נאותה, אלא כהחלטה הצירית היא גדולה יותר מהגודל הקטן ביותר של עמוד השדרה להיות צילם, הניתוח מעדיף את הקוצים שלהאריך רוחבית מדנדריטים.
   

5. 3D כימות של קוצים הדנדריטים

הערה: בסעיפים הבאים במיוחד לתאר את השימוש בתוכנת Imaris לניתוח. מימושים אלטרנטיביים קיימים, כולל ¹⁵ NeuronStudio או Metamorph ^8, אשר יכול לספק תוצאות דומות.

השתמש בהגדרות המפתח הבאות:

1. כשלב עיבוד מראש, להשתמש בסינון גאוס באמצעות מתקני עיבוד תמונה המוצעים על ידי התוכנה. בצע סינון גאוס באמצעות עיבוד תמונה> Smooדבר> סינון גאוס. הגדר את רוחב המסנן להיות שווה לגודל פיקסל בXY.
2. לבצע מעקב אוטומטי למחצה של דנדריטים, באמצעות מודול נימת Tracer של התוכנה.
   1. ראשית, להעריך את קוטר דנדריט, על ידי שימוש בכלי המרחק בכרטיסיית Slice של התוכנה.
   2. בכרטיסייה לעלות, לחץ על כלי החוטים. לאיתנות טובה יותר, פרוטוקול זה מסתמך על מעקב חצי אוטומטי; לחץ על יצירה אוטומטית דלג. ממשק מודול עכשיו מראה את כרטיסיית צייר. כאן, בחר AutoPath כשיטה, דנדריט כסוג, וקלט קוטר דנדריט המוערך.
   3. השתמש במצב בחר של המצביע, הופך את הסמן לתיבה. לחץ Shift ימני על נקודת התחלת דנדריט. הערה: התוכנה מבצעת חישובים ראשוניים.
   4. הזז את המצביע לאורך דנדריט. מנקודת ההתחלה (מייצגאד כתחום כחול), קו צהוב מייצג את נתיב דנדריט הסביר ביותר מוצג. לחץ-Shift-שמאל בנקודת סיום דנדריט.
3. לבצע פילוח קוצים האוטומטי. הערה: הקוצים על דנדריט לייחס נמצאים באופן אוטומטי על ידי ממשק מודול.
   1. בממשק מודול, לחץ על כרטיסיית היצירה. ברשימה שחררה לבנות מחדש, לבחור לבנות מחדש קוטר דנדריט וסמן את תיבת הנתונים שמור. לאחר מכן לחץ על בנה מחדש.
   2. הגדר את הסף, כך שהנפח המפולח תואם את בפועל דנדריט הנפח. כאלגוריתם, בחר הקצרה ביותר מרחק ממרחק מפה. לחץ על הכפתור הבא.
   3. לקבוע את קוטר ראש עמוד השדרה הקטן ואורך המקסימאלי, שוב על ידי שימוש בכלי המרחק בכרטיסיית Slice של התוכנה, ולאחר מכן לחזור לכרטיסייה לעלות ולהזין את הפרמטרים. Fאו בפרוטוקול זה, ערכים סביב 200-300 ננומטר לקוטר מינימאלי ו -4 מיקרומטר לאורך מקסימאלי הם נקודת התחלה טובה. אל תסמן את תיבת סניף שדרות אפשר. לחץ על הכפתור הבא.
   4. התאם את סף זרע נקודות, כך שהנקודות הכחולות מייצגות קוצים למקם את ראשי עמוד השדרה בפועל. לחץ על הכפתור הבא. הערה: חישוב הליבה מתבצע עכשיו ויכול להיות ארוך.
4. לסווג קוצים ידי מעבר ללשונית כלים של ממשק מודול. לחץ על לסווג קוצים. בממשק המשתמש תתבקש, לוודא שיש ארבע כיתות, שהוגדרו על ידי המורפולוגיה שלהם כדלקמן: סטאבי: אורך <1 מיקרומטר; פטריות: אורך (עמוד השדרה)> 3 ורוחב מקס (ראש)> אומר רוחב (צוואר) x 2; ארוך דק: Mean רוחב ≥ Mean רוחב (צוואר) (ראש); כמו filopodia-: אורך ≤ 4 מיקרומטר (לא ראש).
   הערה: מוממשק Dule מייצר ארבעה חפצי נימה חדשים המכילים את התוצאות של הסיווג.
5. נתונים סטטיסטיים יצוא: על כל ארבעת ממשקי אובייקט אלה, עבור לכרטיסיית סטטיסטיקה.
   לחץ על כל סטטיסטיקת היצוא לקובץ לחצן.
   הערה: ערכים סטטיסטיים אחרים ניתן לייצא לדנדריטים (. למשל, אורך, שטח, אומר קוטר, עומק סניף, הסתעפות זווית, נפח, וכו '.), ועבור עמוד השדרה (למשל, יושר, אזור של קובץ מצורף, אורך ונפח של מובחן חלקי עמוד השדרה, בקוטר עמוד השדרה, צפיפות, וכו '.)

Results

המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול סטנדרטי לכימות עמוד השדרה של דנדריטים תרבית של תאי עצב פירמידה נגזרים מiPSC. פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של התבגרות עמוד השדרה על נוירונים אנושיים והשוואה האפשרית שלה עם ההתבגרות של עמוד השדרה בתרבויות עצביות מכרסם סטנדרטיים, כמו גם in vivo מודלים של בעלי חיים ב.

איור 1 א מייצג ערכה של השלבים השונים של תרבות המאפשרים הייצור של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה. ייצוג סכ...

Discussion

כימות של תכונות מורפולוגיות של נוירונים פירמידה הסתמכה על התוכנה. ממשק נימת Tracer שימש לפילוח של נוירונים וקוצים, ואת מודול XT שימש לניתוח שלהם.

כדי לנתח את הדיוק של הטכניקה שלנו, אנחנו בהשוואה ראשונה פרמטרים שנמדדו מורפולוגיים (אורך, שטח, ועמוד השדרה כולל כאשר החלים נפח), עם אלה שפורסמו באמצעות נוירונים פירמידה בוגרים עכברוש בתרבות ^{6, 7} ורקמות מוח אנושיות ^3. הצפיפות היתה דומה בכל המקרים. א...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-PBS (1x), ללא סידן, מגנזיום ופנול גיבקו אדום	/ Life Technologies	14190169
תמיסת פולי-L-אורניתין Bioreagent	Sigma Aldrich	P4957
למינין עכבר	Dutscher Dominique	354232
N2 תוסף	תזונה Gibco/ Life Technologies	17502048
תוסף B-27 ללא ויטמין A (פי 50)	Gibco / Life Technologies	12587010
DMEM / NUT. MIX F-12 עם	ג'יבקו / לייף טכנולוג'יז	31331028
נוירובסל מד SFM	גיבקו / לייף טכנולוג'יז	21103049
2-מרקפטואתנול	גיבקו / לייף טכנולוגיות	31350-010
פניצילין-סטפטומיצין	גיבקו / לייף טכנולוגיות	15140-122
GFP סרום ארנב נוגדן רב-שבטי	גיבקו / Life Technologies	A-6455
סרום	סוסים Gibco/ Life Technologies	16050130
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit	Gibco / Life Technologies	A11034
Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody	Millipore	AB9354
Coverglass 13 מ"מ	VWR	631-0150
Prolong Gold Antifade Reagent עם DAPI	Gibco / Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, נוזל צמיג	סיגמא אולדריץ' Chimie	P7949
טריטון X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
פיברובלסטים אנושיים	Coriell Cell Line Biorepository	GM 4603 ו-GM 1869	Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, ארה"ב
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי	Zeiss (גרמניה)	LSM 700
Imaris Software	Bitplane AG, Zurich	6.4.0 גרסת	מודולי Filament Tracer ו-Imaris XT נחוצים
Huygens Software	תוכנת Huygens, SVI, הולנד	גרסת Pro	אופציונלית (לבדיקת דה-קונבולוציה)