מאמר שיטה

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

DOI:

10.3791/53280

⸱

14 בדצמבר 2015

 , 
1Department of Dermatology, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מקיף ומפורט כיצד ליצור עור אורגנוטיפי אנושי מהונדס גנטית מקרטינוציטים אפידרמליים ודרמיס אנושי נטול חיוניות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבויות organotypic לאפשר הכינון מחדש של סביבת 3D קריטית עבור אינטראקציות מגע תאי תאים ותא-מטריצה ​​אשר מחקה את הפונקציה ופיזיולוגיה של עמיתיהם בvivo רקמה. זה בא לידי ביטוי על ידי תרבויות עור organotypic שנאמנות מסכמת את בידול אפידרמיס ותכנית ריבוד. קרטינוציטים אפידרמיס אנושיים עיקריים הם גנטי מניפולציה באמצעות רטרווירוסים שבו ניתן ביטוי יתר בקלות או הפילו את הגנים. קרטינוציטים מהונדסים גנטי אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להתחדש האפידרמיס אנושי בתרבויות עור organotypic מתן מודל רב עוצמה כדי לחקור מסלולים גנטיים צמיחה להשפיע אפידרמיס, בידול, והתקדמות מחלה. הפרוטוקולים שהוצגו כאן לתאר שיטות להכנת עור אנושי חסר חיוניות, כמו גם לבחינה גנטית לתפעל קרטינוציטים אדם ראשיים, במטרה ליצור תרבויות עור organotypic. עור אדם מחדש ניתן להשתמש בdownstrיישומי EAM כגון פרופיל ביטוי גנים, immunostaining, וimmunoprecipitations הכרומטין אחרי רצף תפוקה גבוה. כך, דור של תרבויות עור organotypic אלה מהונדסים גנטיים יאפשר הקביעה של גנים שהם קריטיים לשמירה על הומאוסטזיס עור.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האפידרמיס האנושי הוא אפיתל מרובדת המתחבר לדרמיס הבסיס באמצעות מטריקס הידוע כהאפידרמיס zone.The הקרום במרתף לא רק משמש כמחסום בלתי חדיר כדי למנוע אובדן הלחות, אלא גם כקו הגנה ראשון כדי להגן על גוף מחומרים זרים ורעילים 1. שכבת הבסיס, המהווה את השכבה העמוקה ביותר של האפידרמיס, מכילה תאי גזע אפידרמיס ואב שיוצרים צאצאים המובחנים שמהווים את שאר האפידרמיס 2. כתאי אפידרמיס להבדיל הם נודדים כלפי מעלה כדי ליצור את השכבה הראשונה של תאים מובחנים הידועים כשכבת spinous 3. בשכבת spinous, תאים להפעיל את הביטוי של keratins 1 ו -10, אשר לאחר מכן לספק הכוח לעמוד בפני לחץ פיזי לשכבות מובחנות של האפידרמיס. כתאי שכבת spinous נוספים להבדיל, הם עוברים כלפי מעלה באפידרמיס למ 'שכבת גרגרים אשר מאופיינת על ידי ההיווצרות של גרגרי keratohyalin ושבשבת כמו גם חלבונים מבניים שהם התאספו מתחת קרום הפלזמה. כמו התאים להמשיך בתהליך ההתמיינות, החלבונים מתחת קרום הפלזמה הם צלב מקושרים זה לזה בזמן שגרגרי שבשבת נמתחים מהתאים ליצירת שומנים מחסום עשיר נקרא השכבה קרנית 4.

מחלות שקשורים לשינויים בצמיחת אפידרמיס והשפעת בידול ~ 20% מהאוכלוסייה 5. לפיכך, הבנת המנגנונים של תהליך זה היא בעל חשיבות רבה. מאז גילוים של רבים ממחלות אלה מותנה קשר תאי תאים או תא-מטריקס, תרבויות organotypic בי האפידרמיס האנושי מחדש בסביבת 3D נוצרו 6-10. שיטות אלו בדרך כלל כרוכות בשימוש בקרטינוציטים ראשוניים או הפכו זרע על מטריקס כגון אדם חסר חיוניותדרמיס, Matrigel, או קולגן.

כדי להבין את מנגנוני רגולציה גן שהם חשובים בגדילה באפידרמיס ובידול, ניתן להשפיע קרטינוציטים גנטיים באמצעות וקטורי retroviral למציאה או ביטוי יתר הגנים בתרבות 2D ולאחר מכן מחדש ב3D. שיטות אלה היו בשימוש נרחב כדי לאפיין את הגנים מעורבים בגזע אפידרמיס והתחדשות עצמית תא אב ובידול, כמו גם התקדמות לגידולים 11-21. כאן, פרוטוקול מעמיק על איך לשנות ביטוי גנים בתרבויות organotypic אפידרמיס באמצעות רטרווירוסים מסופק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול העור האנושי נערך בהתאם להנחיות של אוניברסיטת קליפורניה, ועדת האתיקה של המחקר בסן דייגו. ניתן להשיג עור אדם מדגימות כירורגית שהושלכו או שנרכש מבנקי עור (בנק עור נזכר בטבלת חומר / ציוד). המיקום שבו העור נגזר מאו גיל של התורם אינו קריטי לניסוי עוד חלבוני אזור קרום במרתף (קולגן / laminin) בדרמיס אינם מושפלים.

1. הכנת עור אדם חסר חיוניות

  1. עם קבלת עור אנושי, הנח את הרקמה בשכונה תרביות הרקמה להפשיר (~ 3-5 דקות). בהתאם לגודל של העור, רקמות למקם מופשרים בצינור סטרילי חד פעמי 50 מיליליטר חרוטי או 125 מיליליטר בקבוק. הגודל האופייני של עור מבנק העור הוא 0.75 מ"ר.
  2. מלא את המכל 75% מלאים עם פניצילין וסטרפטומיצין 4x (עט / סטרפטוקוקוס) ב1x PBS. לנער במרץ לדקות ו -5 להיפטר מהנוזלים. חזור על פעולה זו 3 פעמים יותר.
  3. לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את הרקמה לצינור / בקבוק חדש ולהוסיף 4x הטרי עט / סטרפטוקוקוס / PBS למלא 75% מהמכל. דגירה את התערובת בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות כדי לאפשר את ההפרדה של הדרמיס מהאפידרמיס.
  4. בתנאים סטריליים, להשתמש במלקחיים כדי לקלף את העור מהעור. הדרמיס הוא לבן לחלוטין תוך האפידרמיס יהיה צביעה בהתאם לגזע של התורם (איור 1 א). מחק את האפידרמיס על פי הפרוטוקול של המוסד לטיפול ברקמות אנושיות.
  5. מניחים את העור בצינור או בקבוק ולשטוף אותו בעט / סטרפטוקוקוס 4x המדולל ב1x PBS עם טלטול נמרץ (5 שטיפות דקות ל4 פעמים). לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את הדרמיס לצינור / בקבוק חדש ב4x העט / סטרפטוקוקוס בדילול המלא 1x PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. ניתן לאחסן הדרמיס על 4 מעלות צלזיוס עד שנה.

2. גנטי שינוי קרטינוציטים

הערה: תאי פניקס amphotropic שימוש גדלו בתקשורת DMEM המלאה [DMEM + 10% בסרום שור (FBS) + עט / סטרפטוקוקוס העוברי] לייצר וירוסים להדביק קרטינוציטים אדם עיקריים. גני האריזה ויראלי, מקודדי חלבונים כגון איסור פרסום-Pol ומעטפה משולבים ביציבות לתוך הגנום של תאי הפניקס המאפשר לייצור וירוס כאשר transfected עם וקטור retroviral. ניתן transfected תאי פניקס עם יעילות גבוהה המאפשרת ייצור כייל נגיף גבוה. וירוס המופק מקו אריזה זה יכול להדביק גם מגוון גדול של תאי יונקים, כולל אדם.

  1. יום 1: היום לפני transfection, תאי זרע פניקס בצלחת 6-גם בצפיפות של 800,000 תאים לכל גם בתקשורת DMEM מלאה.
  2. יום 2: יום transfection, להשתמש בכל טוב 3 מיקרוגרם של וקטורי retroviral. Aliquot 3 מיקרוגרם של וקטור retroviral לתוך צינור 1.5 מיליליטר. להשתמש בשילוב של 100 μ; L DMEM בתוספת 6 μl של מגיב transfection לכל 3 מיקרוגרם של וקטור. מערבבים 6 μl של מגיב transfection עם 100 DMEM μl בצינור 1.5 מיליליטר. (וקטורי retroviral המשמשים מפורטים בטבלת ציוד / חומרים).
    1. דגירה של 5 דקות ומוסיפים את תערובת 106 μl לתוך הצינור מראש aliquoted המכיל 3 מיקרוגרם של וקטור retroviral. לערבב דגירה על RT למשך 30 דקות. להוסיף כל dropwise את התערובת היטב בכל תאי הפניקס.
  3. יום 3: היום לאחר transfection, להסיר את המדיה מתאי הפניקס ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת DMEM המלאה הטרי. באותו היום, זרע קרטינוציטים אדם עיקריים ל6-גם צלחות בצפיפות של 75,000 תאים בכל טוב. לשמור על קרטינוציטים במדיום סרום keratinocyte חופשי (KCSFM) עם אנטיביוטיקה (עט / סטרפטוקוקוס).
    הערה: קרטינוציטים אדם יסודיים נרכשו. ניתן לרכוש תאים ממגוון רחב של ספקים (המפורט בטבלת חומר / ציוד).
  4. יום 4: הריבשילו התקשורת מתאי פניקס transfected, אשר כעת מכילים חלקיקים נגיפיים. להעביר את התקשורת באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק (כדי להסיר את כל תאי פניקס זיהום) ומקום 2 מיליליטר על קרטינוציטים (מצופים ב75,000 תאים / גם היום קודם לכן: ראה שלב 2.3). להוסיף ברומיד hexadimethrine (5 מיקרוגרם / מיליליטר) לתקשורת כדי לעזור לתווך בתהליך ההדבקה. titers ויראלי הם ~ 1 x 10 7 TU / מיליליטר.
    1. ספין 6 הצלחות גם בצנטריפוגה XG 200 עבור שעה 1 ב RT. אחרי הספין, להסיר את המדיה המכילה וירוס ולשטוף את התאים פעם עם PBS 1x לפני הוספת KCSFM.
  5. יום 5: להדביק אותו אצווה של קרטינוציטים שוב כמו בשלב 2.4.
    הערה: בחר את קרטינוציטים באמצעות תרופה אם יש סמן לבחירה על וקטור retroviral ולהרחיב לשימוש בניתוח או יישומים כגון תרבויות organotypic במורד הזרם.

3. הגדרת תרבויות עור Organotypic

  1. לבנותקלטת organotypic מחומרים נפוצים שנמצאו במעבדה או הקלטות יכולה להיות מותאמת אישית עשתה דרך חנות ייצור מתכת (איור 2 א - ו). כדי להפוך קלטות אלה מצלחת תרבית רקמת 3.5 סנטימטר, להשתמש כויה להסיר כיכר 1.0 סנטימטרים X 1.0 סנטימטר ממרכז המכסה של צלחת 3.5 סנטימטר (איור 2 א-ב). האם זה בתנאים סטריליים.
    1. צרף יתדות כיכר לחלק התחתון של הקלטת (מכסה של 3.5 מנה סנטימטרים) באמצעות פולני ברור מסמר (איור 2 ג). לאפשר 5 דקות ללק להתייבש ולהפוך את הקלטת על כך שהוא מונח על היתדות מרובעות (איור 2 ד). מניחים את הקלטת לתוך צלחת 6 סנטימטר.
      הערה: כיכר יתדות ניתן לרכוש ממגוון רחב של אומנויות ומלאכות חנויות.
  2. הכן מדיום גידול keratinocyte (קג"מ) היווה 66% DMEM, 22% F12 של בשר חזיר, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 10% FBS, 2.67 מיקרוגרם / מיליליטר אדנין, 40 ng / ml הידרוקורטיזון, 10 רעל ng / ml כולרה, 4.94 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 1.36 ng / ml Triiodo-L-thyronine, 10 ng / ml EGF, ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר hydrochloride ציפרופלוקסצין. סנן את התקשורת דרך מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
  3. קח את הדרמיס מתוך העט / סטרפטוקוקוס 4x + פתרון PBS ולשטוף 2 פעמים בקג"מ ואז דגירה בקג"מ ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני השימוש.
  4. חותך את העור באמצעות אזמל 1.5 סנטימטרים X 1.5 סנטימטר חתיכות בגודל ולאחר מכן למקם על גבי קלטת organotypic. מניחים את העור עם החלק העליון של הדרמיס פונה כלפי מעלה. חלקיו העליונים של הדרמיס יהיה הצד שבא במגע עם קרטינוציטים (איור 1).
  5. מניחים את העור החתוך מראש על החור המרובע של קלטת organotypic עם הצד העליון של הדרמיס פונה כלפי מעלה (איור 3 א).
  6. הפוך את הקלטת כל organotypic מכילה הדרמיס על שימוש במלקחיים (איור 3). להפשיר את פתרון מטריקס על קרח. שימוש במחט ומזרק לצייר מתוך פתרון מטריקס לקלטת 100 μl. הוסף 5 טיפות לתחתית של הדרמיס (צד מבריק) ולנער מעט כדי להבטיח אפילו הפצה ברחבי הדרמיס (איור 3).
  7. לאפשר 5 דקות לפתרון מטריצה ​​סלולרית נוסף המסחרי לביסוס לחלוטין (איור 3 ג). לאחר התמצקות, להשתמש במלקחיים כדי להעיף את הקלטת בחזרה מעל. הוסף 4 מיליליטר של קג"מ לצלחת 6 סנטימטר.
  8. הנח 0.5-1,000,000 קרטינוציטים מהונדסים גנטי על קלטות organotypic מכילות הדרמיס (איור 3D).
    1. Trypsinize קרטינוציטים על ידי הצבת 4 מיליליטר של 0.05% טריפסין על צלחות 10 סנטימטרים למשך 5 דקות ולהרוות עם 4 מיליליטר של תקשורת DMEM המלאה.
    2. רוזן קרטינוציטים באמצעות hemocytometer ואז ספין למטה XG 200 במשך 5 דקות. תאי .5-1,000,000 גלולים (תלוי במספר התאים הזמינים) ב -90 μl של קג"מ ולמקם את כל התאים על גבי העור.
      הערה: חשוב לשים את אותו המספר של תאים בדרמיס באותו הניסוי על מנת להבטיח כי כל הבדלים ראו בעובי של האפידרמיס מחדש הוא לא בשל הבדלים במתחילים מספר תא. הצבה פחות מ -0.5 מיליון תאים בדרמיס יכול להוביל לריבוד ובידול העניים.
  9. שינוי תקשורת קג"מ בתרבויות organotypic בכל יום אחר. רקמת קציר 1-14 ימים לאחר ההנפקה של קרטינוציטים בדרמיס. ריבוד ובידול מלא של האפידרמיס מתרחש בדרך כלל לאחר היום 5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצעד הראשון ביצירת העור אנושי organotypic הוא להסיר את העור מהעור. הדגירה של השבועיים של העור על 37 מעלות צלזיוס ב4x העט / סטרפטוקוקוס / PBS צריכה לאפשר ההפרדה של הדרמיס מהאפידרמיס (איור 1 א). אם מפריד את האפידרמיס והדרמיס הוא קשה ואז למקם את הרקמה על 37 מעלות צלזיוס בעט / סטרפטוקוקוס 4x / PBS לעוד שבוע ולאחר מכן נסה שוב קילוף באמצעות מלקחיים.

אחד המפתחות להתחדשות עור אנושי בדרמיס חסר חיוניות הוא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מניפולציה גנטית בעור אנושי תרבויות organotypic מציעות יתרונות רבים ללמדה נפוצה 2D תאים בתרבית וכן מודלים של עכברים. תרבויות 2D חסרות שלוש אינטראקציות מטריצת ממדי תא-תא ותא-תאי נמצאות ברקמות ואיברים שלמים. גם מחקרים שנעשו לאחרונה מצאו הבדלים עצומים בין תאי סרטן העור תרבותיים 2D and 3D עם התאים בתרבית 3D מראים הרבה יותר דמיון ביטוי גנים לעור אנושי ראשוני גידולים 16. תרבויות עור organotypic אדם יש גם כמה יתרונות על פני מודלים עכבר. מודלים עכבר הם זמן רב ויקר להפקה, כמו גם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו הייתה supportedby האמריקאי למלחמה בסרטן אגודת מחקר החוקרים גרנט (RSG-12-148-01-DDC) ופרס CIRM יסוד הביולוגיה (RB4-05779).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עור אנושיניו יורק כבאים בנק עורhttp://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREPGIBCO15140-122
קווי תאי עוף החול אמפוטרופייםATCCCRL-3213
FUGENE 6 transfection מגיבPromegaE2691
Keratinocyte Media (KCSFM)Life Technologies17005042
DMEMGIBCO11995
Ham's F12Cambrex12-615F
FBSGIBCO10437-028
אדניןסיגמאA-9795
כולרה טוקסיןסיגמא  C-8052
הידרוקורטיזוןCalbiochem3896
אינסוליןסיגמא1882
EGFInvitrogen13247-051
טרנספרין SigmaT-0665
Ciprofloxacin HydrochlorideSerologicals89-001-1
צריבהBovie Medical CorporationAA01
MatrigelCorning354234
Keratin 1 נוגדןBiolegendPRB-149P
יתדות מרובעותאומנות ומלאכת יד
אנושית קרטינוציטים יילודיםATCCPCS-200-010
קרטינוציטים ילודים אנושייםיישומי תאים102K-05n
MSCV וקטור רטרו-ויראליClontech634401
LZRS וקטור רטרו-ויראליAddgene
pSuper.Retro.Puro וקטור רטרו-ויראליOligoengineVEC-PRT-0002 
הקסדימתרין ברומיד סיגמאH9268-5G
חנויות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
  2. Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
  3. Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
  4. Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
  5. Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
  6. Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
  7. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
  8. Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
  9. Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
  10. Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14(2013).
  11. Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
  12. Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
  13. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
  14. Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
  15. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
  16. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
  17. Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
  18. Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
  19. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
  20. Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
  21. Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
  22. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
  23. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  24. Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
  25. Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
  26. Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127(2013).
  27. Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
  28. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
  29. Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
  30. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים