טיהור של כלי מוח עכבר

תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית (CNS) דורש סביבה תאית פיקוח הדוק, והדרישות מטבולים שלה הן עצומות בהשוואה לאיברים אחרים ^1. מערכת העצבים המרכזית היא גם מאוד רגישה למגוון רחב של כימיקלים, בדרך כלל לא מזיק לאיברים היקפיים אבל לזה, רעיל למערכת עצבים. כדי להבטיח תפקוד נכון, רוב כלי הדם "של מערכת העצבים המרכזית מהווה מחסום אנדותל; את מחסום דם-המוח (BBB), אשר שולט על הזרימה של מולקולות ויונים, כמו גם המעבר של תאי מערכת חיסון בין הדם והמוח, ובכך שמירה על הומאוסטזיס נכון ^2, אבל גם מגביל את הכניסה של תרופות טיפוליות, טיפולים ובכך פוגעים הפרעות נוירולוגיות של ^3. ברמה התאית, BBB הוא בעיקר שנגרם צמתים הדוקים נרחבים בין תאי האנדותל, ביטוי מקוטב של מובילי זרימה וקצב transcytosis נמוך מאוד ^4. מאפיינים ופונקציות של BBB בעיקר נגרמים על ידי neתאי ighboring ^4. בפרט, pericytes לשחק תפקיד חשוב בגרימה ושמירה על BBB ^5,6. להיות תאי התכווצות, pericytes גם לווסת את זרימת דם ⁷ כפי שעושה תאי שריר החלק סביב כלי גדול. לבסוף, האסטרוציטים, תאי גלייה העיקריים של המוח, לשלוח תהליכים גדולים בשם endfeet סביב ביותר של כלי הדם במוח ולווסת ⁸ שלמות BBB וקפאון חיסוני ^9, העברת מטבוליטים לנוירונים ^10, ולגרום לצימוד ההדוק בין פעילות העצבית ו זרימת דם ^11,12.

היכולת ללמוד את המאפיינים המולקולריים ותאיים של מערכת כלי הדם במוח היא קריטית כדי לאפיין טובים יותר את תרומתה לפיזיולוגיה של המוח וphysiopathology. כדי להתמודד עם שאלה זו, אסטרטגיות לבודד את מערכת כלי הדם במוח של המוח פותחו, המאפשרים להכנה של שברי כלי המוח שלמים. עמ 'כלי המוחיurification תחילה תאר באמצעות מוח שור ¹³ ומשופרים ומותאם למינים אחרים, במכרסמים בפרט ^14. במחקר האחרון, השימוש במסננים בגדלים שונים הוצג להפריד כלי מוח לשברים מועשרים בכלי בקטרים ​​שונים. מעניין לציין, בהכנות כגון, תאי האנדותל שמרו את הנכסים שלהם מטבולי ^15, פונקציונלי טרנספורטר ¹⁶ וקיטוב ^17. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול זה ולהפגין עוד כי כלי מבודדים לשמר רובם במבנים באתר. תאי האנדותל להישאר מקושרים על ידי צמתים הדוקים ומוקפים lamina בסיס מתמשך. Pericytes ותאי שריר חלק נשארים צמודים לשכבת האנדותל, כמו גם קרומי astrocyte perivascular. עם זאת, האסטרוציטים, תאי microglial, תאי עצב וoligodendrocytes בוטלו. לבסוף, אנו מתארים הליך לביצוע immunostaining על כלי מוח מבודדים. עד עכשיו רוב המחקרים המולקולריים ותאיים הנוגעים למערכת כלי הדם במוח בוצעו על תאי מוח כלי מטוהרים ניתקו באמצעות זני תא ספציפיים עכבר כתב או נהלים מבוססי immunostaining ^18,19 מיון תאים. למרות שטכניקות אלו מאפשרת הבידוד של אוכלוסיות תאי כלי דם במוח כמעט טהורות, תאים מבודדים לאבד לחלוטין באתר המורפולוגיה שלהם ואינטראקציות, אשר בתורו, במידה רבה משפיעה על התכונות מולקולריות ותאיות שלהם. הפרוטוקול מתואר כאן, המאפשר לבידוד של שברי כלי דם במוח כולו ללא צורך בנוגדנים ספציפיים או כתמי עכבר מהונדסים, מציע אלטרנטיבה טובה כמו המבנה הכללי של כלי מוח מבודדים נשמרת, כך, הפחתת השלכות על המאפיינים המולקולריים שלהם. כלי מבודדים עשויים לשמש ללימוד פעילות גן, סינתזת חלבון ורגולציה בBBB כלאחרונה תיארו ^20,21 22,23 הפרוטוקול הנוכחי הוא זול, קל לביצוע ומהירות להתאמה לכל מעבדה.

1. פתרונות וחומרים

1. הכן את פתרונות כלי בידוד: B1, להוסיף 1.5 מיליליטר של HEPES 1M 150 מיליליטר של HBSS; B2, להוסיף 3.6 גרם של Dextran 20 מיליליטר של B1; B3, להוסיף 1 גרם של BSA לשל B1 100 מיליליטר.
2. שנה את בעל מסנן על ידי חיתוך החלק התחתון מהחלק העליון הברגה.
3. הכן את פתרונות immunostaining: פתרון קיבוע, Paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS pH 7.4; Permeabilization / פתרון חסימה, לדלל סרום עז 5% וטריטון X100 0.25% ב PBS pH 7.4.
   הערה: הקיבוע תלוי בסוג של נוגדנים עיקריים בשימוש.

2. Dissection

הערה: תנאים סטריליים אינם נדרשים, אלא אם כלי משמשים למטרות תרבות תא.

1. הכן כוס 150 מיליליטר עם 20 מיליליטר של B1. שמור על קרח ולכסות עם parafilm כדי למנוע זיהום אוויר.
2. עמוק להרדים את העכבר מתחת למכסת מנוע עם מגבת נייר ספוגה בקטנה 1 מיליליטר של Isoflurane הטהורה שמתווסף into הכלוב. ההרדמה מאומתת על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן. להרוג את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
   הערה: צעדים אלה נעשים בעמידה בתקנות לאומיות ומוסדיות.
3. אופציונאלי: בצע זלוף intracardiac עם 20 מיליליטר של PBS 1x לחסל את תוכן הדם ^24.
4. סעיף העור עם אזמל מהצוואר לאף ולמשוך אותו משם. הסר את כל שערות זיהום עם PBS 1x.
5. כדי לפתוח את הגולגולת, הכנס ראשון מספריים anteriorly לנורת חוש הריח, ולפתוח את המספריים להתפקע הגולגולת בשני חלקים.
6. מוציא בזהירות את המוח בעזרת מרית מוח. לנתח את מקלעת דמית העין מהחדרים לרוחב כפי שהם היו לזהם את הכנת כלי דם ^38.
   הערה: אופציונאלי: ההכנה הסופית תכיל כלי parenchymal וקרומי מוח. אם לא רצוי, ניתן התקלפו קרומי המוח בעקבות ההליך שתואר על ידי ^38.
7. TRansfer המוח לתוך הכוס המכילה פתרון B1 על קרח. ניתן לטפל עד 8 מוחות יחד.

Homogenization רקמות 3. מוח

1. באמצעות שני סכינים, באופן ידני ונמרץ לנצח את המוח בפתרון B1 לאחר מכן קבלת חתיכות קטנות של כ -2 מ"מ.
2. Homogenize ההכנה עם homogenizer Dounce automatized, ביצוע 20 מקרי שבץ ב 400 סל"ד. ודא שצינור הזכוכית נשמר בקרח ושחלקו העליון של douncer הוא בפתרון כאשר נע מעלה ומטה, כדי למנוע ההיווצרות של כיסי אוויר. אם כמה דוגמאות מוכנות, לשטוף עם מים מיוננים douncer בין כל הומוגניזציה.

טיהור 4. כלי שייט

1. מעבירים את homogenate לתוך צינור פלסטיק 50 מ"ל ולהמשיך לצנטריפוגה ב 2000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. ממשק גדול לבן (בעיקר המיאלין) יהווה בחלקו העליון של גלולה הכלי (אדום אם לא זלוף בוצע).
2. בטל supernatant. גלולה הכלי והממשק הלבן יישארו מחובר יחד. הוסף 20 מיליליטר של תמיסת B2 קר כקרח ולנער את הצינור באופן ידני ונמרץ דקות 1.
3. המשך לצנטריפוגה השנייה ב4,400 גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. המיאלין כעת ליצור שכבה לבנה צפופה על פני השטח של supernatant.
4. לנתק בזהירות את שכבת המיאלין מקירות הצינור על ידי מחזיק את הצינור ולאט לאט מסובב אותו כדי לאפשר את supernatant לעבור לאורך הקירות. בטל המיאלין עם supernatant. גלולה המכילה את כלי נשארה מחוברת בחלק התחתון של הצינור.
5. למחוק את הקיר הפנימי של הצינור עם נייר סופג הכרוך סביב פיפטה פלסטיק 5 מ"ל ולהסיר את כל נוזלים שיורית, הימנע מלגעת בגלולת הכלי. שמור הפוך צינור על נייר סופג כדי לנקז את נוזלים שנותרו.
6. להשעות את גלולה ב 1 מיליליטר של פתרון B3 קר כקרח על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טיפים, keepi נמוך מחייבng הצינור על קרח, ולאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר נוסף של פתרון B3. ודא שכלי מפוזרים ככל האפשר ולא יוצרים אגרגטים.

5. סינון

1. הכן כוס בקרח עם 30 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח. לכסות עם parafilm כדי למנוע זיהום אוויר.
2. מניחים 20 מיקרומטר מסנן-רשת על בעל מסנן שונה בחלק העליון של בקבוק בקר ולאזן על ידי יישום 10 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח.
3. יוצקים את הכנת הכלי על המסנן ולשטוף כלים עם 40 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח.
4. לשחזר את המסנן באמצעות מלקחיים נקיים ולטבול אותו באופן מיידי בכוס המכילה פתרון B3. לנתק את כלי מהמסנן ידי ניעור אותו בעדינות.
5. יוצקים את תוכן הכוס בצינור פלסטיק 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ב -2,000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. הערה: לחלופין, ההשעיה של כלי המוח מהשלב 4.6 ניתן לסנן על מסנן מיקרומטר-רשת 100.במקרה זה, כלי גדול יותר נשמרים באופן מועדף על המסנן בזמן הזרימה דרך מכיל microvessels (בעיקר נימים), אשר לאחר מכן מסוננות במסנן 20 מיקרומטר-רשת כאמור לעיל.
7. Resuspend גלולה של microvessels ב 1 מיליליטר של פתרון B3 קר כקרח ולהעביר אותו על ידי pipetting אותו לתוך צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב -2,000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.

6. קיבוע, permeabilization וחסימה

1. העברת כלי על ידי pipetting לתוך 0.2 מיליליטר צינורות PCR המכילים PBS באמצעות קצה מחייב נמוך 1.0 מיליליטר. היזהר שלא לגעת בכולים כפי שהם עשויים לדבוק בחלק החיצוני של הקצה. לבצע את כל השלבים תחת מיקרוסקופ דו עיני הבאים.
2. לכל אחד מהשינויים בינוניים הבאים, להשאיר את הצינורות על קרח עד כלי הגיעו לתחתית, ופיפטה את רוב הנוזלים באמצעות טיפים pipet ג'ל טעינה ארוכים ודבר.
3. להסיר את רוב PBS ולהוסיף 200 μl של פתרון מקבע.להשעות את כלי על ידי טלטול בעדינות דגירה במשך 20 דקות ב RT.
4. פיפטה את הפתרון מקבע ולהחליף אותו עם 200 μl של 1x PBS (השטיפה ראשונה), דגירה של 5 דקות ב RT וחזור על שלב זה 3 פעמים. בכל פעם, לוודא שכלי שכהלכה שקעו לתחתית הצינורות ופיפטה את 1x PBS, הבטחת כלי לא נגעו.
5. לאחר השטיפה האחרונה, להחליף 1x PBS על ידי permeabilization / פתרון חסימת דגירה שעה 1 ב RT, resuspending כלי על ידי טלטול בעדינות מהעת לעת.

7. Immunostaining

1. החלף את permeabilization פתרון החסימה / עם השילוב של נוגדנים עיקריים (ראה אזכור של הנוגדנים המשמשים כאן ודילולים בטבלת תבנית חומרים) בדילול מלא בpermeabilization / פתרון החסימה, ודגירה על 4 מעלות CO / N.
2. לאחר 3 שוטף PBS ב RT, דגירה כלי עם השילוב של נוגדנים משני מדולל PBS לשעה 2ב RT.
3. הערה: אנו ממליצים בחום ביצוע מכתים גרעיני עם Hoechst (1: 2,000) או DAPI (1: 2,000) כדי להבדיל כלי מזיהום אפשרי שערות או אבק מתחת למיקרוסקופ.
4. לאחר 3 שוטף ב PBS, resuspend הכלים בμl 50 של PBS.

8. הרכבה ותצפית

1. הכן קצה עם נימי זכוכית siliconized: לחתוך קצה פיפטה P200 באמצעות אזמל ולהתאים את הנימים בפנים. הנפח המשוער של הנימים הוא 40 μl.
2. העבר את כלי לשקופית זכוכית באמצעות זכוכית נימי siliconized ולהסיר בזהירות את הנוזל עם פיסת נייר סופג.
3. החל טיפה אחת של הרכבה בינונית על הספינות ולהחזיק coverslip ב-45 מעלות המאפשר הירידה להפיץ בשולי הפתק. בואו ללכת coverslip ולאפשר בינוניים להפיץ לאט. בוא O היבש / N ב RT עם ההגנה מפני אור. ניתן לצפות כלי תחת fluorescמיקרוסקופ confocal אף אוזן גרון.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר לבידוד המכני של כלי מוח 14. איור 1 מסכם את השלבים העיקריים של טכניקה זו. הארכיטקטורה של כלי מוח היא מורכבת וכוללת מספר סוגי תאים, כלומר, תאי האנדותל חתום על ידי צמתים הדוקים ומוקף pericytes, תאי שריר חלק, ותהליכי רגל astrocyte 9. לפיכך, לאחר הבידוד של כלי מוח, אנחנו מכוונים כדי לאפיין את המבנה של כלי מטוהרים על ידי immunostaining כפי שמתוארת בחלק השני של הפרוטוקול שלנו. Agrin, רכיב של lamina בסיס אנדותל תויג ברציפות והומוגנית על פני האנדותל (איור 2 א). Zona occludens-1 (הסתדרות ציונית-1), אחד מהמרכיבים של צמתים הדוקים אנדותל הייתה immunostained ללא המשכיות לכאורה, המצביעה על כך צמתים הדוקים אנדותל השתמרו (איור 2). כיסוי אנדותל pericyte, התוויתאד על ידי NG2, הופיע כמעט רציף כפי שתואר לעיל 25 (איור 2 ג). לבסוף, תיוג אקטין שריר חלק חשף את הנוכחות של שכבת תאי שריר חלק צפופה במשטחים של כלי הגדול מטוהר (איור 2 ד). תוצאות אלו מראות כי הכוללות במבנה כלי המוח באתרו נשמרים שבברי הכלי המבודדים.

האסטרוציטים הוכחו לשלוח תהליכים גדולים, או 'endfeet' אל פני השטח של כלי, לנדן כמעט לחלוטין את מערכת כלי הדם במוח 8. האינטראקציה שלהם הדוקה עם כלי דם ותפקידם בשמירה על כלי דם במוח והסדרת פונקציות שונות, המיועדים להם כחלק חיוני של יחידת העצבים וכלי הדם 9. בנוסף, אנו ניתחנו את הסיקור של כלי דם astrocyte של כלי מוח מבודדים. Immunolabelling של נימה ביניים astrocytic GFAP, הווה בדרך כלל בכל astrocyte (איור 3 א), waזה רק באופן חלקי קיימים בכולים מטוהרים מראים כמה סיבים קצרים על פני השטח האנדותל (איור 3-C). לעומת זאת, 43 Connexin, חלבון צומת פער מועשר בקרומי astroglial perivascular 26, זוהה מאוד על פני השטח של כלי מטוהרים גדולים (איור 3D) ונימים (איור 3E). באופן דומה, immunolabelling של aquaporin-4 (Aqp4), חבר של משפחת תעלת מים הביע מאוד ברמה של קרומי astrocyte מול כלי 27, 26, מתאר את דפנות כלי מבודדים (איור 3F-G). למרות האסטרוציטים לא שיתוף מטוהר עם כלי, קרומי endfeet perivascular נשארו קשורים במהלך ההליך המכני של בידוד כלי המוח.

לבסוף, בדקנו את הזיהום האפשרי של ההכנות שלנו על ידי סוגי תאים עצביים אחרים. Immunolabelling של חוטי ביניים עצביים (NFM) (Hornung et al, 1999) חשף את הנוכחות של כמה סיבים שנותרו מחוברים לכולים, המצביע על שיתוף טיהור אפשרית של כמה מסופים עצביים (איור 4 א-ב). מיקרוגלים, שכותרתו על ידי Iba1 (איור 4C-D) וoligodendrocytes, שכותרתו על ידי Olig2 (איור 4E-F) לא אותרו בכלי מבודדים. כך, תאי עצב, מיקרוגלים וoligodendrocytes לא שיתוף מטוהר עם כלי המוח.

יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שהפרוטוקול המתואר מאפשר הטיהור של שברים השתמרו מבני מוח כלי, שעליו קרומי astrocytic perivascular נשארים צמודים.

איור 1. תכנית סיכום של פרוטוקול טיהור כלי המוח. הצעדים העיקריים מוצגות. סקיצה זה מצביעה על שלושה שברי כלי אפשריים שניתן להשיג בהתאם לאינטרנט אלחוטי lters משמש (100 מיקרומטר-רשת או 20). S1: microvessels וכלי גדול, S2: כלי גדול וS3:. Microvessels אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. ספינות מבודדות שמרו רובם במבנה אתרו. תחזיות תמונת Confocal של כלי מוח עכבר מבודד immunostained. Lamina סל immunolabelled לAgrin (אדום) (א). צמתים הדוקים תא האנדותל (B) immunolabelled לZonula Occludens (ZO-1 ) (אָדוֹם). Pericytes (C) immunolabelled לNG2 (אדום). (ד) תאי שריר חלק immunolabelled לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום). גרעיני מגואלות Hoechst (כחול).PG "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. ממברנות Endfeet astrocyte נשארות צמודות לכלי השייט מזוקק. תחזיות תמונת Confocal. (א) תמונה של סעיף מוח מראה כלי קליפת המוח immunostained לאנדותל PECAM (לבן), GFAP astrocytic (אדום) וConnexin 43 (Cx43) (ירוק ). (ב, immunolabelling C) GFAP ((ב) או של כלי שיט גדולים שכותרתו לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום) (ג) ירוק) על פני השטח של נימים מבודדות שכותרתו על ידי B4 isolectin (לבן). (ג) הוא Re-הדפסה עם אישור 20 (D, E) immunolabelling Cx43 (ירוק) על פני השטח של נימים מבודדות שכותרתו על ידי B4 isolectin (לבן) (ד) או של כלי שיט גדולים שכותרתו לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום) (F, G) aquaporin 4 immunolabelling (Aqp4) (ירוק) על פני השטח של נימים מבודדות שכותרתו על ידי B4 isolectin (לבן) (F) או של כלי שיט גדולים שכותרתו לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום) (G). גרעיני מגואלות Hoechst (כחול). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4:.. נוירונים, Microglia וOligodendrocytes הם לא שיתוף מטוהר עם כלי מוח תחזיות תמונת Confocal (A, B) neurofilament (NFM) immunostaining על פרוסת 20 מיקרומטר בעובי בהיפוקמפוס (אדום) (א) וכלי מוח מטוהרים ( B). (Immunostaining microglial Iba1 על פרוסת קליפת המוח 20 מיקרומטר-עבה (r C, B)עורך) (ג) וכלי מוח מטוהרים (ד). (E, F) immunostaining oligodendrocyte Olig2 על פרוסת קליפת המוח 20 מיקרומטר בעובי (אדום) (E) וכלי מוח מטוהרים (F). גרעינים מגואלות בHoechst (לבן ), האנדותל ידי B4 Isolectine (Ib4) (ירוק). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

למחברים אין מה לחשוף.