הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שימוש

12.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53262

⸱

21 באוקטובר 2015

 , 
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

במאמר זה

סיכום

תרבית הטיפות הזקופות ex vivo היא אלטרנטיבה לטכניקות הניסוי הנוכחיות in vitro ו-in vivo. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, תוך מתן אפשרות לתפעל ולחקור כלי דם עובריים, מורפוגנזה ואורגנוגנזה.

תקציר

חוקר organogenesis ברחם הוא תהליך מאתגר מבחינה טכנית ביונקי שליה בשל חוסר נגישות של חומרים כימיים לעוברים המתפתחים בתוך הרחם. שיטה חדשה שפותחה תרבות אגל vivo לשעבר זקופה מספקת חלופה אטרקטיבית למחקרים שבוצעו ברחם. תרבות אגל vivo לשעבר מספקת את היכולת לבחון ולטפל אינטראקציות הסלולר ומסלולי איתות מגוונים באמצעות שימוש בחסימה שונות ותרכובות הפעלה; בנוסף, את ההשפעות של חומרים כימיים תרופתיים שונים על התפתחות איברים ספציפיים ניתן ללמוד ללא תופעות לוואי בלתי רצויות של אספקת סמים מערכתית ברחם. בהשוואה לאחרים במערכות חוץ גופית, תרבות אגל לא רק מאפשרת ליכולת ללמוד אינטראקציות תלת-ממדי המורפוגנזה ותאי תאים, שלא יכול להיות מועתקות בשורות תאי יונקים, אלא גם דורשת פחות משמעותי reagents מאשר אחר vivo לשעבר ובפרוטוקולי מבחנה. מסמך זה מדגים נתיחה נכונה עכבר עוברית איבר וטכניקות תרבות טיפה זקופות, ואחריו immunofluorescence איבר השלם כדי להדגים את היעילות של השיטה. Vivo לשעבר שיטת תרבות אגל מאפשרת ההיווצרות של אדריכלות איבר דומה למה שרואה בvivo ויכול להיות מנוצל כדי ללמוד תהליכים קשים למחקר אחר בשל קטלני עוברית במודלי in vivo. כמערכת יישום מודל, מעכב מולקולה קטנה ישמש לחקור את התפקיד של כלי דם בהמורפוגנזה אשכים. vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה ניתנת להרחבה למערכות אחרות של העובר איברים, כגון ריאות ואפשרות אחרות, אם כי כל איבר חייב להיות בהרחבה למד לקבוע שינויים איבר ספציפי לפרוטוקול. מערכת תרבות איבר זה מספקת גמישות בניסויים עם איברי העובר, ותוצאות obtaineד באמצעות טכניקה זו תסייע לחוקרים להרוויח תובנות בהתפתחות עוברים.

מבוא

התחדשות איברים in vivo בבני האדם היא מוגבלת מאוד; לכן, הנדסת רקמות, התפתחות רקמות ואיברים מהתאים בודדים שנתרמו על ידי מארח, הופכת טיפול פוטנציאלי אטרקטיבי להחלפת איברים. עם זאת, לאסטרטגיה טיפולית זו כדי להצליח, גורמים ואינטראקציות הסלולר מעורבות בהמורפוגנזה של האיבר יש ללמוד ביסודיות והבינו היטב. בשל חוסר היכולת ללמוד פיתוח של איברים ספציפיים עם גישות מסורתיות, חוקרים פנו לעובר כל חלופה או תרבויות איבר שלמות. Kalaskar et al. 1 הראה כי תרבות עובר כל vivo לשעבר מניבה תוצאות דומות (58% בעוברים בתרבית) בפיתוח הרחם, המצביע על כך שיטות תרבות vivo לשעבר הן אלטרנטיבה אפשרית ללימודי organogenesis.

מערכת אישית איבר תרבות, כגון זה vivo לשעבר droplet מערכת התרבות, מאפשרת לעצמאית ניתוח איבר שלם של השפעות מערכתיות, תוך התרת מניפולציה של מסלול איתות ספציפי או אינטראקציות הסלולר באמצעות תוספת של חומרים כימיים או נוגדנים תרופתיים. באופן מסורתי, המחקר של פיתוח איבר העוברי היה מוגבל לטכנולוגיות מהונדסים ועכבר נוקאאוט, בנוסף לחומרים כימיים תרופתיים נמסרו אימהי. עם זאת, יש בעיות טכניות הכרוכות בטכניקות אלה וטיפולים בvivo; רוב החששות סובבים סביב תופעות של השפעה על איברים שונים בו זמנית אשר לעתים קרובות תוצאות קטלניות עוברי. חשש נוסף של מחקרי מניפולציה התפתחות עוברים פרמקולוגית הוא ההשפעה האימהית של תרופות על התפתחות עוברית ברחם (למשל, חילוף חומרים אימהיים של התרופה לפני שהוא מגיע לעובר) ואם ריאגנטים כזה יכול לעבור את מחסום השליה.

טכניקת תרבות איבר השלמה תיארהכאן הותאם מפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Maatouk et al. 2, שבו בלוטות מין העובר כל מודגרת בתרבויות טיפה זקופות vivo לשעבר. יתרון משמעותי אחד culturing בלוטות מין העובר הוא שמעכבי מולקולה קטנה יכולים בקלות לגשת לכל האיבר בדיפוזיה פשוטה. . DeFalco et al הראה כי ניצול vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה בשיתוף עם מעכבי מולקולה קטנה יכול לשמש כדי לחקור תהליכי איתות ואינטראקציות המתרחשות במהלך התפתחות בלוטת מין 3; תהליכים אלה יהיו קשים לבחון in vivo בשל אתגרים טכניים (למשל, מעבר של תרופות דרך השליה או הקטלני של איברים המשפיעים מרובים באמצעות גישות גנטיות או תרופתיות).

תרבות רביב היא לא רק שיפור בהיבטים מסוימים על בניסויים ברחם, אבל גם את זה הוא שיפור לעומת במבחנה ולשעבר viמערכות VO גם כן. השימוש בשורות תאים ללמוד המורפוגנזה קשה מאוד כי חסרים להם הסוגים השונים של תאים, חסרי רכיבים קריטיים מטריצה ​​תאית (ECM) המאפשרים את היווצרותה של אדריכלות איבר, ויכול להציג חפצים באיתות מפלים. למרות הנדסת רקמות עשתה שיפורים משמעותיים ביצירת פיגומי הדמית ECM, חוסר הידע לגביהם אותות נדרשים על ידי כל סוג תא בorganogenesis עושה את זה מאתגר לבנות מערכת איברים במבחנה. מערכות אחרות vivo לשעבר כבר הוקמו בעבר ללמוד organogenesis, או לייתר דיוק המורפוגנזה, והיו מוצלח מאוד עבור הדמיה חיה של איברי העובר באגרו 4, 5 Transwells, מסננים 6, ומטריצות פיגום אחרות 7,8. היתרון של מערכת תרבות הטיפה הוא שהיא מאפשרת המחקר של המורפוגנזה על ידי מתן האפשרות לניצול פחות חומרים כימיים, אשר often יקר, אלא גם נותן את מתח פן איבר, וזה חשוב ליכולות צמיחה ואיתות 9.

בעכבר, המורפוגנזה אשך ראשונית מתרחשת בין העוברית (E) בשלבי E11.5 וE13.5; שלבים אלה מהווים את חלון הזמן האופטימלי לבחינת גורמים המשפיעים על התמיינות מין ספציפי. בין התהליכים הקריטיים המתרחשים במהלך היווצרות אשך הדור של אדריכלות כבל אשך ויצירת רשת כלי דם אשך ספציפי הם. ניצול לשעבר מערכת תרבות אגל זה vivo כל איבר, אחד הוא מסוגל לשנות כלי דם זכר ספציפי ומעכבים המורפוגנזה אשך באמצעות מעכבי מולקולה קטנה שחוסם את הפעילות של הקולטנים לגורם גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF); שיפוץ של כלי דם בתיווך VEGF הוא קריטי להתפתחות אשכים 10-12. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בהצלחה לאיברים אחרים ויכולה למקד את הזמן ספציפיחלונות של פיתוח. כל הר ההדמיה האיבר מאפשרת ההדמיה של מבנים חיוניים, כמו גם שינויים מבניים וסלולריים כתוצאה מהממשל של מעכבים שונים. חשוב לציין, מערכת זו יש יתרון בכך שהחוקר יכול לעקוף תופעות בלבול פוטנציאליות מממשל תרופה אימהי או שיבוש מערכתי בin vivo אסטרטגיות גן ממוקד. כך, מערכת כולה תרבות אגל vivo לשעבר איבר זה יכול לשפר באופן משמעותי את היכולת להבין את יחסי הגומלין והאיתות שמתרחשים במיוחד באיברים מסוימים במהלך התפתחות עוברית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העכברים המשמשים במחקרים אלה היו CD-1 עכברים המתקבלים מצ'ארלס ריבר מעבדות. ניסויי תרבות קודמים גם בוצעו בזנים אחרים, כגון C57BL / 6J (מידע לא מוצג), אבל כל זן יכול לשמש. נשים בוגרות בהריון היו כ ישנות 2-3 חודשים והיו מורדמים באמצעות שאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם ופתיחת בית חזה בין שתי המדינות לפני הסרת עובר. עכברים שוכנו בהתאם להנחיות NIH, ופרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של המרכז הרפואי בית החולים של סינסינטי הילדים.

1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, ומנות

  1. הכן פתרון אתנול 70%. מים החיטוי deionized (להכנת תאי humidified ולהכנת פתרונות / דילול). לעקר כלים לנתיחה (מלקחיים, מספריים, ו -27 מזרקים מחט G) על ידי ריסוס למטה עם 70% אתנול.
  2. הכןמלוח 10X נאגר פוספט (PBS) המכיל סידן ומגנזיום (80 גר 'NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גר' Na 2 4 HPO, 2.4 גרם KH 2 PO 4, 6.75 מיליליטר של 1 M CaCl 2, 3.75 מיליליטר של 1 M MgCl 2 ). מערבבים להתמוסס במי autoclaved סטרילי 1 ליטר ואז לסנן עם נייר סינון. לדלל פי 10 עם מים כדי להפוך 1X PBS.
  3. חום להשבית בסרום שור עוברי (FBS) על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולסנן לעקר עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
  4. הכינו 38 מיליליטר בינוני 1X תרבות השלמה (המכונה DMEM המלא, cDMEM), בהיקף של הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM), 10% מסוננים דילול FBS חום מומת ו1/100 של מניית פניצילין, סטרפטומיצין. זה בדרך כלל יש להשתמש טרי, אבל יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 חודש.
  5. מחדש VEGFR טירוזין קינאז מונעי השני (TKI II) בDMSO לריכוז מניות של 5 מ"ג / מיליליטר, ולדלל מניות עם cDMEM לעשות פתרון עובד. קון הסופיcentration למחקר זה הוא 1.875 / מיליליטר מיקרוגרם בcDMEM. על פי ההמלצות של החברה, פתרונות מניות יציבים לתקופה של עד 6 חודשים ב -20 ° C. באשר לפתרונות עבודה, לעשות טרי ולהשתמש בו ביום.
    הערה: הריכוז של תרופה זו בפתרון עובד צריך להיות פי שתיים גבוהים מהריכוז הסופי הרצוי (שכן הוא יהיה מדולל כפול בטיפה). במקביל, להכין את אותו הנפח של cDMEM המכיל את אותו הנפח של DMSO לטיפול "השליטה".
  6. הכן את חומרים כימיים עיכול זנב (50 מ"מ NaOH 1 M וטריס-HCl [pH 8.0]) בנפרד במים מזוקקים.
  7. הפוך 25 מיקרומטר מניות של פריימרים XY PCR (XY קדימה 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'וXY הפוך 5'-CCG CTG המרכז לאמנות עכשווית AAT TCT TTG G-3') יחד במי nuclease חינם.
  8. הכן חיץ 50X טה (242 גר 'Trizma בסיס, 57.1 מיליליטר קרחוני חומצה אצטית, Fi L 100 מ"ל מים 0.5 M EDTA, pH 8.5, ולהוסיף עד 1נפח סופי). הכן חיץ ריצת 1X טה (20 מיליליטר 50X טה מדולל במים לL 1 נפח כולל).
  9. כדי ליצור פתרון 2.5% agarose (0.625 agarose גרם, 0.5 מיליליטר 50X טה מאגר, 24.5 מיליליטר מים), פתרון agarose חום במיקרוגל עד רתיחה, ולאחר מכן לתת מגניב עד בערך 55-65 מעלות צלזיוס (מסוגל לגעת). ברגע מגניב, להוסיף 2 μl של 1% פתרון ברומיד, ויוצקים ג'ל.
    זהירות! ברומיד הוא mutagen וטךטוגן; אנא השתמש בכפפות nitrile ופרוטוקול בטיחות נאותה בעת טיפול. לחלופין, ניתן להשתמש בחומרים אחרים שעלולים להיות פחות רעילים ג'ל פתרון או צבעים.
  10. הכן פתרון חסימה (PBS עם 0.1%-100 X, 10% בסרום שור עוברי טריטון [FBS], ו -3% אלבומין בסרום שור [BSA]) לimmunofluorescence.
  11. הכן פתרון כביסה (PBS עם 0.1% Triton X-100, 1% FBS, וBSA 3%) לimmunofluorescence.
  12. הכן PBTx (PBS עם 0.1% Triton X-100) לimmunofluorescence.
  13. הכן את תאי דגירה למ"קlture. מלא מנות גדולות פטרי (100 מ"מ קוטר) עם 35 מיליליטר מים autoclaved. הנח ליד המקום שבי נתיחה ותרבויות תבוצענה.

2. בידוד של העובר אשכים ממאסכאלאס

  1. בדוק את נקבת העכבר לתקעי נרתיק בכל בוקר. בצהריים ביום שבו תקע הנרתיק מזוהה נחשבים E0.5. להרדים את נקבת העכבר בהריון בE11.5, באופן עקבי עם פרוטוקולי חיה אושרו.
  2. לרסס את בטן עכבר עם 70% אתנול.
  3. פתח את עור הבטן והצפק עם חתך בצורת V באמצעות מספריים קנס ולמשוך בחזרה דש של רקמה לחשוף איברים פנימיים.
  4. אתר את השחלות בשני הקצוות של קרן הרחם. בעזרת מספריים, לחתוך בשחלה ורקמת החיבור להפריד הרחם המכיל את העוברים מהגוף של האם.
  5. פתח את דופן הרחם בעדינות על ידי חיתוך בצד השני placentae, חושף את שקי החלמון. היזהר שלא puשק חלמון ncture להימנע עוברים מזיקים או לאבד.
  6. חותך ליד placentae להסיר את שקי חלמון מכיל עובר ולמקם אותם לתוך צלחת המכילה PBS עם סידן ומגנזיום. נוכחותם של יוני סידן ומגנזיום תעזור מולקולות הידבקות תא תמיכה כדי לשמור על מבנה רקמה ולמנוע את הרקמה להידבק לכלים לנתיחה.
  7. עם מלקחיים, להסיר את שק החלמון וamnion מהעובר על ידי ניקוב בזהירות את שק החלמון כדי ליצור חור שבעובר יכול להחליק החוצה. ברגע שהעובר הוא מחוץ לצק החלמון, חתך את חבל הטבור.
  8. מכאן ולהבא, השתמש במיקרוסקופ ממוקם בברדס רקמת סטרילית תרבות. הסר את הראש של עובר ולהשליך על ידי צובט עם מלקחיים בכל צד של צוואר.
  9. הסר את הזנב והמקום לתוך צינור microcentrifuge חדש לניתוח XY PCR כדי לקבוע מין של עובר.
    הערה: למרות שזה אופטימלי לבלוטות מין תרבות בהקדם האפשרי לאחר קציר, הוא גם קופהsible להסיר DNA זנב ולבצע genotyping XX / XY לפני התרבות, כך שיחסי המין של כל עובר ידוע ורק המין הרצוי צריך להיות מתורבת. בעוד genotyping נעשה, עוברים יכולים להישמר מופרדים (כך שהם יכולים להיות במעקב) על 4 מעלות צלזיוס או על קרח עד מוכן לתרבות. אזהרה אחת היא שתקופה זו בתנאים מחוץ הרחם או תרבות פוטנציאלית עלולה להשפיע כדאיות לתרבות או ההתפתחות הבאה בתרבות.
  10. אבטח את העובר במצב שכיבה נגד תחתית צלחת התרבות על ידי מצמיד בתי השחי של עובר עם זוג אחד של מלקחיים (בדרך כלל המלקחיים שנערכו ביד החלשה). לשמור המלקחיים האלה במקום להחזיק את העובר עדיין בתהליך לנתיחה כולו.
  11. עם זוג מלקחיים אחר, להסיר בטן עור מכסה בעדינות להסיר כבד, מעיים, ואיברים אחרים כדי לחשוף גב קיר גוף.
  12. כבלוטות המין יהיה ממוקמים על קיר הגוף בחזרה בכל צד של אב העורקים הגב,כלי דם גדולים רצו לאורך קו האמצע של הגוף, לגרוף מתחת לרכס ואברי המין עם מלקחיים סגורים ולהסיר את הרכס ואברי המין על ידי פתיחת המלקחיים ומרימים. כבלוטות המין יהיו מחוברים לקיר באופן רופף, להיזהר שלא למשוך מהר מדי מבלי להסיר קשרים אלה או בלוטות המין יכול למתוח, גרימת נזק לאיברים.
  13. הזז את הרכס ואברי המין לcDMEM בצלחת להסתגל רקמה לתקשורת.
  14. הפרד את בלוטת מין מורכב-כליה בינים משאר הרכס ואברי המין באמצעות 27 מחטי G. השתמש במחט אחת לחתוך על ידי לחיצה, ולהשתמש האחרים כדי להנחות את הרקמה בצורה נכונה כדי לאפשר הפרדה אופטימלית. הימנע משימוש בתנועת ניסור נגד תחתית הצלחת, כמו מחטים חדות ייצרו רסיסים של פלסטיק שיכול להיצמד לרקמה. הקפד לשמור הכליה בינים מחוברים לבלוטת המין לחלוטין.

3. Culturing של בלוטת מין עם מונעי קטנה-מולקולה

  1. להגדיר שני 20 μטפטפות l 15 μl כל אחד. חותך על 1-2 מ"מ מאחד הטיפים פיפטה המחסום באמצעות סכין נקי, מעוקר גילוח להעברת בלוטות המין ובנוסף השליטה cDMEM, בעוד פיפטה האחרות תשמש אך ורק לcDMEM טיפול תרופתי.
  2. בשורה בלוטות מין עם מקביל לציר הארוך שלהם לקצה פיפטה, כך שניתן בקלות להיות pipetted באמצעות הקצה החתוך. היזהר של בלוטות מין דבק הפנימי של קצה פיפטה.
  3. תווית צד אחד כטיפת שליטה ואחר כאגל המכיל סמים. רק שתי טיפות יכולות להתאים במכסת צלחת 35 מ"מ. ודא כי תוויות על עפעפיים להתאים את התוויות על צינורות microcentrifuge זנב המכיל רקמות.
  4. 15 μl פיפטה של ​​cDMEM מכיל בלוטת מין יחידה לאגל במכסה של צלחת קטנה (35 מ"מ) תרבות (להשתמש רק בעפעפיים, כתחתית היא גבוהה מדי כדי להתאים בתוך תא צלחת פטרי humidified). fr מניחים שתי טיפות המכילה בלוטת מין נפרדת בכל צד של הצלחת, מופרד היטבאום עוד אחד. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שבלוטות המין הועברו לטיפין.
  5. לאגל כאזור השליטה, להוסיף 15 μl נוסף של cDMEM מכיל DMSO (שנעשה בשלב 1.5) כדי להפוך את אגל בהיקף כולל של 30 μl. השתמש רק בפיפטה "השליטה" שלא לפנות לסמים.
  6. לאגל האחר (לדוגמא טיפול תרופתית), להוסיף 15 μl של cDMEM TKI-II המכיל לעשות טיפה בהיקף כולל של 30 μl. השתמש רק בפיפטה המיועדת לדגימות שטופלו תרופתיות.
  7. באמצעות פיפטה, פרוש טיפות בתבנית עגולה הרחבת עד שהם כ 15-18 מ"מ בקוטר ובלוטת המין ממוקמת בערך באמצע. כוון את בלוטת המין, כך שהוא שוכב על צדו ובלוטת המין והכליה בינים בקלות להבחין. כוון את הריאות, כך ששתי האונות שכבו.
    1. למרות קוטר טיפה עשוי להשתנות מעט, לוודא שבלוטות מין אינן צפהז ומוחזק במקום על ידי מתח פנים. ודא כי טיפות לא נוגעים זה בזה או בצד של המכסה. ללא המתח הפנים, האיברים יגדלו על המכסה במהלך התרבות ולשטח, ובכך לעוות מורפולוגיה איברים.
  8. בזהירות להניח את המכסה צלחת התרבות המכילה טיפות זקופות על פני השטח של המים בצלחת הגדולה (100 מ"מ) מכשיר האדים. ודא שאין בועות לכודים מתחת לחלק התחתון של המכסה ושהוא שוכב על פני המים. לא להפוך את המכסה ולהיזהר לא לתת לכל מים לגעת בחלק העליון של המכסה שבו הטיפות נמצאות.
  9. כדי ליצור תא קטן, humidified, מייד לכסות עם המכסה של צלחת מכשיר אדים הגדולה יותר כדי להקיף את תרבויות בלוטת המין. לפעול במהירות אפשרית כדי למזער את האידוי של תקשורת. ודא שיש לו את הצלחת קטנה יותר חדר בינו ואת המכסה של הצלחת הגדולה יותר כדי לנוע בחופשיות; אחרת, עיבוי עלול להפוך חותם ובחילופי אוויר מנעול לרקמות.
  10. ברגע ששני מכסים קטנים ממוקמים לתוך התא, מקום מייד הקאמרית לתוך החממה. דגירה תרבויות אגל במשך 48 שעות בCO 2 באינקובטור humidified על 37 מעלות צלזיוס.

תגובת שרשרת פולימראז 4. לקביעת המין של עוברים

  1. הוסף את הזנבות העובריים לתחתית צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
  2. הוסף לכל צינור 200 μl של 50 מ"מ NaOH.
  3. מניחים על 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או עד שהוא נמס לגמרי רקמה.
  4. הוסף 50 μl של 1M טריס-HCl ומערבולת קל וקצר.
  5. בתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, להפוך את תמהיל אב PCR טרי על ידי הכפלת כל כרך במספר הכולל של דגימות: 0.5 μl 25 מיקרומטר פתרון פריימר, 2.5 μl 10X תקי מאגר, 0.5 μl 10 מ"מ dNTPs (נוקלאוטידים), 19.3 μl nuclease- מים חופשיים, 0.2 DNA פולימראז תקי μl. מערבבים היטב.
  6. להוסיף 23μl של תמהיל אב PCR לPCR צינורות המכילים lysate 3 μl של זנבות מתעכלים.
  7. צינורות פליק לערבב אותם, ולאחר מכן לבצע ספין קצר להביא דוגמאות לחלק התחתון של הצינור.
  8. הפעל XY תכנית (הקצר) PCR (טבלת 1).
  9. טען את הדגימות (עם צבע 5x) וסולם ב-2.5% agarose ג'ל חיץ 1X טה.
  10. הפעל את ג'ל אלקטרופורזה agarose עד ניתן לפתור להקות XX וXY.
  11. תמונת ג'ל עם אור UV ולכידת תמונה.
  12. נתח את כרומוזום X-הספציפי לעומת להקות כרומוזום Y-ספציפי (כרומוזום X = 331 זוגות בסיסים [נ"ב] וXY = 302 נ"ב) 13; XY דגימות (זכר) תהיה שתי להקות של 331 ו- 302 נקודות בסיס, ואילו XX דגימות (נקבה) תופיע כלהקת 331 נ"ב יחידה.

5. Immunofluorescence הר איברים שלם

יום 1:

  1. הסר את בלוטות המין מהתרבות באמצעות פיפטה 1000 μl עם קצה חתוך. אם תרצה, הם יכולים להיותהניח בצלחת של PBS כדי לשטוף את התקשורת וחומרים כימיים. הנח לPBS בצינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge. גודל הצינור הקטן יותר לחסוך בחומרים כימיים ולהפוך אותו קל יותר לעקוב אחר דגימות בצינור.
    1. הקפד לשמור על שליטה ודגימות שטופלו, כמו גם דגימות XX וXY, בצינורות נפרדים ולהסיר אותם מתרבות עם סטים נפרדים של טפטפות, כדי למנוע זיהום פוטנציאלי לתרופה.
  2. שטוף את בלוטות המין פעמיים עם PBS. בנקודה זו, פרוטוקול זה יכול להשתמש 1X PBS חסר סידן ומגנזיום. לשטוף אותם, לאפשר לבלוטות המין לשקוע לתחתית של התחתית (על ידי כוח הכבידה) ולאחר מכן להסיר את הנוזל מעל. היזהר שלא לאבד את בלוטות מין על ידי pipetting קרוב מדי אליהם.
  3. להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מהצינור. הוסף 250 μl של paraformaldehyde 4% PBS המכיל 0.1% Triton X-100, ולתת דגירה O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה. לחלופין, קיבעון זה יכול להיעשות לשעה 2 ב 4 ° C על כיסא נדנדה. זהירות! Paraformaldehyde הוא חומר רעיל, כך לעקוב אחרי פרוטוקול בטיחות בעת הטיפול.

יום 2:

  1. יש לשטוף את בלוטות המין פעמיים בPBTx μl 250 ב RT.
  2. שטוף את בלוטות המין 3 פעמים עם 250 μl PBTx במשך 10 דקות כל אחד ב RT על כיסא נדנדה.
  3. לחסום את בלוטות מין שעות לפחות 1 ב250 μl חסימת פתרון ב RT על כיסא נדנדה.
  4. להכתים את בלוטות המין O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה ב250 μl נוגדן ראשוני בדילול מלא בפתרון חסימה.

יום 3:

  1. יש לשטוף את בלוטות המין פעמיים ב250 פתרון כביסה μl.
  2. שטוף את בלוטות המין 3 פעמים עם פתרון כביסה 250 μl במשך 10 דקות כל אחד ב RT על כיסא נדנדה.
  3. לחסום את בלוטות המין שעה 1 ב250 μl פתרון חסימה ב RT על כיסא נדנדה.
  4. מכסה את צינור microcentrifuge עם נייר אלומיניום כדי להגן נוגדנים משני ניאון מהאור.
  5. דגירה בלוטות המין 2-4 שעות ב RT על arocker ב250 נוגדנים משני μl המדולל בתמיסה המכילה חוסם Hoechst 33342. לחלופין, לבצע נוגדנים משני וHoechst 33342 O דגירה / N ב 4 ° C על נדנדה.
  6. יש לשטוף את בלוטות המין פעמיים ב250 μl PBTx.
  7. שטוף את בלוטות המין 3 פעמים ב250 μl PBTx במשך 10 דקות כל אחד ב RT על כיסא נדנדה.
  8. באמצעות קצה פיפטה חתוך, להעביר בלוטות מין לשקופית עם נוזל מינימאלי. הסר נוזל עודף עם פיפטה, אבל לוודא שהרקמה לא להתייבש.
  9. כוון את בלוטות המין באופנה רצויה עם מלקחיים, ולהוסיף במהירות ירידה של תקשורת הרכבה להר בלוטות המין בשקופית. ודא מעילי תקשורת הרכבה כל הדגימות לחלוטין; זה קריטי כדי למנוע לתת דגימות להתייבש.
  10. coverslips שימוש (בסגנון מספר 1.5) בגודל מתאים כדי לכסות בעדינות דגימות. בואו התפשטות תקשורת הרכבה לפנות את כל פני השטח של coverslip. במידת צורך, מאוד קל ללחוץ על הפינות של coverslip כך שאין בועות אוויר גדולות.
  11. לאטום את השקופיות עם לק ברור בקצוות כדי להפחית אידוי של תקשורת ההרכבה. חנות רכובה שקופיות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרבות אגל vivo לשעבר מאפשרת לתמרן איברים שלמים, כגון בלוטת המין, ללמוד אינטראקציות ודינמיקה סלולריות. איור 1 מדגים בצורה צעד חכם כיצד להכין תרבות אגל האשכים E11.5. הצעדים הראשונים בפרוטוקול התרבות כוללים את ההסרה הראשונית של הרחם המכיל עובר מעכבר האמא (איור 1 א ו -1 B). לאחר הסרת הרחם מהאם, דופן הרחם היא לחתוך והעוברים שוחררו מצק החלמון לתוך PBS לנתיחה נוספת (איור 1 ג-ה). לאחר הסרת האיברים פנימיים, הרכס ואברי המין נראה בב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מדגים שיטת vivo לשעבר איבר שלמה טיפה שיש יישומים פוטנציאליים רבים ללימוד התפתחות העובר. טכניקה זו יכולה לשמש לאיברים מרובים, ומאפשרת לחוקר לענות על שאלות ביולוגיות שקשה לבחון באמצעות in vivo גישות בשל חוסר נגישות של עוברים וקטלניים עובריים פוטנציאל. יש שיטה זו תרבות הטבות נוספות על אחר במבחנה גישות כגון שורות תאי יונקים: ניתן להשתמש בכל איברים, ולכן שמירה על יחסי גומלין בין תאית קריטית שנמצאים ברחם; ותרבות הנפח קטן מאוד (~ 30 μl), ולכן ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים נתמכו על ידי: מענק מחקר KIDS ללא סרטן, פרס מלגת המתחילים של מצעד הדימס בזיל או'קונור (#5-FY14-32), פרס מענק נאמן של המרכז הרפואי לילדים בסינסינטי (CCHMC); פרס חדשנות במחקר ומימון פיילוט של CCHMC; וקרנות פיתוח של CCHMC. המחברים גם מודים למעבדת קאפל על האופטימיזציה הראשונית של טכניקה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיותפישרברנד12-550-15
משקפי כיסוי: ריבועים (22 מ"מ x 22 מ"מ, מס' 1.5)פישרברנד12-541B
סאלי הנסן אקסטרים ללבוש לק, בלתי נראהסאלי הנסן
8 רצועות 0.2 מ"ל צינורות PCR & כובעים שטוחים מנותקיםGeneMateT3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2LGilsonFA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 מלקחייםFST91150-20
מספריים עדיניםFST91460-11
Posi-Click 1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהדנווילC2170
Posi-Click 0.6 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהדנווילC2176
10 μ l טיפים למחסום דיוק של SHARPדנווילP1096FR
20 μ l טיפים למחסום דיוק של SHARPדנווילP1121
200 μ l טיפים למחסום דיוק SHARPדנווילP1122
1,000 μ l SHARP Precision Barrier TipsDenvilleP1126
מזרק 1 מ"ל עם 27 מחטים מדBD PrecisionGlide309623
מזרק 10 מ"לBD305559
0.2 μ מסנן מזרק M PESVWR28145-501
דרגה 3 נייר סינון איכותי כיתה סטנדרטית, מעגל, 185 מ"מWhatman1003-185
Primaria 35 מ"מ Easy Grip Style צלחת תרבית תאיםפלקון/קורנינג353801
צלחות פטרי, סטרילי (100 מ"מ x 15 מ"מ)VWR25384-088
ניו ברונסוויק גלקסי 14 S CO2EppendorfCO14S-120-0000
ארון בטיחות ביולוגיתNuareNU-425-400
מיני צנטריפוגה פישר סיינטיפיק05-090-100
BioExpress GyroMixer משתנה XLGeneMateR-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler עם לוח בקרהEppendorf950040015
SMZ445 סטריאומיקרוסקופNikonSMZ445
MultiImage Light Cabinet עם תוכנת AlphaEaseAlpha Innotech Corporationהופסק
הוכחה מוחלטת 200 אתנולפישרBP2818-500
טריטון X-100פישרBP151-100
נתרן פוספט (דיבאסיק MW 142) Na2HPO4FisherS374-1
אשלגן פוספט (מונו-בסיסי MW 136) KH2PO4Sigma-AldrichP5379-1KG
נתרן כלורי (NaCl)פישרS671-3
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא-אולדריץ'P3911-1KG
מגנזיום כלוריד (MgCl2)SigmaM2393-100g
סידן כלורי (CaCl2)SigmaC5670-100g
אמביון טכנולוגיות חיים ללא נוקלאזAM9938 
פריימר XY PCR IDTN / A
חומצה אצטית קרחוניתפישרA38-500
אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (EDTA)פישרBP2482-1
1% תמיסת אתידיום ברומידפישרBP1302-10
אגרוזGeneMateE-3120-500
נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אולדריץ'367176-2.5 ק"ג
Trizma בסיסSigmaT1503-1KG
dNTP סט, 100 מ"מ פתרונותThermo ScientificR0182
DNA Choice Taq פולימראז עם 10x מאגרדנווילCB-4050-3
פרפורמלדהידפישרO4042-500
FluorMount-GSouthern Biotech0100-01
מימן כלורי ( HCl)FisherA144212
סרום בקר אלבומין (BSA), אבקה, Fraction V, בידוד הלם חוםBioexpress0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies11965-092
סרום בקר עוברי (FBS), משולש 100 ננומטר מסונןפישר03-600-511השבתה בחום לפני השימוש
בפניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)Life Technologies15140-122שימוש ב-1:100
דימתיל סולפוקסיד (DMSO), Hybri-max, סיגמאD2650
VEGFR מעכב טירוזין קינאז II - CAS 269390-69-4 - CalbiochemEMD Millipore676481
Rabbit Anti-Sox9 נוגדןMilliporeAB5535שימוש בדילול: 1:4,000
חולדה נגד עכבר PECAM1 (CD31) נוגדןBD Pharmingen553370שימוש בדילול: 1:250
ארנב שסוע Caspase-3 (ASP175) איתותתאי9661Sשימוש בדילול: 1:250
חולדה E-cadherin / CDH1 נוגדן (ECCD-2)Life Technologies13-1900שימוש בדילול: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrateInvitrogen (בדיקות מולקולריות)H1399שימוש ב-2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch712-165-153שימוש בדילול: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch712-605-153שימוש ב דילול: 1:500
נוגדן משני נגד ארנב חמור IgG (H+L), אלקסה פלואור 555 מצומדLife TechnologiesA31572שימוש בדילול: 1:500
נוגדן משני נגד ארנב חמור IgG (H+L), אלקסה פלואור 488 מצומדLife TechnologiesA21206שימוש בדילול: 1:500
נוגדן משני נגד חולדות חמור (H+L), אלקסה פלואור 488 מצומדLife TechnologiesA21208שימוש בדילול: 1:500
נוגדן משני נגד ארנב חמור IgG (H+L), Alexa Fluor 647 ConjugateLife TechnologiesA31573שימוש בדילול: 1:500
רעיל נוגדן

מקורות

  1. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
  2. Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
  3. DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
  4. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
  5. Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817(2014).
  6. Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641(2014).
  7. Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979(2012).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).
  10. Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
  11. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
  12. Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
  13. Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
  14. Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
  15. Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
  16. Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
  17. Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
  18. Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
  19. Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
  20. Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
  21. Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
  22. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
  23. Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית טיפות Ex Vivoדיסקציה של איבר עובריטכניקת טיפה אנכיתמיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציהמעכב מולקולות קטנותעיצוב מחדש של כלי דםמורפוגנזה של האשכיםקומפלקס Gonad Sphsמנדף לתרביות רקמה
שימוש
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.