מאמר שיטה

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

DOI:

10.3791/53205

⸱

8 בדצמבר 2015

 ,  , 
1Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העברה מתא לתא של אגרגטים חלבונים, או זרעים פרוטאופתיים, עשויה להיות הבסיס להתקדמות הפתולוגיה במחלות ניווניות. כאן, מתוארת בדיקת ציטומטריית זרימת FRET חדשה המאפשרת זיהוי ספציפי ורגיש של פעילות זריעה מדגימות רקומביננטיות או ביולוגיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראיות הולכות וגדלות תומכות בהתפשטות טרנס-תאית של אגרגטים חלבונים רעילים, או זרעים פרוטאופתיים, כמנגנון להתחלה והתקדמות של פתולוגיה במספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר והטאואופתיות הקשורות אליה. התפקיד הפוטנציאלי הקריטי של זרעי טאו בהתקדמות המחלה תומך מאוד בצורך בבדיקה רגישה המזהה בקלות פעילות זריעה בדגימות ביולוגיות.

על ידי שילוב הספציפיות של העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET), הרגישות של ציטומטריית זרימה ויציבות קו תאים חד שבטי, הונדסה בדיקת זריעה רגישה במיוחד ותואמת לזיהוי זרעים מדגימות רקומביננטיות או ביולוגיות, כולל הומוגנטים של מוח אנושי ועכבר. הבדיקה משתמשת בתאי HEK 293T חד-שבטיים המבטאים ביציבות את תחום החזרה הנוטה לצבירה (RD) של טאו המכיל את מוטציית P301S הקשורה למחלה המאוחה ל-CFP או YFP, המייצרים אות FRET בעת צבירת חלבונים. ספיגת זרעי טאו פרוטאופתיים (אך לא חלבונים אחרים) לתאי החיישן הביולוגי מגרה צבירה של RD-CFP ו-RD-YFP, וזרימה ציטומטרית מנטרת באופן רגיש וכמותי את ה-FRET המושרה על ידי הצבירה. הבדיקה מזהה ריכוזים פמטומולריים (שווה ערך למונומר) של זרעי טאו רקומביננטיים, בעלת טווח דינמי המשתרע על פני שלושה סדרי גודל, ותואמת להומוגנטים במוח מעכברים טרנסגניים מטאואופתיה ונבדקי טאואופתיה אנושיים. עם שינויים קלים, הבדיקה יכולה גם לזהות פעילות זריעה של זרעים פרוטאופתיים אחרים, כגון α-synuclein, והיא תואמת גם לתרביות עצביות ראשוניות. הקלות, הרגישות והישימות הרחבה של ציטומטריית זרימת FRET הופכות את זה לשימושי לחקור מגוון רחב של הפרעות צבירת חלבונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההצטברות של amyloids טאו תאיים מגדירה tauopathies כגון מחלת אלצהיימר. בשלבים המוקדמים של מחלה, פתולוגיה בדרך כלל מקומית לאזורים הנפרדים של המוח, אך עם התקדמות מחלה, פתולוגיה תמיד מתפשטת לאורך רשתות עצביות שונות 1-5. ראיות מצטברות מצביעות על התפשטות transcellular של אגרגטים חלבון רעילים בבסיס הפתולוגיה זה (שנסקר ב6-10). במודל זה, זרעי proteopathic (למשל, באוניברסיטת תל אביב) משתחררים מתאי תורם ולהיכנס תאי שכנים, הפיכת חלבון טאו ילידים לטופס misfolded באמצעות שינוי קונפורמציה בתבניות 11-15. Assay המתואר כאן פותח כדי לזהות פעילות זריעה כגון רגישות. זה תואם עם חלבון רקומביננטי ודגימות ביולוגיות ומאפשר כימות של רמות דקות של פעילות זריעת proteopathic 16.

תאי HEK 293T שיציבות להביע ד חוזר טאוomain (RD) המכיל את המוטציה P301S הקשורים למחלות התמזגו או CFP או YFP (להלן כתאי טאו-RD-CFP / YFP) לשמש כbiosensor יציב של פעילות זריעה. בהעדר זרעי proteopathic, התאים לשמור על טאו כמונומר מסיס, ואין להם סריג רקע ניכר. ספיגה ספונטנית או התמרה תיווך liposome של זרעי טאו לתאים, עם זאת, תוצאות בRD-CFP וצבירת RD-YFP, אשר מייצר אות סריג שנמדד בתוך תאים בודדים באמצעות cytometry זרימה.

רכיבים רבים של assay זה הונדסו כדי לשפר את הרגישות ולהפחית השתנות. שורת תאים חד שבטי עם יחס של 1: ביטוי RD-CFP / YFP 1 נבחרה, כפי שהיא מספקת אות אופטימלית: רעש. כדי להגביר את הרגישות, פוספוליפידים משמשים להציג זרעים ישירות לתוך תאים (למרות ללמוד מנגנונים ביולוגיים של ספיגה, זה יכול להיות מושמט). לבסוף, cytometry זרימת צגי סריג ברמת אוכלוסייה ותא בודד רמה, שלא כמו מבחני צבירת חלבון אחרים. מדד התוצאה הסופי, צפיפות סריג משולבת, היא כמותי מאוד והחשבונות הן למספר תאים עם צבירה, והמידה שבה צבירה התרחשה בתוך כל תא. כל פרמטרים האופטימליים אלה לשפר את הרגישות ולהבטיח שחזור.

מערכת זו הועסקה לאחרונה במחקר מקיף בעכברים מהונדסים tauopathy P301S 17 שהעריך את תחילת הזמן והתקדמות של פעילות ביחס זריעת טאו לסמנים פתולוגיים טאו הנפוץ אחרים (לדוגמא, MC1, AT8, PG5, וThioflavinS). פעילות זריעה היא רחוקה סמן המוקדם וחזק ביותר של פתולוגיה באוניברסיטת תל אביב העריך, שקדמו לגילוי היסטולוגית על ידי לפחות 6 שבועות. פעילות זריעה מופיעה ב 1.5 חודשים ועליות בהדרגה עם גיל, מה שמרמז תפקיד סיבתי של זרעי proteopathic בתחילה ו / או ההתקדמות של ניוון מוחיים 16.

e_content "> כימות מדויק של רמות דקות של חומר זרע מדגימות ביולוגיות יכול להקל על מחקרים העוקבים אחר התקדמות מחלה מוקדמת. על ידי קיצור משך משפט ומאפשר שימוש בבעלי החיים צעירים, זה יכול להגביר את היעילות והדיוק של ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. לדוגמא, ב עכבר P301S שתואר קודם לכן, תרכובות עופרת יכולות להיות מועברות מוקדם ככל 4-6 שבועות (מייד לפני, או בתחילתה של פעילות זריעה), ופיקוח על יעילות 2-4 שבועות לאחר מכן. assay צריך במדויק לכמת הפחתה כלשהי בזריעה פעילות. סריג cytometry זרימה שניתן לבדוק במבחנה יישומי הקרנה גם כן. לדוגמא, ריאגנטים אנטי-טאו (למשל, נוגדנים, מולקולות קטנות, וכו ') במהירות ליכולתם לחסום זריעת אינדוקציה ישירות בתרבות, או באמצעות טאו רקומביננטי אגרגטים או lysates נגזר מוח כמקור זרע (איור 5). עם התקנה זו, מהרגע שחומר זרע מוכן, לשעברperiment לוקח רק שלושה ימים כדי להשלים, כולל ניתוח נתונים. הכימות המהיר של פעילות זריעת proteopathic יכול כך להקל על מחקרים רבים של ניוון של מערכת עצבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה מדגיש את השימוש בסריג cytometry זרימה לאיתור פעילות זריעה מדגימות ביולוגיות עכבר. זה גם תואם עם סיבי רקומביננטי ודגימות ביולוגיות אנושיות. קציר המתת חסד ומוח עכבר בוצע בהתאם לנהלים שאושרו על-IACUC.

1. מוח הפקה

  1. בעקבות הרדמה עמוקה עם isoflurane (2%), perfuse עכבר עם PBS קר כקרח המכיל הפרין 0.03%, ולחלץ את המוח בעקבות הפרטים שתוארו בet al גייג. 18
  2. מניחים רקמות חולצו בcryo-בקבוקון, ולהצמיד הקפאה על ידי הצבת בחנקן נוזלי. לחלופין, להקפיא רקמה על קרח יבש. ברגע קפוא, להעביר רקמות -80 ° C וחנות לתקופה ארוכה של זמן, במידת צורך.
    הערה: פרוטוקול זה תואם homogenates המוח כולו או אזורים במוח-גזור מיקרו. ראה אל Hagihara et. לפרוטוקול מיקרו לנתיחה מפורט 19.

2. הכנת חומר זרע הביולוגי

  1. הכן חיץ הומוגניזציה ידי המסת מעכבי פרוטאז (EDTA חינם) לTBS 1x (לוח 1 לכל 10 מיליליטר). וורטקס במרץ, וחנות על קרח. מעכבי פרוטאז חייבים להיות EDTA חופשי כדי לשמור על כדאיות תא biosensor.
  2. שוקל רקמת מוח קפוא בסירה לשקול חד פעמית, ולהעביר צינור חרוטי 5 מיליליטר. הוסף חוצץ הומוגניזציה קר כקרח, כך שהפתרון הסופי הוא 10% במשקל / נפח. באופן זמני לאחסן על קרח. מסת רקמה ויצירת הומוגניות הבאה חיץ נפח ישתנה בהתאם לגודל המוח ו / או האזורים בשימוש. כאן, hemibrain עכבר בוגר במשקל 0.2 גרם מושעה ב 2 מיליליטר ל- 10% w / פתרון כרך.
  3. העברת דגימות לחדר קר, ולהתאים sonicator בדיקה להגדרות המתאימות. עבור sonication בדיקה עם Ruptor Omni (המוצג כאן), להגדיר את הכח ל -20%, אשר תואם את כ -75 W. השתמש מצב דופק כדי להבטיח דגימות לא OVאה-מחומם במהלך sonication. הגדר את Pulser 30%, המקביל לכ 500 אלפיות שניים.
  4. נקה את קצה sonicator הבדיקה על ידי שטיפה במים, isopropanol, ומים שוב, מנגבים את הבדיקה בין כל פתרון. להיות בטוח כדי לשטוף ולנגב את שני הצדדים ותחתונים של הבדיקה עם מעבדה-מגבונים.
  5. עבודה עם מדגם אחד בכל פעם, להטביע את קצה הבדיקה למאגר הומוגניות, ולהתחיל sonicator. שימוש בהגדרות צריכת החשמל וPulser שתוארו לעיל, לספק 25 פולסים כולל. ודא רקמה שהיא לגמרי בהשעיה. להיות זהיר, כדי למנוע הקצפה של המדגם במהלך שלב זה.
    הערה: דוגמאות רגישות להקצפה אם) הנפח הכולל הוא נמוך או ב) homogenate מתחמם. עם המכשיר הספציפי הזה, לא sonicate עם כמויות פחות מ -250 μl. כדי להבטיח דגימות להישאר קרות, צינורות עשויים להיות מאוחסנים על קרח במהלך שלב זה.
  6. נקה את הבדיקה על ידי מוחה lysate שייר, אז לספק 10 פעימות לo כוסמים נקיים ו. יש לשטוף את הצדדים ותחתונים של הבדיקה עם מים, isopropanol, ומים שוב (כמו בשלב 2.4), ניגוב היבש בין כל שלב. כדי למנוע זיהום, לשטוף ביסודיות את הבדיקה בין דגימות.
    הערה: עם אגרגטים טאו, לא מצאה כי שיטות ניקוי מחמירות יותר נחוצות למניעת זיהום מדגם למדגם. amyloids אחר, לעומת זאת, עשוי לדרוש טיפול נוסף אשר תואר בהרחבה בספרות 20,21.
  7. חנות homogenates על קרח עד שכל הדגימות עובדו.
  8. ספין homogenates ב21,300 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. מעבירים את supernatant לצינור נקי, נזהר שלא להפריע את הכדור. זורק את הכדור. Aliquot supernatant, וlysates החנות ב -80 ° C לשימוש נוסף. הימנע מחזורי הקפאה / הפשרה של homogenates, עם זאת, כפי שזה מפחית את יעילות זריעה.

3. תאי replating biosensor

הערה:השתמש בארבע שורות תאים לassay זה: HEK 293T (# קו תא 1), RD-P301S-CFP (קו # תא 2), RD-P301S-YFP (קו מס '3 תאים), וRD-P301S-CFP / YFP ( קו תא מס '4). אנא טבלת עזר 1 לתרומתו של כל קו תא assay.

  1. בסביבת סטרילית, תרבות בינונית לשאוב. יש לשטוף את תאים עם PBS החם, ולשאוב. Trypsinize תאים (3 מיליליטר של טריפסין EDTA (0.05%)) במשך 3 דקות, להרוות עם מדיום תרבות החמה (9 מיליליטר של DMEM, 10% FBS, 1% עט / סטרפטוקוקוס, 1% Glutamax), ולהעביר מייד לתאים צינור חרוטי.
  2. תאי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. בינוני לשאוב, ותא גלולה גלול במדיום התרבות החם.
  3. באמצעות hemocytometer, לקבוע את צפיפות תאים לכל שורת תא. צפיפות תאים תשתנה בהתאם confluency בזמן קציר וresuspension הנפח. תאי Resuspend נקטפו מצלחת 10 סנטימטרים בconfluency 90% ב 10 מיליליטר תקשורת, לצפיפות תאים להיות כ 1 מיליון תאים / מיליליטר.
  4. לַעֲשׂוֹתתערובת אב של תאים + תקשורת באופן שכל גם צלחת גם 96 תכיל 35,000 תאים בתקשורת 130 μl (למשל, כדי להפוך את תערובת אב 100 בארות, resuspend 3.5 מיליון תאים בתקשורת 13 מיליליטר). לשנות את מספר התא כדי להתאים עיצובים ניסיוניים בודדים ולוחות זמנים. לטיפול בתא ~ 18 שעות לאחר ציפוי, להוסיף 35,000 תאים היטב בכל צלחת 96-היטב.
  5. באמצעות pipet רב ערוצית, פיפטה לאט 130 μl של השעיה תא תערובת האמן לבאר כל תחתית שטוחה, שטופלה בתרבית רקמת 96 צלחת גם. בעוד ציפוי, למקם את קצה pipet במרכז הבאר, לא נוגע בתחתית הצלחת.
    הערה: למרות שניתן לשנות פורמט ציפוי, מה שהופך את n = 4 בארות לכל אחת משורות תאי 1-3 לכל צלחת מומלצת. שארית הפלטה (n = 84) שמורה לקו תא # 4 (תאי biosensor).
  6. אפשר התאים להתיישב על ידי השארת הצלחת ללא הפרעה במשך 10 דקות ב RT. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו# 8805; 80% לחות יחסית.

4. תאי טיפול

הערה: היום הבא, כאשר תאי biosensor טאו הם 60-65% ומחוברות, להכין מתחמי התמרה זרע כדלקמן:

  1. בצינור אחד, לשלב מגיב transfection, כגון Lipofectamine, עם תקשורת מופחתת בסרום, כגון Opti-ממ, כדי להפוך את תערובת אמן. בכל טוב, להוסיף 1.25 מגיב transfection μl ו8.75 μl תקשורת מופחת בסרום. צינור קפיצי בעדינות לתערובת, בקצרה ספין למטה, ודגירה של 5 דקות על RT.
  2. בצינור אחר, לשלב חומרי זרע (aliquot של lysate מהשלב 2.9) עם תקשורת מופחתת בסרום.
    הערה: כרך של חומר זרע ישתנה בהתאם לניסוי הבודד. בעת בחירת זרע נפח, לקחת בחשבון: שפע של זרעים במדגם ורעילות פוטנציאלית. homogenates הגולמי יכולה להיות רעילה לתאים. ככזה, להשתמש בנפח הנמוך ביותר האפשרי לעקוב אחר ההשפעה הרצויה. כרכים נבדקו בעבר של lysate / גם מגוון fr אום 1-5 μl, מתאים לחלבון כולל 5-20 מיקרוגרם. ודא שהנפח הכולל לכל גם (זרעים + התקשורת מופחתת בסרום) הוא 10 μl.
  3. לשלב תוכן משני הצינורות שתוארו ב4.1 ו -4.2, קפיצי בעדינות לתערובת, בקצרה ספין למטה (1,000 XG, 5 שניות), ולדגור על RT לפחות 20 דקות ועד שעה 2.
  4. בעדינות פיפטה 20 μl של התמרה מורכבת בצד של בארות biosensor בודדות. להשתמש בשלוש משכפל טכני, אם אפשר. חזור תאים שטופלו לחממה עבור 24-48 שעות. דגירה באותם תנאים כפי שתואר בשלב 3.6.
    הערה: מצב השליטה השלילי המתאים להתקנה זו היא תאים שטופלו בbiosensor יפוזומים ריקים (כלומר, מגיב liposome + תקשורת מופחתת בסרום) כי יישום של פוספוליפידים מציג שינוי קל בביחס פרופיל הקרינה לתאים שלא נחשפו לbiosensor מגיב יפוזום.

5. תאי קציר לסריג cytometry הזרימה

class = "jove_content"> הערה: לפני קצירת תאים-כלל 24-48 שעות שלאחר טיפול-אפשר לקבל קריאת נתונים ראשוניות של פעילות זריעה באמצעות מסנן GFP במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי הפוך. תאים שטופלו ללא חומר זרע (כלומר, ליפוזומים ריקים) יציגו הקרינה מפוזרת, ואילו תאים שטופלו בחומר זרע יציגו punctate אינטנסיבית ותכלילים רשתי תאיים (איור 1 א - ב).

  1. באמצעות pipet רב ערוצית, לשאוב את כל המדיום הסלולרי (150 μl). Trypsinize (50 μl) תאים למשך 5 דקות, ולהרוות עם 150 μl מדיום תרבות מצונן. אינו כולל שטיפת PBS לפני trypsinization בשלב זה, כפי שהוא עלול לגרום להרמת תא ואובדן תא שלאחר מכן. תכלול כל תאים מתים זיהום ופסולת במהלך cytometry זרימה באמצעות אסטרטגיות gating.
  2. מייד לאחר מרווה, תאי העברה לצלחת תחתונה גם עגולה 96, ו צנטריפוגות XG ב 1000 עבור 5 ק"מn ב RT.
  3. לשאוב ולזרוק בינוני, לטפל כדי למנוע הפרעה לתא גלולה.
  4. בעדינות, אך ביסודיות, resuspend תא גלולה בparaformaldehyde 50 μl 2%, ודגירה של 10 דקות. לחלופין, תאים לרוץ לחיות, אם כי קיבעון מספק תוצאות נקיות ועקביות יותר.
  5. תאי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. לשאוב ולזרוק paraformaldehyde, לטפל כדי למנוע הפרעה לתא גלולה.
  6. בעדינות, אך ביסודיות, resuspend התא גלולה ב200 μl זרימה מצוננת cytometry חיץ (HBSS, FBS 1%, 1 mM EDTA) ולהפעיל את הצלחת בהקדם האפשרי, כדי למנוע clumping תא.

6. סריג cytometry הזרימה

הערה: השתמש cytometer זרימה כגון MACSQuant VYB, אשר מצויד בסריג תואם קווי לייזר ומערכות סינון (טבלה 2). לכל שלב בסעיף זה, לחץ גם עניין באמצעות תבנית 96 גם של התוכנה, ולחץ על"לשחק" כדי להתחיל ספיגת מדגם וזרימה. הפוך חלקות או טבלאות סטטיסטיקה על ידי לחיצה על הסמל 'חלון הניתוח החדש ". לשנות פרמטרים ציר על מגרשי bivariate בודדים על ידי לחיצה על הכותרת על X או ציר Y ובחירת המסנן המתאים. להעביר אוכלוסיות תאים או אותות הקרינה, להגדיל או להקטין את המתחים הקשורים למסננים המתאימים. עם המכשיר הזה, לרוץ <1,000 אירועים / sec כדי להבטיח ניטור תא בודד מדויק.

  1. הפוך פיזור-פינת צד (SSC-) לעומת קדימה פיזור-פינת (FSC-) עלילת bivariate, ועם ריצת # 1 שורת תאים, להתאים את מתחי SSC וFSC עד אוכלוסיית התא היא ברבע השמאלי התחתון. לחץ על כלי המצולע, ולהגדיר את אוכלוסיית התא (שער P1). לכל הפרמטרים gating ראה איור 2.
  2. הפוך FSC-H (גובה) לעומת עלילת FSC-bivariate, ולהחיל שער P1 לעלילה זו על ידי לחיצה על "חי" לעיל העלילה, ובחירת P1. עם קו תא מס '1פועל, לחץ על כלי המצולע, ולהגדיר תאים בודדים (שער P2).
  3. לעשות 3 חלקות היסטוגרמה, אחד לכל אחד מהמסננים של עניין: CFP, YFP, והסריג. החל השער P2 לכל חלקות אלה על ידי לחיצה על "חי" מעל החלקות, ובחירת P2. עם ריצת # 1 שורת תאים, להתאים מתחים כך שאוכלוסיית תאים החציוני בCFP, YFP, וסריג היסטוגרמות כל בין 0 ל -1 כדי למדוד CFP וסריג, לרגש תאים עם לייזר 405 ננומטר, וקרינת לכידה עם 450/50 ננומטר ומסנן 525/50 ננומטר, בהתאמה. כדי למדוד YFP, לרגש תאים עם הקרינה לייזר ולכיד 488 ננומטר עם 525/50 ננומטר מסנן. הגדרות לייזר ומסנן מתוארות נוספות בלוח 2.
  4. בצע פיצוי לגלישת CFP לתוך ערוצי סריג וYFP.
    הערה: פיצוי הוא התהליך של תיקון זליגת הקרינה. זליגת הקרינה מתרחשת בכל פעם פליטת הקרינה של fluorochrome אחד מזוהה בתוך desi מסנןgned למדוד אות מfluorochrome אחר. עם פיצוי הולם, הקרינה גלישת CFP ניתן להסיר מערוצי סריג וYFP.
    הערה: פיצויים מחייבים הנוכחות של שני תאים החיוביים ול-שלילי הקרינה. לכן, כדי לפצות על תאי CFP-חיובי (קו # תא 2), תאים שליליים (# קו תא 1) יש להוסיף למדגם לפני הריצה.
    1. ספייק בμl 30 של השעיה # 1 שורת תאים מאחד גם לתוך 200 μl של השעיה # 2 קו התא מייד לפני הפיצוי.
    2. לחץ על סמל "הגדרות מכשיר", ולאחר מכן כרטיסייה 'פיצוי', וסמן את "מטריקס" לפתוח שולחן הפיצוי.
    3. הפוך סריג-לעומת-CFP עלילת bivariate, ולהחיל P2 שער, כמתואר בשלב 6.3. עם ריצת 1 + 2 שורות תאים, לחץ על הסמל 'ברבע ולצייר רביעים (כך שקרינת -שלילי וחיובי לאוכלוסיות מופרדות על ידי שני רביעים הנמוכים גייטס LL3ND LR3, בהתאמה).
    4. צור טבלת הנתונים הסטטיסטיים המציגה את עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של סריג לLL3 והשערים LR3. התאם את פרמטר סריג במטריצת הפיצויים עד MFI של אות סריג שווה בין LL3 וLR3. בעקבות צעד זה, MFI של אות סריג שווה בין תאים בלא כתם ותאי CFP-חיוביים, המצביע על היעדר גלישת CFP לתוך תעלת סריג.
    5. הפוך YFP-לעומת-CFP עלילת bivariate, ולהחיל P2 שער, כמתואר בשלב 6.3. לצייר רביעים (LL4 וLR4) דומים לזו שנעשתה בשלב 6.4.3.
    6. צור טבלת הנתונים הסטטיסטיים המציגה את MFI של YFP לLL4 וLR4. התאם את פרמטר YFP במטריצת הפיצויים עד MFI של אות YFP שווה בין LL4 וLR4. בעקבות צעד זה, MFI של אות YFP שווה בין תאים בלא כתם ותאי CFP-חיוביים, המצביע על היעדר גלישת CFP לתוך תעלת YFP.
  5. Follבשל התקנת שער ופיצוי, לסמן בארות של עניין ולהפעיל את שארית הצלחת.
  6. לאחר כל הדגימות כבר לרוץ, קבצי נתוני יצוא ידי לחיצה על 'קובץ', אז 'העתק'. בחר בכרטיסייה 'קבצי נתונים', סמן את תיקיית הניסוי, ולחץ על 'עותק'.

ניתוח 7. נתונים

הערה: פרמטרים ציר שינוי על מגרשי bivariate בודדים על ידי לחיצה על הכותרת על X או ציר Y ובחירת המסנן המתאים.

  1. קבצי FCS פתוחים בcytometry זרימת תכנית ניתוח.
  2. בהתבסס על מאפייני פיזור, להשתמש שער מצולעים להגדיר את אוכלוסיית התא (SSC לעומת FSC) ואוכלוסיית גופייה (FSC-H לעומת FSC-A) מהתאים שטופלו ביפוזומים ריקים, באופן דומה לזה שתואר בסעיף 6.
  3. אם פיצוי CFP בוצע במהלך התקנה, לא להתאים נוסף CFP.
  4. צור סריג לעומת עלילת bivariate YFP. שימוש בקו תא מס '3, מגדיר את שער סריג שווא על ידי ציור שער מצולעים המשתרע לאורך המדרון של אוכלוסיית תאי סריג-חיובי. שער זה אינו כולל תאים בודדים חיוביים YFP שפולטים אות בתוך מסנן סריג, והוא נמשך דומה לזה שהראה בעבר על ידי איסור et al. 22
  5. להגדיר שער סריג על ידי התוויית תאי CFP / YFP טופל liposome ריקים על סריג לעומת עלילת bivariate CFP. להציג את שער מצולעים במדרון של האוכלוסייה המשתרעת כלפי מעלה ושמאלה מן האוכלוסייה. שער זה צריך לכלול את רוב התאים (~ 99%), כך שרקע סריג הוא ≥1% מתאים. כל אירועים שיעברו לשער הזה נחשבים סריג-חיובי.
    הערה: כל שער בודד שתואר לעיל חל על כל הדגימות לפני הקמת שערים שלאחר מכן. בעקבות ניתוח, ארבעה שערים בודדים מוגדרים (אוכלוסיית תא; גופייה; סריג כוזב; סריג).
  6. פרמטרים שיא ניתוח של עניין, ובכלל זה: חיוביות סריג אחוזים וMFIשל תאי סריג-חיובי. באופן ידני לחשב את צפיפות סריג המשולבת על ידי מדידת המוצר של חיוביות אחוזים וMFI.
    הערה: אם צפיפות סריג משולבת משמשת כמדד תוצאה, סריג רקע להגדיר (כהגדרתו בשלב 7.5) וMFI לגדול או שווה ל -1 על מנת להימנע מחישוב מוצר שהוא פחות משני גורמים הבודדים שלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סריג cytometry זרימה מאפשר רגיש, כמותי, וזיהוי מהיר של פעילות זריעה מדגימות רקומביננטי או ביולוגיות. התקנת assay היא קלילה: שורות תאי יציבות הנגזר חד שבטיים להביע טאו-RD-CFP / YFP הם transduced עם חומר זרע, טופח במשך 24-48 שעות, ונתונים לניתוח תזרים cytometry (איור 1 א). בהעדר זרעים, תאי biosensor לשמור טאו בצורה מסיסה, monomeric (איור 1). בנוכחות של זרעים, לעומת זאת, תאי biosensor להמיר טאו למדינה מצטברת (איור 1 ג), ייצור תגובת ס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת cytometry זרימת סריג המתוארת כאן היא כלי רב עוצמה להערכת פעילות זריעת טאו במהירות ובכמותית. זה דורש רק ניסיון מתון תרבית תאים וידע בסיסי של סריג וcytometry זרימה. מבחני זריעה אחרים, כגון Thioflavin T - אשר מציגה משופר הקרינה כאשר חייב מבנה גיליון בטא - הם מייגע ודורשים מצע חלבון טהור, רקומביננטי. בנוסף, במבחנה מבחני זריעה לטאו הם חצי כמותית בלבד, ובדרך כלל רגישים לרמות subnanomolar חומר זרע 23,24. סריג cytometry זרימה, לעומת זאת, מספק מדד כמותי ורגיש להפל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקה זו ניתנה ברישיון ל-Janssen Pharmaceuticals.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קונסורציום טאו (M.I.D); מענק 1R01NS071835 (M.I.D.), מענק של משרד ההגנה PT110816 (ל-M.I.D.), 1F32NS087805 (ל-J.L.F.), ו-1F31NS079039 (ל-B.B.H).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
TBSSigmaT5912
cOmplete מעכבי פרוטאז (ללא EDTA)Roche4693159001
Cryo-vialsSarstedt72.694.006
איזון אנליטימטלר טולדוXSE 105DU
סירות שקילהפישר סיינטיפיק13-735-743
15 מ"ל צינור חרוטיארה"ב Scientific1475-0501
Omni Sonic Ruptor הומוגנייזר אולטראסוניOmni International18-000-115
מיקרו-טיפ להומוגנייזר קוליOmni InternationalOR-T-156
2-פרופנולפישר מדעיA451
מבטל רעשים אוזנייםפישר סיינטיפיק19-145-412
Kimwipesפישר סיינטיפיקS47299
שפופרות 1.5 מ"לארה"ב Scientific1615-5510
מיקרוצנטריפוגה Eppendorf5424 000.215
DPBSLife Technologies14190-136
DMEMLife Technologies11965-084
סרום בקר עובריHyCloneSH30071.03
פניצילין-סטרפטומיציןטכנולוגיות חיים15140-122
GlutaMaxLife Technologies35050-061
Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
50 מ"ל צינורות חרוטייםPhoenix ResearchSS-PH15
25 מ"ל מאגרים ריאגנטיםVWR41428-954
פיפט רב ערוציפישר סיינטיפיקTI13-690-049
96 צלחות תחתונות שטוחות היטבקורנינג3603
Opti-MEMLife Technologies31985-070
ליפופקטמין 2000Invitrogen11668019
96 צלחות תחתונות עגולות היטבקורנינג3788
16% Paraformaldehydeאלקטרונים מיקרוסקופיה SciencesRT 15710
PBSסיגמא-אולדריץ'P5493
EDTA סיגמא-אולדריץ'ED2SS
HBSSLife Technologies14185-052
Sorvall ST 40 ThermoScientific75004509
BIOLiner מתנדנד דלי רוטורThermo Scientific75003796
HemacytometerVWR15170-172
MACSQuant VYB Flow CytomterMiltenyi Biotec130-096-116
Chill 96 RackMiltenyi Biotec130-094-459
תוכנת ניתוח Flow JoFlow Jo
20 μ l טיפים פיפטRaininGPS-L10
200 μ l טיפים פיפטRaininGPS-250
1 מ"ל קצות פיפטRaininGPS-1000
200 μ l טיפים פיפטארה"ב סיינטיפיק1111-1800
5 מ"ל פיפט סרולוגיפיניקס מחקרSPG-606180
10 מ"ל פיפט סרולוגיפיניקס מחקרSPG-607180
25 מ"ל פיפט סרולוגיפיניקס מחקרSPG-760180
אטמי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
  2. Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
  3. Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
  6. Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).
  7. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Cellular mechanisms of protein aggregate propagation. Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).
  8. Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
  9. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
  10. Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
  11. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  12. Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
  13. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
  14. de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  15. Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302(2012).
  16. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
  17. Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
  19. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
  20. Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
  21. McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
  22. Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344(2010).
  23. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
  24. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FRET Flow CytometryProteopathic SeedingTau AggregationBiosensor CellsFlow Cytometry AnalysisFluorescence CompensationSeeding Activity DetectionRecombinant Tau SeedsBrain HomogenatesHEK 293T Cells

מאמרים קשורים