מאמר שיטה

גאומגנטית שדה (GMF) וצמח אבולוציה: לחקור את ההשפעות של ביטול GMF ב

14.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53286

⸱

30 בנובמבר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences and Systems Biology, University of Turin, 2Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבדיקת ההשערה כי היפוך השדה הגיאומגנטי האפקטיבי (GMF) גורם לביטוי גנים דיפרנציאלי ומשנה את המורפולוגיה של Arabidopsis thaliana. מערכת מתומנת תלת-צירית של זוגות סלילי הלמהולץ שימשה ליצירת תנאי GMF הפוכים באופן מלאכותי בתא הגידול של הצמח.

תקציר

אחת תצפיות המגרה ביותר באבולוציה צמח הוא מתאם בין המופע של שדה המגנטי של כדור הארץ (GMF) היפוכים (או טיולים) וברגע של הקרינה של מכוסי זרע. זה הוביל להשערה כי שינויים בקוטביות GMF עשויים לשחק תפקיד בהתפתחות צמח. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק השערה זו על ידי חשיפת thaliana ארבידופסיס להתהפך באופן מלאכותי תנאי GMF. אנחנו השתמשנו במגנטומטר שלושה צירים ונתונים שנאספו שמשו לחישוב הגודל של GMF. שלושה ספקי כוח DC היו קשורים לשלושה זוגות סליל הלמהולץ ונשלטו על ידי מחשב כדי לשנות את תנאי GMF. צמחים גדלו בצלחות פטרי נחשפו לשני נורמלים והתהפכו תנאי GMF. ניסויי חשיפה שאם גם בוצעו. צמחים חשופים צולמו במהלך הניסוי ותמונות נותחו כדי לחשב אורך שורש ואזורי עלה. רנ"א הכל ארבידופסיס הופק וכמוניTime-PCR האמיתי (qPCR) ניתוחים בוצע על ביטוי גנים של CRUCIFERIN 3 (CRU3), protein1 תחבורת נחושת (COTP1), חיזור Responsive תמלול Factor1 (RRTF1), פה Superoxide Dismutase 1,, Catalase3 (cat3) (FSD1), Thylakoidal Ascorbate Peroxidase (TAPX), Ascorbate cytosolic Peroxidase1 (APX1), ו- D NADPH / נשימה חלבון מונואמין הפרץ (RbohD). ארבעה גני התייחסות שונים נותחו לנרמל את תוצאות qPCR. הכי טוב של ארבעה גנים נבחר והגן היציב ביותר לנורמליזציה היה בשימוש. הנתונים שלנו מראים בפעם הראשונה שיש היפוך קוטביות GMF באמצעות סלילי triaxial השפעות משמעותיות על גידול צמחים וביטוי גנים. זה תומך בהשערה כי היפוך GMF תורם לגרימת שינויים בהתפתחות צמח שעשוי להצדיק לחץ סלקטיבי גבוהה יותר, סופו של דבר מוביל לעמהאבולוציה Lant.

מבוא

השדה המגנטי של כדור הארץ (או באופן שקול השדה המגנטי של כדור הארץ, GMF) הוא גורם סביבתי שאין מנוס לכל יצורי חיים על פני כדור הארץ, ובכלל זה צמחים. GMF תמיד היה תכונה טבעית של כדור הארץ, ולכן במהלך אבולוציה, כל יצורי החיים חוו את פעולתה. גוף הולך וגדל של ראיות מראה כי GMF הוא מסוגל להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים 1. GMF אינו אחיד ויש הבדלים מקומיים משמעותיים בגודל והכיוון שלה על פני השטח של כדור הארץ. GMF בשטח של כדור הארץ מציג מגוון רחב של גדלים, החל מפחות מ -30 μT לכמעט 70 μT. GMF מגן על כדור הארץ והביוספרה מההשפעות הקטלניות של רוח שמש על ידי הסטה ביותר של החלקיקים הטעונים שלה באמצעות המגנטוספירה 2.

צמחים מגיבים לגירויים סביבתיים; ותגובות קלאסיות לגורמי א-ביוטי כגון אור וכוח משיכה היו לאתאר horoughly על ידי הגדרת התגובות שפנה אל האור וgravitropic מה שנקרא. מעט מאוד, או לא כלום, ידוע על המנגנונים של תפיסה ותגובות של צמחים לשדות מגנטיים, למרות שפע של מאמרים שפורסמו בנושא זה ולאחרונה בביקורת 1. בניגוד לשדה הכבידה, GMF השתנה באופן עקבי במהלך האבולוציה צמח ובכך מייצג את גורם לחץ אביוטי חשוב שכבר לאחרונה נחשב לכוח מניע פוטנציאל סופו של דבר תורם לגיוון ולשתול התפצלות 2. תהפוכות גאומגנטית (או טיולים) הם שינויים בקוטביות של GMF. במהלך החיים ההיסטוריה של כדור הארץ, היפוכי GMF התרחשו מספר פעמים. אלה חשפו את כדור הארץ לתקופות של כוח GMF המופחת במהלך כל מעבר קוטבי. חלק מהחברים העלו את השערת שתקופות מעברים אלה של כוח GMF הנמוך אולי אפשרו קרינה מייננת מהרוח השמש להגיע אל פני כדור הארץ, וכך גורמותלחץ עקבי באורגניזמים חיים, שיכול היה להיות חזק מספיק כדי לגרום לשינויים גנטיים סופו של דבר מוביל להתפתחות לשתול 2.

ניתוח מפורט של ניסויים המתארים את ההשפעות של שדות מגנטיים על צמחים מציג מספר גדול של דיווחים סותרים, המתאפיינים במחסור במנגנוני האינטראקציה biophysical מתקבלים על הדעת. ניסויים רבים הם פשוט לא מציאותיים, בעוד שאחרים חסרי השערה ניתנת לבדיקה וסופו של דבר, אינם משכנע 3. בשנים האחרונות, ההתקדמות ומעמדו של מחקר על ההשפעה של שדות מגנטיים על צמח נבדקו 2,4-11. לאחרונה, את ההשפעה של שדה המגנטי הן נמוך וגבוה כבר דנה ביסודיות 1, עם דגש מיוחד על מעורבותם של אירועי היפוך GMF במפעל אבולוציה 2.

האמצעי הישיר ביותר על מנת לבסס את ההשערה כי תהפוכות GMF להשפיע אבולוציה צמח היא לסנתז GMFהיפוך במעבדה על ידי בדיקת התגובה של צמחים לתנאי שדה מגנטיים רגילים והפוכים. כדי לבדוק את ההשערה, שנבנינו לכן מערכת triaxial מתומן הלמהולץ סליל-זוגות שדה מגנטי פיצוי (סלילי triaxial), אשר מסוגל להפוך בצורה מדויקת את תנאי GMF נורמלים.

השתמשנו thaliana ארבידופסיס כצמח מודל ובדקנו את ההשפעה של GMF התהפך על ביטוי גנים של כמה גנים חשובים: CRUCIFERIN 3 (CRU3), שמקודדת חלבון אחסון 12S זרע שהוא טירוזין-פוספורילציה ומדינת זירחון שלה היא מווסתת בתגובה לABA בזרעי thaliana ארבידופסיס 12,13; נחושת התחבורה Protein1 (COTP1), שמקודד חלבון superfamily תחבורה כבדה מתכת / ניקוי רעלים עם הפונקציה העיקרית באדמת רכישת Cu ופיתוח אבקת 14; ומגיב תמלול Factor1 חיזור (RRTF1),שמקודד חבר של תת-משפחת B-3 ERF (גורם תגובת אתילן) של משפחה גורם שעתוק ERF / AP2 שמכיל אחד תחום AP2 המאפשר שיתוף ההפעלה סינרגיסטי של מסלולי ביטוי גנים ומעניק סובלנות צלב לאביוטי ויוטיים מדגישים 15.

יתר על כן אנחנו גם ניתחנו חמישה גנים המעורבים בתגובות דחק חמצוני: Fe Superoxide Dismutase1, (FSD1), שמקודד אנזים cytoplasmic כי אנזימים ומהירות ממיר את אניון סופראוקסיד (O 2 -) ומים (H 2 O) למי חמצן (H 2 O 2) וחמצן מולקולרי (O 2) 16; Catalase3 (cat3), שמקודד ואנזים שמזרז את הפירוק של H 2 O 2 למים וחמצן 17,18; Thylakoidal Ascorbate Peroxidase (TAPX), שמקודד peroxidase תילקואיד chloroplastic שscavenges H 2 O2 19; Ascorbate Peroxidase1 (APX1), שמקודד peroxidase cytosolic שscavenges H 2 O 2 ומייצג את אחת מהמטרות הפוטנציאליות של שינויים לאחר translational בתיווכו של מולקולות נגזרות-NO 20; וD חלבון מונואמין פרץ הנשימה NADPH- (RbohD) שמקודד אנזים שיוצר O 2 - וממלאים תפקידים מרכזיים בויסות צמיחה, פיתוח ותגובות דחק בארבידופסיס 21.

המתודולוגיה שדה-ההיפוך שלנו מספקת את ההוכחה הראשונה שהיפוך GMF יכול לגרום לשינוי משמעותי בביטוי המורפולוגיה וגן של א ' שורשי thaliana ויורה. פרוטוקול זה מספק דרך חדשנית כדי להעריך את ההשפעה של היפוך GMF על מורפולוגיה צמח וביטוי גנים וניתן להשתמש בם כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של היפוך GMF בהיבטים אחרים של צמח התנהגות, ובכך להנחות את הדיון בrole של היפוך GMF על התפתחות צמח.

פרוטוקול

1. הגדרה של סלילי Triaxial

הערה: איור 1 מציג את סלילי triaxial משמשים כדי להפוך את GMF.

  1. הפעל את מגנטומטר שלושת הצירים, בדיקה שהוכנס לסלילי triaxial.
  2. הפעל את המחשב ולהפעיל את תוכנת מגנטומטר המאפשרת הנתונים שייגבו ממגנטומטר שלושה צירים.
  3. השתמש בערכי הרכיב שדווחו על ידי מגנטומטר כדי לחשב את הגודל של GMF. לדוגמא, עם ערכי מגנטומטר: Bx = 6.39 μT, על ידי = 36.08 μT, BZ = 20.40 μT לחשב עוצמת שדה של 41.94 μT באמצעות המשוואה הבאה: B = B + B GMF נוסף, שבו = (BX 2 + B נוסף על ידי 2 + BZ 2) ½ (כלומר, 41.9 μT בדוגמא.)
  4. הפעל שלושה ספקי כוח DC (טווח כפול: 0-8V / 5 א ו0-20V / 2.5A, 50W) כל אחד מחובר לשלוש couples של סלילי הלמהולץ ומחובר למחשב באמצעות חיבור GPIB (איור 1).
  5. מתחי סט של ספקי הכח ליצירת השדה מגנטי הרצוי עם וקטור שדה מגנטי הפוך. לדוגמא, עם B GMF כמו בשלב 1.3 ועם גודל הסליל של המכשור המתואר כאן, להגדיר את המתח לV x = 0.00 V, y V = 30.52 V, Z V = 0.00 V כדי ליצור תוצאה חדשה B = סלילי triaxial B + B = GMF (6.38, -36.08, 20.39) μT. כלומר, שדה חדש עם אותו הגודל כמו B GMF אבל מצביע לכיוון אחר.
  6. ודא תחום החדש עם תוכנת מגנטומטר באמצעות ההליך מתואר ב1.3.
  7. לחשוף צמחים לשני נורמלים והתהפך תנאי GMF באמצעות צלחות פטרי כפי שתואר בסעיף 2.
  8. לבצע ניסויי חשיפת זיוף על ידי שמירה על עוצמת השדה שווה ל| B GMF | ושמירההרכיב האנכי של השדה שווה לזה של GMF אבל שינוי הכיוון (כלומר, "צפון, מזרח או מערב") של הרכיב האופקי של השדה עם זרמים שווים בסלילי triaxial בהשוואה למצב היפוך שדה. עושה זאת על ידי שינוי המתח של הסלילים כמתואר ב 1.5.
    הערה: חשיפת זיוף זה פוסלה את חימום עדין פוטנציאלי או תופעות רטט משני הסלילים עצמם או מהאלקטרוניקה משמשת לשליטה על הסלילים.
  9. הפעל ניסויים כפולים סמיות ידי החלת תנאי שטח התעוורו מאנשי ביצוע שאר הניסויים ו / או לפרש את הנתונים.

2. הכנת צמח חומרים ותנאים לצמיחת צמח

  1. השתמשו בזרעי thaliana ארבידופסיס, אקוטיפ קולומביה 0 (Col 0), מקום אז לתוך צינור 1.5 מיליליטר ומשטח לעקר על ידי טיפול עם 5% (w / v) פתרון חומצה בורה ושל 0.02% (V / V) טריטון X-100 ב -80% אתנול (EtOH), במשך 10-12 דקות ב25-28 מעלות צלזיוס, עם רעד מתמשך. לאחר מכן לשטוף פעמיים עם 80% EtOH, לשטוף עם 100% EtOH ולבסוף לשטוף עם מים מזוקקים סטריליים.
  2. הכן 1 ליטר של Murashige ו -22 Skoog (MS) שונה בינוני על ידי הוספה: 2.297 גרם של MS (0.5 x MS סל תערובת מלח), 10 גרם סוכרוז, מים עד לdeionized L 1, pH 5.8-6.0 מותאמים עם KOH. להוסיף 16 גרם של אגר וחיטוי במשך 20 דקות, 120 מעלות צלזיוס.
  3. , לפני ההתמצקות לשפוך 80 מיליליטר של מדיום לכל אחת (120 x 120 מ"מ 2) צלחות פטרי רבועות. לזרוע זרעי שלושים סטרילי על צלחת, ואז לאטום צלחות עם סרט שעווה.
  4. Vernalize הצלחות אופקיים בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים כדי להגביר ולסנכרן נביטה, ולאחר מכן לחשוף צלחות פטרי לנורמלים או הפוך GMF.
  5. לחשוף זרעים בסביבה מבוקרת אקלים על 22 מעלות צלזיוס במצב אנכי בניסויים מקבילים הן בתוך סלילי triaxial ומחוץ לסלילי triaxialתחת לוח זמנים photoperiod של 8 שעות חושך ואור 16 שעות, באמצעות מנורות אדי נתרן (מ '220 x 10 -6 E -2 s -1). השתמש בסרט כחול ג'לטין לאור זרקורים כדי להפחית את המרכיב האדום של מנורות.
  6. לחשוף צמחים במשך 10 ימים לפני מיצוי RNA לשניהם רגיל (שליטה) ותנאי GMF היפוך (טיפול).
  7. לאחר חשיפה, לקחת תמונות של צלחות פטרי.
  8. השתמש בתוכנת ImageJ לחשב אזורי אורך שורש ועלים.
    1. בקצרה, למדוד את הצד של צלחת פטרי, לאחר מכן פתח את התמונה של צלחת פטרי ועל ידי שימוש באפשרות הקו "ישר" למתוח קו שבדיוק חוצה את צד הצלחת.
    2. בתפריט "לנתח" בחר "בקנה מידה שנקבע" והכנס את המרחק בפועל בתיבה "מרחק ידוע" (לדוגמא, 120 מ"מ), ואז להכניס את יחידת אורך (מ"מ); לבסוף לחץ על האפשרות "הגלובלית" לעשות הגדרות זמינות עבור כל המדידות.
    3. לרואורך לא, פעל בזהירות את הצורה של השורש באמצעות הכלי ביד חופשית. מדוד את האורך על ידי שימוש באפשרות "המדד" בתפריט "לנתח". המשך למדוד את כל השורשים בתמונה ולשמור את הקובץ לניתוחים סטטיסטיים נוספים.
    4. לאזור עלה, מהתפריט "התמונה" להשתמש באפשרות להתאים ולאחר מכן "סף צבע". בחר את העלה הבודד ובתפריט "לנתח" בחר "לנתח חלקיקים". שמור את מדידות פרט לניתוחים סטטיסטיים.

3. ארבידופסיס סה"כ RNA הפקה, כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) תנאי תגובה וצבעי יסוד לארבידופסיס

  1. לאסוף בנפרד 30 יורה ו -30 שורשים ומייד להקפיא בחנקן נוזלי. אז לטחון בחנקן נוזלי עם מכתש ועלי.
  2. לבודד RNA סך באמצעות ערכת טיהור וערכת טיפול RNase ללא DNase באמצעות manufacturההוראות של ER.
  3. לבדוק את האיכות וכמות מדגם באמצעות אלקטרופורזה ערכת ננו RNA וג'ל נימים על פי הוראות יצרן. לאשר את הכימות של RNA spectrophotometrically.
  4. השתמש 2 מיקרוגרם של רנ"א הכל ופריימרים אקראיים באמצעות ערכת cDNA ההפוך תמלול להשיג cDNAs הגדיל הראשון על פי המלצות היצרן.
  5. לבצע את כל הניסויים במערכת בזמן אמת באמצעות אני ירוק SYBR עם רוקס כתקן טעינה פנימי.
  6. בצע את התגובה עם 25 μl של התערובת המורכבת של 12.5 μl של 2x SYBR הירוק qPCR מיקס מאסטר, 0.5 μl של cDNA ו -100 ננומטר פריימרים. השתמש בצבעי היסוד המפורטים בטבלה 1. כלול בבקרת בקרות שאינם RT (באמצעות RNA הכולל ללא שעתוק לאחור כדי לפקח על זיהום הדנ"א הגנומי) ובקרות שאינן תבנית (מים במקום תבנית).
  7. חישוב יעילות פריימר לכל זוגות פריימרים באמצעות התקןשיטה עקומה 23.
  8. השתמש בתנאי PCR הבאים: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 40 מחזורים של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 58 מעלות צלזיוס, ו30 שניות על 72 מעלות צלזיוס; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, cat3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 40 מחזורים של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 20 שניות ב 57 מעלות צלזיוס, ו30 שניות על 72 מעלות צלזיוס.
  9. קראו הקרינה לאחר כל שלב חישול וסיומת. לכל הריצות, לבצע ניתוח עקום התכת 55-95 מעלות צלזיוס על ידי כולל מגזר דיסוציאציה בפרופיל התרמית. השתמש במסך העקום דיסוציאציה, לגשת דרך כרטיסיית התוצאות כדי להציג את פרופיל הניתוק (חלקה של הקרינה כפונקציה של טמפרטורה). ודא שבסיס הנתונים שנאספו במהלך מגזר הניתוק של הניסוי נבחר לניתוח באמצעות מסך ניתוח / התקנה.
  10. לקבוע lמגוון באוזנו של ריכוז תבנית לערך מחזור סף (ערך CT) על ידי ביצוע סדרה פי עשרה דילול (1 עד 10 3 -fold) באמצעות cDNA משלוש עקירות RNA עצמאיות ניתחו בשלוש חזרות טכניות 24,25.
  11. לנתח את כל חלקות ההגברה עם תוכנת מכשיר PCR בזמן אמת כדי להשיג ערכי ה- CT. כיול ולנרמל את רמות RNA ביחס לרמת גנים הטובים ביותר המשק כדלקמן: 3.11.1) גש להגברת מגרשי המסך באמצעות כרטיסיית התוצאות, בחר את הרמפה או רמה שלנתונים צריכים להיות מנותחות באמצעות המסך / התקנת ניתוח הבחירה, ולאחר מכן בחר את dRn (הקרינה מנורמלת מתוקן בסיס) מתפריט הקרינה בלוח הפיקוד. גש לפלייט ערכים לדוגמא מסך באמצעות כרטיסיית תוצאות להצגת ערכי ה- CT לבארות שנדגמו.
  12. השתמש בארבעה גני התייחסות שונים [למשל, דהידרוגנז glyceraldehyde-3-פוספט cytoplasmic, (GAPC2), specif היוביקוויטיןפרוטאז IC 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) ואלפא-למקטע גורם התארכות 1B 2 (eEF1Balpha2)] לנרמל את התוצאות בזמן אמת PCR. בחר את הדף המדורג גן באמצעות תוכנת ניתוח 26; ולהשתמש בגן ​​היציב ביותר לנורמליזציה.
    1. בקצרה, לארגן את נתוני קלט בגיליון Excel עם העמודה הראשונה מכילה את שמות הגן והשורה ראשונה מכילים את מדגם השמות. לאחר מכן בחר את תוכנת ניתוח מהתפריט בר. השתמש בתיבת הדו-שיח כדי לבחור את נתוני הקלט.
    2. לאחר מכן, בדוק את שדות שמות לדוגמא, שמות גן ופלט פשוט בלבד. לחץ על כפתור Go לבצע הניתוח. בחר את הגן המדורג העליון (שבו יש את הערך הקטן ביותר היציבות) כגן מועמד הביע ביותר ביציבות.
  13. נתונים עלילה על ידי הצגת שינוי הביטוי פי ההפרש בשני יורה ושורשים.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. הגעה נתונים כערכים ממוצעים ± סטיית תקן. השווה את שיתוףntrol וקבוצות הטיפול על ידי ביצוע ניתוח שונות (ANOVA) והמבחן של Tukey עם Bonferroni ומבחן דאן-Sidak הסתברות המתואמת (0.95% ביטחון).

תוצאות

המטרה של פרוטוקול זה היא לספק שיטה להעריך אם היפוך של השדה המגנטי של כדור הארץ (GMF) עשוי להשפיע על התפתחות צמח וביטוי גנים של 0. סלילי Triaxial Col אקוטיפ thaliana ארבידופסיס כפי שמוצג באיור 1 א משמש כדי להפוך את GMF כאשר קבוצה עם המתחים המתאימים כונן (איור 1), שהושג כמתואר בשלב 1.5 בפרוטוקול. הממדים של סלילי triaxial הם ~ 2 x 2 x 2 מ '3, אשר אפשרו מספיק מקום עם תנאי GMF הפוכים לארח כמה צלחות פטרי. בקרות גדלו באותם תנאים סביבתיים ובערכי GMF נורמלים. לאחר 10 ימים של חשיפה לנורמלית והתהפכו תנאי GMF, הפנוטיפ של צמחים הראה שינויים מורפולוגיים ברורים. כפי שניתן לראות באיור 2, צמחי שליטה (כלומר, גדלו בתנאים נורמלים GMF) הראו אורכי שורש עם Prob באופן משמעותי (מותאם דאן-Sidak וBonferroni <0.001;לא של התלמיד = 10.68, df = 31) ערכים גבוהים יותר (29.41 מ"מ; SEM = 1.04; N = 32) ביחס לצמחים שנחשפו לGMF ההפוך (17.53 מ"מ; SEM = 0.58; N = 36). בצמחים הפוכים-GMF, המורפולוגיה של יורה הייתה גם שינתה על ידי הצגת פיתוח מופחת של הרחבת עלון. צמחים שנחשפו לתנאים נורמלים הראו אזור עלה ממוצע של 4.95 מ"מ 2 = <0.001 (SEM 0.025, N = 54), ואילו צמחים שנחשפו לתנאי GMF הפוכים הראו באופן משמעותי (מותאם דאן-Sidak וBonferroni Prob; t של הסטודנט = 31.32, df = 53 ערכים) עלה נמוך אזור (3.71 מ"מ 2; SEM = 0.032; N = 54). לכן, חשיפה של ארבידופסיס לתנאי GMF הפוכים מושרה הפחתה באורך השורש ואזור עלה.

הרחבת העלה וצמיחת שורש תלויה בשני האגפים וההתארכות של תאים 27. לכן, התפתחות צמח, את הפרודוקטיביות ואת כושר כללי תלויות בארכיטקטורת שורש מערכת shoot- ואופטימלית 28. גודל אורך שורש ועלים המופחת של צמחים שנחשפו לתנאי GMF התהפכו להעיד על הנוכחות של מערכת חישה מסוגל לקלוט שינויים בעוצמת שדה מגנטי לא רק, אלא גם להגיב לשינויים ב" הכיוון "שדה המגנטי בהשוואה לכוח המשיכה. ההשערה כי היפוך GMF עשוי להשפיע גידול צמחים מוצאת ראיות משכנעות בניסויים שלנו, שמראים כי תנאי היפוך GMF יכולים להשפיע על התפתחות צמח באופן משמעותי.

השינויים מורפולוגיים גם לוו בשינויים בביטוי גנים. בין גני משק בית, הגן היציב ביותר היה התארכות הגורם 1B אלפא למקטע 2. הקבוצה הראשונה של גנים (CRU3, COTP1, RRTF1) הראתה שינוי דרמטי בביטוי גנים (איור 3). לירות ביטוי של כל שלושת גנים הוגדל באופן משמעותי (P <0.05) בכ 2.5 פי בצמחים חשופים למילואיםתנאי GMF ד. ביטוי שורש CRU3 היה שהוגברו בשורשים בצמחים שנחשפו לתנאי GMF נורמלים, אבל היה באופן משמעותי (P <0.05) downregulated בתנאי GMF הפוכים. ההפך נמצא עבור COTP1 וRRTF1, שdownregulated בתנאים נורמלים ושהוגבר בנוכחות היפוך GMF (איור 3).

Cruciferin (גלובולין S 12) הוא חלבון אחסון הנפוץ ביותר בזרעים של א thaliana וcrucifers האחר והוא מסונתז כמבשר בreticulum endoplasmic הגס. זה מועבר לאחר מכן לvacuoles אחסון חלבון 13. שתיל נביטה דורש הפירוט של cruciferin, המשמש כמקור ראשוני של חנקן. דאון-הרגולציה של cruciferin השפלה מפחית פיתוח עוברים על ידי פגיעה מבני תא או רכיבי תא פיתוח 29,30. התוצאות שלנו מראות שגברת ביטוי של CRU3 בקורלציה עםהתרחבות נמוכה עלה ואורך שורש מופחת, ובכך מצביע על כך שהגן הזה ברגישות להיפוך GMF וכי ביטוי יתר שלה עשוי לתרום להפחתה של התפתחות צמח. יתר על כן, היפוך GMF גורם downregulation משמעותי של CRU3 בשורשים, אשר בקורלציה עם אורך שורש מופחת. נחושת היא קו-פקטור חיוני לתהליכי מפתח בצמחים, אבל זה מפעיל השפעות מזיקות כאשר עודף; כך, ביתר תחבורת נחושת פוגע גידול צמחים. ההשפעה של היפוך GMF הייתה ביטוי יתר משמעותי של COTP1 בשני יורה ושורשים, דבר המסבירה את גידול צמחים המופחת. לחץ יון פוגע חילוף חומרים הכלורופלסט, אשר קשור בחוזקה למדינת חיזור של התא. בארבידופסיס RRTF1 גורם השעתוק חשוב לביטוי של גנים הקשורים ליכולת להתאים לחיזור משתנה 31. לכן, כאשר צמחים נחשפים לגירויים חיצוניים יכולים לשנות התפתחות הפיזיולוגית ותוכניות אל ביטוי יתר של גורם שעתוק חשוב זה צפוי. היפוך של GMF מושרה ביטוי יתר משמעותי של RRTF1 בשני יורה ושורשים, ובכך מצביע על תגובות חמצון גבוהות יותר לחץ של צמחים לתנאי GMF הפוכים.

תוצאות מעניינות מתקבלות על ידי ניתוח גני חמישה מעורבים בסטרס החמצונים. באופן כללי, כל הגנים שחולצו ונותחו ביורה לא הראו הבדלים משמעותיים (P> 0.05) כאשר צמחים גודלו בתנאים רגילים או הפוך GMF (איור 4 ואיור 5). עם זאת, את תקנה משמעותית תמיד נצפתה בשורשים של צמחים שנחשפו לתנאי GMF הפוכים. בפרט, cat3 הראה downregulation הגבוה ביותר (איור 5), ואחריו לפי סדר downregulation ידי APX1, FSD1, RBOHD וTAPX (איור 4).

סובלנות צלב מתח ביוטיים ויוטיים מסופק על ידי ההפעלה של גנים שונים המעורבים בכמה מסלולים ביוכימיים. גורם שעתוק RRTF1 מאפשר שיתוף ההפעלה סינרגיסטי של ביטוי גנים של מסלולים אלה 15,31, ויכול להיות מעורב פוטנציאליים בסטרס החמצונים 32. לכן, גברת ביטוי של RRTF1 צפוי כאשר הדחה חמצן מופחתת. Downregulation של אנזימי הדחה שורש בקורלציה עם גברת הביטוי של RRTF1, הפועל בתגובה לסטרס חמצונים מוגברים. Downregulation השורש הדרמטי של cat3, APX1 וTAPX מציין את היכולת המופחתת של תאי שורש כדי לחפש H 2 O 2, אשר מלווה ביכולת המופחת dismutate אניון סופראוקסיד ידי downregulation של FSD1. תגובות דחק חמצוני היא גבוהות יותר בשורשים, שנראה כאתר העיקרי של תפיסת GMF הפוכה.

GE = "תמיד"> figure-results-1
מערכת תגמול שדה המגנטית של כדור ארץ באיור 1.. () סלילי triaxial (הכוללים זוג סלילי מתומן לכל אחד משלושה צירים מאונכים) משמשים כדי להפוך את וקטור השדה המגנטי של כדור הארץ. (ב) אספקת חשמל מבוקר מחשב מחוברת לכל זוג סלילי הלמהולץ. (מתחים בנתונים אלה הם שרירותיים) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. השפעת היפוך שדה מגנטי של כדור ארץ על מורפולוגיה ארבידופסיס. אחרי עשרה ימים של חשיפה, צמחי שליטה (כלומר, אלו שנחשפו לתנאי GMF רגילים) מראים אורך שורש גדול יותר באופן משמעותי ויותר Expanעלוני ded בהשוואה לצמחים שנחשפו לתנאי GMF הפוכים. בר מטרי = 18 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3. השפעות של היפוך שדה המגנטי של כדור ארץ על ביטוי גני ארבידופסיס. אחרי עשרה ימים של חשיפה, RNA הכולל של שליטה וצמחים שטופלו הופק ונותח על ידי Real-Time PCR לניתוח ביטוי. ההשפעה של היפוך של GMF הייתה לגרום לשינוי דרסטי בביטוי גנים של כל הגנים שנבדקו CRU3, Cruciferin 3;. COTP1, נחושת התחבורה Protein1; RRTF1, חיזור תמלול Factor1 מגיב. ברים מצביעים שגיאה סטנדרטית; כוכביות מציינת (P <0.05) הבדלים משמעותיים בין plנמלים נחשפו לתנאי GMF הפוכים ונורמלים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4. השפעות של היפוך שדה המגנטי של כדור ארץ על ביטוי גנים הקשורים לנוגד חמצון ארבידופסיס. אחרי עשרה ימים של חשיפה, RNA הכולל של שליטה וצמחים שטופלו מבודד ומועסקים לניתוח ביטוי גנים באמצעות Real-Time PCR. ההשפעה של היפוך של GMF הייתה לגרום לשינויים משמעותיים בביטוי גנים לירות; עם זאת, downregulation דרסטית נצפה בביטוי גני שורש של צמחים הגדלים בתנאי GMF הפוכים TAPX, Peroxidase Ascorbate Thylakoidal;. APX1, Ascorbate Peroxidase1; FSD1, פה Superoxide Dismutase1; RbohD, NA. DPH / D חלבון הנשימה פרץ מונואמין ברים מצביעים שגיאה סטנדרטית; כוכביות מצביעות על הבדלים (P <0.05) משמעותיים בין הצמחים שנחשפו לתנאי GMF התהפכו ונורמלים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5. השפעות של היפוך השדה המגנטי של כדור הארץ בארבידופסיס Catalase 3 ביטוי (cat3) גן. אחרי עשרה ימים של חשיפה, RNA הכולל של שליטה וצמחים שטופלו מבודד ומועסקים לניתוח ביטוי גנים באמצעות Real-Time PCR. ההשפעה של היפוך של GMF הייתה לגרום לשינויים משמעותיים בביטוי גנים לירות; עם זאת, downregulation דרסטית נצפה בביטוי גני שורש של צמחים הגדלים בתנאי GMF הפוכים. ברים מצביעים Erro הסטנדרטיr; כוכביות מצביעות על הבדלים (P <0.05) משמעותיים בין הצמחים שנחשפו לתנאי GMF התהפכו ונורמלים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

לאחרונה הראו כי מתאם מדהים קיים בין היפוכי GMF והזמן שבו הסחת דעת של רוב השושלות משפחתי angiosperm התרחשה 2. עם זאת, למרות השערות המגרה והשפע של מחקרים על ההשפעה של עוצמות GMF מגוונות, בהנחה שההיפוך GMF עלול לגרום לעצמו לשינויים משמעותיים בביטוי גני צמח ומורפולוגיה מעולם לא הפגין. כאן אנו מראים בפעם הראשונה, שיטה המשתמשת בסליל הלמהולץ מתומן triaxial להפוך GMF במעבדה שלנו, ושההיפוך של השדה המגנטי הסביבה יכול לגרום לשינויים ואפנון של ביטוי גנים בצמחי פנוטיפי.

על מנת לקבל היפוך GMF (או שינוי) על נפח מספיק לניסויי גידול צמחים (2 x 2 x 2 מ '3), שנבנינו מערכת סליל הלמהולץ מתומן. מערכת זו אינה זמינה באופן מסחרי (בדרך כלל סלילי הלמהולץ טבעת בצורת יותר ויותר)ואת העלויות לבנייה היו ניכרות. חשוב לציין, מערכת זו מספקת שינוי שדה חזק, עם זמן-יציבות יוצאת דופן והומוגניות בשדות המגנטיים שונה.

המערכת תוכננה ונבנתה כדי להפחית את הערך של GMF לאלפית התנאים הרגילים או להפוך כל אחד משלושת הממדים של השדה המגנטי. עם זאת, העיצוב של הסלילים אינו מאפשר לייצר עוצמת שדה מגנטית גבוהה. לכן, מכשיר זה במתכונתו הנוכחית אינו מתאים לניסויים שנועדו להעריך את ההשפעה של עוצמת שדה מגנטית גבוהה בצמחים או אורגניזמים אחרים.

במעבדה, שינוי של GMF דומה לאלה שתוארו בשיטה זו הושג על ידי שיטות שונות, כולל מיגון על ידי הסובב את האזור הניסיוני על ידי צלחות פרומגנטי מתכת עם חדירות מגנטיות גבוהות, החורגת שדות מגנטיים ולרכז אותם במתכת עצמה. היתרון של שימוש בדואר סלילי הלמהולץ הוא שהמערכת מאפשרת צמחים להיחשף ליותר תנאים טבעיים (אור, זרימת אוויר, וכו '), ובכך הופך אותו אידיאלי לא רק ללימודים במבחנה (כמו בשימוש בצלחות פטרי), אלא גם לin vivo גידול צמחים וניסויי פיתוח. הממדים של המערכת שלנו ליצור מרחב המאפשר דיכוי עד <1 / ה -1,000 של GMF הטבעי לאורך 25 x 25 x 25 סנטימטר 3 נפח כדורי (ראה איור 1 א), ובכך מאפשרים לארח מספר צלחות פטרי או כמה קטנה סירים לגידול צמחים.

השיטה המוצגת כאן יושמה ללימודי ביולוגיה צמח; עם זאת, המערכת מאפשרת מגוון רחב של ניסויים, כולל ירולוגיה ומיקרוביולוגיה, כמו גם מחקרים על נמטודות (למשל, elegans Caenorhabditis), פרוקי רגליים ובעלי חיים קטנים (כוללים עכברים וחולדות). לכן, בדיקות של השערת היפוך זה של GMF הוא מסוגלכדי לגרום לשינויים מורפולוגיים ותעתיק גם יכולים להתארך עד רבות מערכות חיים אחרות, אולי סופו של דבר גם לתאים אנושיים.

GMF משתנה כל הזמן ומשתנה. לכן, בניסויים שלנו אתגר אחד גדול הוא לספק פיצוי קבוע של GMF על מנת לקבל את ערכי GMF החדשים הרצויים. זו יכולה להיות מושגת רק על ידי שליטה רציפה של ערכי שדות מגנטיים באמצעות קריאה של ערכי מגנטומטר ופיצוי מתח. לכן, המערכת יכולה לפצות חלק משתנה לאט של GMF אבל זה לא עושה כלום לתנודות בתדירות גבוהות יותר.

לסיכום, השימוש בסלילי triaxial להפוך את וקטור GMF סייע להוכיח כי היפוך זה של וקטור GMF הוא מסוגל לגרום לשינויים מורפולוגיים צמח וביטוי גני ההפרש. התוצאות שהתקבלו בשיטה שהוצגה לספק ראיות משכנעות לתמיכה בהשערה כי מחדש GMFversals אולי היה אחד הכוחות המניעים להתפתחות צמח על לוחות זמנים גיאולוגיים 2.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ל-MEM מהמחלקה למדעי החיים וביולוגיה של מערכות באוניברסיטת טורינו, איטליה. המחברים מודים ל-G. Gnavi על הסיוע הטכני במהלך חלק מהניסויים. CTR ממומן על ידי Wellcome Trust והחברה המלכותית (מספר מענק 098436/Z/12/Z).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגנטומטר תלת ציריברטינגטון Mag-03MCמגנטומטר שטף תלת-צירי
מגנטומטר ספק כוחברטינגטון Mag-03PSUמגנטומטר שטף תלת-צירי
תוכנת מגנטומטרBartington מגנטומטר שטף תלת-ציריMag03DAM
ספק כוח DC אג'ילנט טכנולוגיותE3642A
סידן היפוכלוריט סיגמא211389
טריטון X-100 סיגמאX100 
אתנול Sigma2860
GroLux מנורות אדי נתרן OSRAM Sylvania600W
RNeasy Plant RNA kit Qiagen74903
DNase נטול RNase Qiagen79254
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938B
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientificאינו זמין
ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה אפלייד ביוסיסטמס4368813
Mx3000PAgilent Technologies401512
2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix Fermentas International, IncK0221
ParafilmSigmaP7793-1EA
Murashige ו-Skoog Basal MediumSigmaM5519 
ריבוע צלחת פטרי (120x120 מ"מ2)סיגמאZ692344 

מקורות

  1. Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
  2. Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
  3. Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
  4. Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
  5. Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
  6. Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
  7. Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
  8. Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
  9. Pazur Galland, P., A, Magnetoreception in plants. J. Plant Res. 118 (6), 371-389 (2005).
  10. Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
  11. Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
  12. Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
  13. Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
  14. Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
  15. Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226(2014).
  16. Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
  17. Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
  18. Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
  19. Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
  20. Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
  21. Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
  22. Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  23. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
  24. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  25. Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
  26. Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
  27. Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
  28. Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
  29. Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
  30. Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
  31. Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
  32. Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCR

מאמרים קשורים