אנו מתארים פרוטוקול המאפשר טיהור של תא כלי הדם של מוח העכבר. כלי מוח מבודדים כוללים תאי אנדותל המקושרים בצמתים הדוקים ומוקפים בלמינה בסיסית רציפה, פריציטים, תאי שריר חלק בכלי הדם, כמו גם ממברנות אסטרוגליאליות סביב כלי הדם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
במוח, רוב מערכת כלי הדם מורכב ממחסום בררני, מחסום דם-המוח (BBB) המסדיר את חילופי מולקולות ותאי מערכת חיסון בין המוח והדם. יתר על כן, הדרישה המטבולית העצבית הענק דורשת רגולציה רגע לרגע של זרימת דם. יש לציין, חריגות של תקנות אלה הם סימני ההיכר של etiological ביותר פתולוגיות המוח; כולל גליובלסטומה, שבץ מוחי, בצקת, אפילפסיה, מחלות ניווניות (לשעבר: מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר), גידולים במוח, כמו גם מחלות דלקתיות כגון טרשת נפוצה, דלקת קרום מוח ותפקוד מוח הנגרם על-אלח דם. לפיכך, הבנת אירועי איתות ויסות הפיסיולוגיה כלי הדם במוח הוא אתגר גדול. תובנה הרבה לתוך המאפיינים התאיים ומולקולריים של סוגי התאים השונים המרכיבים את מערכת כלי הדם במוח יכולה להיות שנרכשו מהתרבות העיקרית או מיון תא מרקמת המוח טרי ניתק. למרות זאת,מאפיינים כגון קוטביות תא, מורפולוגיה ויחסים בין תאית אינם מתוחזקים בהכנות כאלה. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן נועד לטהר שברי כלי מוח, תוך שמירה על שלמות מבנית. אנו מראים כי כלי מבודדים מורכבים מתאי האנדותל החתומים על ידי צמתים הדוקים שמוקפים lamina בסיס מתמשך. Pericytes, תאי שריר חלק, כמו גם את קרומי endfeet astrocyte perivascular נשארים צמודים לשכבת האנדותל. לבסוף, אנו מתארים כיצד לבצע ניסויי immunostaining על כלי מוח מטוהרים.
מבוא
תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית (CNS) דורש סביבה תאית פיקוח הדוק, והדרישות מטבולים שלה הן עצומות בהשוואה לאיברים אחרים 1. מערכת העצבים המרכזית היא גם מאוד רגישה למגוון רחב של כימיקלים, בדרך כלל לא מזיק לאיברים היקפיים אבל לזה, רעיל למערכת עצבים. כדי להבטיח תפקוד נכון, רוב כלי הדם "של מערכת העצבים המרכזית מהווה מחסום אנדותל; את מחסום דם-המוח (BBB), אשר שולט על הזרימה של מולקולות ויונים, כמו גם המעבר של תאי מערכת חיסון בין הדם והמוח, ובכך שמירה על הומאוסטזיס נכון 2, אבל גם מגביל את הכניסה של תרופות טיפוליות, טיפולים ובכך פוגעים הפרעות נוירולוגיות של 3. ברמה התאית, BBB הוא בעיקר שנגרם צמתים הדוק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. פתרונות וחומרים
- הכן את פתרונות כלי בידוד: B1, להוסיף 1.5 מיליליטר של HEPES 1M 150 מיליליטר של HBSS; B2, להוסיף 3.6 גרם של Dextran 20 מיליליטר של B1; B3, להוסיף 1 גרם של BSA לשל B1 100 מיליליטר.
- שנה את בעל מסנן על ידי חיתוך החלק התחתון מהחלק העליון הברגה.
- הכן את פתרונות immunostaining: פתרון קיבוע, Paraformaldehyde 4% ב- PBS pH 7.4; Permeabilization / פתרון חסימה, לדלל סרום עז 5% וטריטון X100 0.25% ב PBS pH 7.4.
הערה: הקיבוע תלוי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר לבידוד המכני של כלי מוח 14. איור 1 מסכם את השלבים העיקריים של טכניקה זו. הארכיטקטורה של כלי מוח היא מורכבת וכוללת מספר סוגי תאים, כלומר, תאי האנדותל חתום על ידי צמתים הדוקים ומוקף pericytes, תאי שריר חלק, ותהליכי רגל astrocyte 9. לפיכך, לאחר הבידוד של כלי מוח, אנחנו מכוונים כדי לאפיין את המבנה של כלי מטוהרים על ידי immunostaining כפי שמתוארת בחלק השני של הפרוטוקול שלנו. Agrin, רכיב של lamina בסיס אנדות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחסום דם-המוח מסדיר את המעבר של חומרים פיסיולוגיים ולצאת של מערכת העצבים המרכזית ומגן עליו מפני חומרים מזיקים הנמצאים בדם. הוא מעורב במספר פתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית, כוללים מחלות ניווניות 2 וגידולים במוח 28. החדירות נמוכות מאוד של BBB פוגעות גם המעבר של סוכנים טיפוליים מיקוד תאים עצביים והפיתוח של שיטות מתכוונות לפתוח BBB הפיך ללא השלכות מזיקות למוח הוא תחום מאוד פעיל של מחקר 3. מאמצים רבים נעשו כדי לפתח מודלים רבים-ערך וטכניקות המאפשרות חק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי MemoLife Labex ועל ידי ARSEP (Fondation לשפוך עוזר l'à la משוכלל ונדיר sur la sclérose en לוחות)
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מטחנת רקמות גודל C | מדעית תומס | 3431E25 | |
| 5415 R | Eppendorf | ||
| צנטריפוגה 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| סטריאומיקרוסקופ מודולרית | Leica | MZ6 | |
| מספקת איכות גבוהה Leica LED1000 | Leica | ||
| קצות כריכה נמוכים (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| מחזיק מסנן Swinnex 47 מ"מ PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| ניילון מסנן דיסק מסנן נטו הידרופילי 20 ומיקרו; m 47 מ"מ 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| ניילון דיסק מסנן נטו הידרופילי 100 ומיקרו; m 47 מ"מ 100/pk | Millipore | NY1H04700 | |
| קיר סטנדרטי צינור בורוסיליקט | מכשיר סאטר | B150-86-7.5 | |
| שקופיות מיקרוסקופ | תרמו סיינטיפיק | 1014356290F | |
| החלקות כיסוי, עובי 1 | תרמו מדעי | P10143263NR1 | |
| 0.2 מ"ל צינורות דקי דופן וכובע כיפה | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (גודל גליל 4 אינץ' וזמנים; 125 רגל) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום | טכנולוגיית Life | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | טכנולוגיית חיים | 15630056 | |
| דקסטרן מ-Leuconostoc spp. מר ~ 70,000 | סיגמא | 31390 | |
| אלבומין סרום בקר | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנול | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| הרכבה בינונית Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| איזולקטין GS-IB4 מבית Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 מצומד; דילול 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (ארנב) ; דילול 1/400 | מסופק באדיבות על ידי Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (עכבר, שיבוט 1A12) | Life technology | 33-9100 | דילול 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (עכבר, שיבוט 1A4) | Sigma | A2547 | דילול 1:500 |
| Anti GFAP (עכבר, שיבוט GA5) | Sigma | G3893 | דילול 1:500 |
| Anti AQP4 (ארנב) | Sigma | A5971 | דילול 1:500 |
| Anti Cx43 (עכבר, שיבוט 2) | BD Biosciences | 610061 | דילול 1:500 |
| אנטי אוליג2 (ארנב) | Millipore | AB9610 | דילול 1:200 |
| Anti NF-M (עכבר) | מסופק על ידי ד"ר ביט מ. רידרר, אוניברסיטת לוזאן, שוויץ. | דילול 1:10 | |
| אנטי איבה1 (ארנב) | וואקו | 019-19741 | דילול 1:400 |
| Alexa Fluor 488 עיזים נגד עכבר IgG (H+L) טכנולוגיית נוגדן | חיים | A11029 | דילול 1:2,000 |
| נוגדן משני IgG (H+L) נגד ארנב עזים, Alexa Fluor 488 מצומד | טכנולוגיית חיים | A11034 | דילול 1:2,000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technology | A21424 | דילול 1:2,000 |
| נוגדן משני נגד ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor 555 מצומד | טכנולוגיית חיים | A21429 | דילול 1:2,000 |
מקורות
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
