הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בתארו תקנה Dependent גורם שעתוק של transcriptome MicroRNA

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53300

⸱

15 ביוני 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology, Davidoff Cancer Center, Rabin Medical Center, 2The Center of Nanoscience and Nanotechnology, Tel Aviv University, 3Experimental Therapeutics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציעים אסטרטגיה לחקור את ההשפעה של גורם שעתוק מעניין על טרנסקריפטום המיקרו-RNA באמצעות נתונים זמינים לציבור, משאבים חישוביים ונתוני תפוקה גבוהה ממערכי מיקרו-RNA לאחר העברת תאים עם RNA קטן (sh)RNA המכוון לגורם שעתוק מעניין.

תקציר

בעוד תקנה שעתוק של גנים המקודדים חלבונים נחקרה בהרחבה, מעט מאוד ידוע על איך גורמי שעתוק המעורבים שעתוק של RNA ללא קידוד, במיוחד של מיקרו-רנ"א. כאן, אנו מציעים אסטרטגיה ללמוד את התפקיד הפוטנציאלי של גורם שעתוק בוויסות שעתוק של מיקרו RNA באמצעות נתונים זמינים לציבור, משאבים חישוביים ונתונים קצב העברת נתונים גבוה. אנו משתמשים חתימת אפיגנטיים H3K4me3 לזהות יזמי microRNA ו immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נתוני -sequencing מפרויקט קידוד לזהות יזמי microRNA מעשירים עם גורם שעתוק אתרי קישור. על ידי transfecting תאים בעלי עניין עם shRNA מיקוד גורם שעתוק של עניין והכפפת התאים למערך microRNA, אנחנו לומדים את השפעת גורם שעתוק זה על transcriptome microRNA. כדוגמא המחשה נשתמש המחקר שלנו על השפעת STAT3 על transcriptome microRNA של ly הכרוניתלוקמיה mphocytic (CLL) תאים.

מבוא

מייקרו RNA הוא RNAs רגולטוריות קידוד הלא קטן אנדוגני כי בדרך כלל לתפקד כמו רגולטורים שליליים של ביטוי mRNA ברמת posttranscriptional. כ -1,000 ללא קידוד 20 עד 25 מיקרו-רנ"א ארוך נוקלאוטיד נמצאים בגנום האנושי 1,2. מיקרו RNA לווסת ביטוי גנים באמצעות זיווג בסיס הקנונית בין רצף זרע של microRNA ורצף המשחק זרע המשלים, הנמצא בדרך כלל על האזור מתורגמת '3 (UTR) של תעתיקי היעד. באופן קולקטיבי, מיקרו-רנ"א לווסת יותר מ -30% של הגנים המקודדים חלבונים 3, אבל רק מעט מאוד ידוע על שעתוק מ- DNA של מיקרו-רנ"א. הועלתה השערה כי הסדרת שעתוק microRNA דומה לזה של mRNA 4,5. בפרט, בדומה לפעילותה בקידום שעתוק של גנים המקודדים חלבונים, גורמי שעתוק נחשבים להפעיל שעתוק של מיקרו-רנ"א 6. תמלול גורם-מ 'גומלין icroRNA דווח כגורם אפנן של ביטוי גנים 7, והוא רשאי גם טופס היזון חוזר ולולאות-קדימה להאכיל. לדוגמה, Yamakuchi et al. דיווח לולאת משוב שבו p53 גורם הביטוי של microRNA34a, אשר בתורו מעכב תרגום של SIRT מדכא p53 ו- p53 ובכך להגדיל פעילות 8.

בעוד דוגמאות ספציפיות הביטוי תלויה גורם שעתוק של מיקרו-רנ"א דווחו, שיטה מקובלת המספק מידע על איך גורם שעתוק של עניין מסדיר את הביטוי של-transcriptome microRNA חסר. מטרת הפרוטוקול הציע בזאת היא לספק תיאור המעמיק של רגולציה גורמת תלויה שעתוק של-transcriptome microRNA. על ידי שילוב של נתונים זמינים לציבור, כלי ביואינפורמטיקה בטכנולוגיית microarray, חוקרים העוקבים אחר אלגוריתם זה יהיה מסוגל לתפוס בסולם גנומי איך כלגורם שעתוק לכל סוג תא של עניין מסדיר את הביטוי של transcriptome-microRNA וכדי לחקור תרומה משוערת של mRNA-גורם שעתוק ויסות ביטוי microRNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. זהה אתרי קישור גורם שעתוק ב האמרגן של גני MicroRNA שימוש בגישת כריית הנתונים

  1. השתמש דפדפן הגנום באוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז (UCSC) כדי לחלץ immunoprecipitation הכרומטין הנתונים רצף (שבב) שנוצר כחלק האנציקלופדיה של אלמנט דנ"א הפרויקט (קידוד).
    1. פתח את דפדפן שולחן בדפדפן הגנום UCSC.
    2. השתמש במפרטים הבאים כדי לחלץ את השולחן: clade: (יונקים), הגנום: (אדם), הרכבה: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), קבוצה: (תקנה), מסלול (TxnFactorChIP), שולחן: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), באזור : (הגנום), תבנית פלט (כל הגנים משולחן שנבחר).
    3. שמור את הפלט של 1.1.2 כקובץ TXT ו- לתוך גיליון אלקטרוני.
    4. למיין ולסנן עבור גורם שעתוק של עניין (למשל, STAT2).
  2. השתמש ברשימת יזמי microRNA מבוסס על חתימת אפיגנטיקה H3K4me3 הזמינה ב Baeer et al. 9 . העתק רשימה זו לתוך קובץ .txt.
  3. כדי להתאים פי קואורדינטות על גנום האדם, למפות את הנתונים מ -1.1 ו -1.2 (למשל, STAT3 מחייבים על יזמי microRNA משוערים) ולקבוע זיקת מחייב החציוני באמצעות הקוד שנכתב ב- C חדה כפי שהמתואר משלים קידוד קובץ 1.

2. השתמשו shRNA כדי דאון-להסדיר את הביטוי של גורם שעתוק של ריבית

  1. פלייט 1.5 x 10 6 תאי 293 שורת תאי כליה עוברית אנושית בצלחת 10 סנטימטרים על כ 50% מפגש (DMEM עם 10% FBS).
  2. תאי Transfect מ 293 קו תא הכליה עוברי אנושי עם 5 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) lentivirus המכיל shRNA מופנים אל גורם השעתוק של עניין עם 5 מיקרוגרם של וקטורי אריזה באמצעות מגיב transfection עבור תאים חסידים על פי הפרוטוקול של היצרן.
  3. כביקורת, transfect את התאים מן 293 שורת תאי כליה עוברית אנושית עםמקושקשות shRNA ואת וקטורי אריזה על פי הפרוטוקול של היצרן.
  4. שמור תערובת transfection על תאים עבור 16 שעות (ב 37 ° C, CO 2 באינקובטור), ולאחר מכן שנה בתקשורת עד 10 מ"ל התקשורת 10% טרי DMEM עם FBS 10%.
  5. המתן 48 transfection שעות שלאחר, בצנטריפוגה תרבית תאים (300 XG, 5 דק ') ולאסוף supernatant זיהומיות. סנן את supernatant דרך פילטר מזרק 0.45 מיקרומטר (קרום יצטט תאית חינם פעיל שטח 25 מ"מ) כדי להסיר את כל תאים צפו.
  6. לרכז את supernatant לאסוף את lentivirus באמצעות מכשיר מסנן ultracentrifugal עם סף של 100 kDa. ספין ב 950 XG עבור 30 - 60 דקות עד נפח כבר להתרכז פחות מ 250 μl. אחסן את הנגיף המרוכז ב -80 מעלות צלזיוס.
  7. Transfect התאים עם lentivirus. הסר lentivirus קפוא מהמקפיא -80 ° C ו להפשיר לטמפרטורת החדר. העברת 100 μl של supernatant ויראלי לצינור טרי 1.5 מיליליטר microfuge.
    1. בריןg את הנפח בצינור עד 1 מיליליטר עם מדיום בסרום מופחת. להוסיף ברומיד hexadimethrine עד 1 מ"ל ההשעיה וירוס עבור ריכוז סופי של 10 ng / ml, מערבבים בעדינות ונותנים לתערובת לעמוד במשך 5 דקות.
  8. צנטריפוגה 5 x 10 6 תאים עבור כל התמרה בעדינות resuspend התא גלולה ב 0.5 מ"ל של התקשורת המכיל וירוס. בואו התאים להישאר בחממה 4 - 24 שעות, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של מדיום עם FBS 20% לריכוז סופי של 10% FBS.
  9. מתן 48 עד 72 שעות ו להכתים את התאים עם יודיד propidium (PI) וחלבון פלורסנט ירוק (GFP) על פי הוראות היצרן. הגן על התאים מפני אור ולהשתמש סדרן FACS למדוד את שיעורי GFP + / PI - תאים. מאז כתמי PI תאים מתים בלבד, שיעור זה הוא אומדן של יעילות transfection בתאים חיים.
  10. מיינו את אוכלוסיית תאים חיובית ביטוי של GFP (+ GFP) על ידי סדרן FACS כפי שתואר לעיל 10.
  11. השתמש Westeסופג rn החיסונית כפי שתואר לעיל 10 כדי לקבוע את רמות פקטור שעתוק של עניין לפני ואחרי הדבקה של תאים בעלי עניין (למשל, תאים CLL) עם shRNA המיועד.

3. לקבוע את רמת הביטוי של transcriptome MicroRNA בתאים transfected עם תמלול Factor-shRNA

  1. לבודד RNA באמצעות ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
  2. לייבל RNA להכליא אותו microRNA microarray 11.
  3. קבע את microRNA לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתאים transfected עם שעתוק גורם shRNA או עם פקדים וקטור ריק 5.
  4. אמת את תוצאות microarray עבור מיקרו RNA לידי ביטוי ביותר דיפרנציאלי באמצעות בזמן אמת 5 PCR.

4. לקבוע את החפיפה בין ביואינפורמטיקה וגישת shRNA בתיאור transcriptome Dependent גורם שעתוק

  1. כדי Detסמור היחסי הצפוי וצופה גני microRNA כי נמל גורם שעתוק מחייבים אתרי היזמים שלהם והיו downregulated בתאי transfected-shRNA גורם שעתוק, בצע את הפעולות הבאות:
    1. השג את היחס בין הגנים כי הנמל גורם שעתוק של עניין microRNA האמרגן / הכולל שלהם מהרשימה שנוצרה 1.3. רשימה זו היא היחס הצפוי (למשל, גני microRNA עם STAT3 אתרי קישור / גני microRNA הכוללים נבדקו = 0.25).
    2. לקבוע את מספר גנים שהיו downregulated בתאי transfected שעתוק הגורם-shRNA מהרשימה שנוצרה 3.3 ויש לו גורם שעתוק של אתרי קישור עניין מהרשימה שנוצרה 1.3. מספר / זה סה"כ גנים downregulated הוא היחס הנצפה (למשל, הגנים microRNA עם STAT3 אתרי הקישור / המספר הכולל של מיקרו-רנ"א downregulated = 0.6).
  2. השתמש χ2 סטטיסטיקה להשוות את היחסים ציינו וצפויים שנוצרו לעיל לקבוע אם הרשימה של גנים שהיו downregulated בתאי transfected שעתוק הגורם-shRNA מועשרת עם גורם שעתוק מחייבים אתרי האמרגן שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

STAT3 הוא גורם שעתוק אשר בדרך כלל גורם שעתוק של גנים שיש להם אפופטוטיים אנטי ואפקטים שגשוג 12. אם STAT3 להשפיע גם על transcriptome RNA ללא קידוד לפי שעה לא ברור. בכל תאי CLL STAT3 עובר פוספורילציה constitutively על סרין 707 שאריות 10,13. Phosphoserine STAT3 הסעות לגרעין, נקשר ל- DNA, ומפעיל גנים הידועים בכך שהם מופעלים על ידי טירוזין pSTAT3 בסוגי תאים אחרים 10. בגלל CLL מאופיין הסרת הפיקוח הגלובלי של הרשת microRNA <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המנגנון שבבסיס RNA פולימראז II- השעתוק התלוי של גני המקודדים חלבונים, נחקר בהרחבה. בעוד אלמנטים אלה מהווים רק 1% - 2% של הגנום האנושי, ראיות מפרויקט הקידוד מראים כי למעלה מ -80% של הגנום האנושי עשויים לעבור שעתוק 17 ומה מסדיר את התעתיק של רצפי דנ"א ללא קידוד נותר ברובה לא ידוע 6 .

מספר מחקרים, אשר הצביעו על כך Pol II הוא גם אחראי על שעתוק של גנים מסוימים שאינם המקודדים חלבונים כולל

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענק מטעם קרן המחקר גלובל CLL. האוניברסיטה של ​​מרכז טקסס MD Anderson Cancer נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב באמצעות מענק תמיכה במרכז לחקר הסרטן (P30CA16672).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Lipofectamin 2000Life Technologies11668027
0.45 ומיקרו; מסנן מזרק mThermo Scientific (Nalgene)190-2545
מכשיר מסנן אולטרה-צנטריפוגלי Amicon עם סף של 100  kDaMerck Millipore
PolybreneMerck MilliporeTR-1003-G
TRIzol ReagentLife Tachnologies (Invitrogen)15596-026
293 קו תאים אנושיסיגמא-אולדריץ'85120602

מקורות

  1. Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
  2. Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  4. Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61(2011).
  5. Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50(2013).
  6. Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
  7. Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
  8. Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
  9. Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
  10. Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
  11. Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
  12. Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
  13. Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
  14. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
  15. Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046(2011).
  16. Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
  17. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
  18. Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
  19. Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279(2009).
  20. Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

H3K4me3ChIPshRNAMicroRNASTAT3Western BlottingRT PCR
בתארו תקנה Dependent גורם שעתוק של transcriptome MicroRNA
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.