האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

סיכום

המחברים מציגים פרוטוקול לאיסוף מגבוני אף חזירים כדי לזהות ולבודד נגיפי שפעת A.

תקציר

מעקב לנגיפי שפעת בחזירים הוא קריטי לבריאות אדם ובעלי החיים, כי שפעת וירוס במהירות מתפתח באוכלוסיות חזירים וזנים חדשים צצים ללא הרף. חזירים יכולים להיות נגוע על ידי שושלות שונות של נגיף שפעת שהופכים אותם מארחים חשובים להופעה והתחזוקה של שפעת רומן זני וירוס. דגימת חזירים בהגדרות מגוונות כגון חוות מסחריות חזירים, ירידים חקלאיים, ושווקי החי חשוב לספק תמונה מקיפה של מחזור כיום זני IAV. הטכניקה הנוכחית הזהב סטנדרטי אנטה-מורטם הדגימה (כלומר אוסף של מטליות האף) היא עבודה אינטנסיבית מכיוון שהיא דורשת איפוק פיזי של החזירים. מגבוני האף כרוכים משפשפים את פיסת הבד על פני החוטם של החזיר עם מינימאלי ללא ריסון של בעלי החיים. האף לנגב הליך הוא פשוט לביצוע ואינו דורש כוח אדם עם וטרינרים מקצועיים או הכשרת טיפול בבעלי חיים. While מעט פחות רגיש ממטליות האף, שיעורי זיהוי וירוסים ובידוד מספיקים כדי להפוך את האף מגבוני חלופה לדגימת חזירים בודדים כאשר שיטות דגימה נמוך מתח נדרשות. פרוטוקול ההליך מתאר את הצעדים הדרושים כדי לאסוף האף קיימא למחוק מחזיר בודד.

מבוא

נגיפי שפעת (IAV) גורמים למחלות בדרכי הנשימה במינים רבים, כוללים ציפורים מקומיות, חזירים, ובני אדם. בשל reassortment של האבולוציה הנגיפית המהירה הגנום IAV המפולח יכול להתרחש וזני IAV חדשים לעתים קרובות להופיע. חזירים הם מינים שיכולים לשמש ככלי לערבוב reassortment של IAVS ממיני מארח מרובים. ¹ כרגע יש שלושה תת-סוגים עיקריים של IAV מחזור נפוץ בקרב חזירים בצפון אמריקה (H1N1, H1N2, H3N2), אבל יש לי היכרויות IAV מרובות מבני האדם הוביל לגיוון IAV הנרחב בתוך תת אלה. ² אבולוציה מהירה של IAVS הדבקת חזירים הייתה ברורה מאז 1998 כאשר reassortant משולש IAV המכיל קטעי גן מוירוסים אנושיים, עופות וחזירים ³ הפכו נפוצים בקרב חזירים בארצות הברית. ⁴ הגן הפנימי קטעים שמIAV reassortant המשולש יישארו נפוצים מאוד בקרב IAVS הדבקת חזירים כיום. ⁵

"> ברחבי העולם, IAV הוא גורם משמעותי למחלות בדרכי הנשימה בחזירים שבסימנים קליניים אופייניים כוללים חום, אנורקסיה, עייפות, שיעול, נשימה מאומצת, התעטשות, נזלת ועלייה במשקל ירוד. IAV יכול להיות יקר במיוחד לזרוע חוות שבי רבייה כישלון בשל חום וחזירונים נולדו חלשים-induced IAV תועד. ^6,7 בתוך ארצות הברית, IAV מזוהה בדרך כלל בעדרי חזירים מסחריים ומגוון הנרחב אנטיגני וגנומי ופיתוח המתמשך בין החזירים הדבקת IAV עכב שליטה של זה וירוס. ^8-11

חששות לבריאות ציבור על הופעתה של מתח IAV מגיפה כתוצאה מreassortment בחזירים מומשו בשנת 2009 כאשר IAV חזירים שושלת מכיל קטעים מגן השושלת המשולשת reassortant צפון אמריקה חזירים ושושלת חזירים כמו עופות האירו גרם למגפה בעולם בבני אדם. ¹² (pdm09 A (H1N1)) הנגיף מאזreassorted עם חזירים אנדמיים IAV זני ^13,14 וחלק מהזנים חדש reassorted אלה הועבר בחזרה לבני אדם. ¹⁵ התדירות של אירועים והופעתה של זנים חדשים IAV עם פוטנציאל מגיפה עושה מעקב פעיל של מחזורי וירוסי IAV בחזירים הכרחיים reassortment, במיוחד בממשק החזירים-אדם.

ממשק החזירים-אדם הוא חשוב להעברת interspecies דו-כיוונית של IAV. אדם לחזירי שידור מתרחש בייצור חזירים מסחרי אחראי לכמות גדולה של גיוון IAV כיום קיים באוכלוסיית החזירים. ירידים חקלאיים הם ההגדרות הגדולות ביותר לcomingling של אנשים וחזירים בארצות הברית וידועים באתרים להעברת zoonotic של IAV. ^15-21 בשנת 2012, במהלך פרוץ גרסת H3N2 IAV, 93% מהמקרים מדווחים נוכחות ב הוגן חקלאית בימים שקדם לתחילתה של מחלה. ¹⁵ ניתוח הגנוםשל בידודים נגיפיים מחזירי תערוכה לעומת מבודדים אנושי אישר העברת zoonotic. חזירים ²¹ תערוכה נגוע בIAV לעתים קרובות לא מראה סימנים קליניים של מחלה, ^21-23 המציינים את הצורך בבדיקות אבחון ישירים.

דגימה של חזירים חולים בעליל לבד לא לזהות בהצלחה שכיחות IAV בחזירים ולא ניתן לסמוך על לזהות זנים חדשים של IAV מתעוררים בקרב חזירים. מעקב פעיל הוא הכרחי לצורך זיהוי של זנים המתעוררים מIAV בחזירים ולהעריך האיום שלהם עבור שני חזירים ובריאות הציבור. רוב פעילויות מעקב IAV הן מרצון ולכן יש צורך בשיטות זעיר-מפריעות. שלושה הליכי גביית מדגם גדולים אנטה-מורטם לIAV הדבקת חזירים הם: מטליות האף, נוזלים דרך הפה, ומגבוני האף. המלצות נוכחיים לדגימת חזירים בודדים כדי לזהות רשימת IAV החדרת סינטטי הסיבים הטו מטליות לנחיריים כשיטת המועדפתלאסוף הפרשות מהאף ותאי האפיתל. ^24,25 בגלל חזירים עלולים לנסות להימנע מהליך זה, צוות של אנשים מיומנים חייבים לרסן את החזירים באופן ידני או עם מלכודת תלוי בגודל של החיה. ²⁶ תהליך האיפוק הוא מייגע ל כוח אדם, ומלחיץ עבור החזירים. בנוסף, חזירים תערוכה לעתים קרובות מעורבים בתחרויות מרובות ביריד כך התפיסה של מתח הוסיף על בעלי חיים תחרות יכולה לעשות בעלים עמידים למאמצי המעקב.

בהסתברויות של זיהוי IAV החל 80-100% בIAV עדרים נגועים, נוזלים אוראליים הפכו חלופה פופולרית לאף מטליות לזיהוי המולקולרי של IAV באוכלוסיות של חזירים. ^27,28 בנוסף, נוזלים דרך הפה עשוי לספק חלון רחב יותר של זיהוי IAV מ מטליות האף בעקבות זיהום ראשוני. עם זאת, בידוד IAV מנוזלים דרך הפה היה בעייתי עם רק 50% מניסיונות בידוד נגיף וכתוצאה מכך IAV התאוששות. ²⁹

שימוש במגבוני האף במקום מטליות האף במהלך מעקב IAV בחזירים מתגבר על המגבלות שתוארו לעיל. מגבוני האף אינו דורשים שימוש במלכודת הרחקה וניתן לבצעו ללא הדגיש בעלי החיים או עדים של ההליך. יש צורך בהכשרה טכנית מינימאלית כדי לאסוף מגבוני האף, המאפשר אנשי מקצוע שאינה וטרינרית, לרבות בעלי חזירים, כדי לאסוף את דגימות המעקב. מגבוני האף הושוו בעבר למטליות האף לזיהוי והבידוד של וירוס שפעת ³⁰ והפרוטוקול מפורט לשיטה לא פולשנית של דגימה מתואר להלן.

פרוטוקול

כל החזירים בשימוש באוסף של נתונים הבאים היו מוגנים תחת הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אוהיו (מספר פרוטוקול שימוש בבעלי החיים 2009A0134-R1).

1. הכנת ויראלי תחבורה בינונית והמדגם בקבוקי אוסף

1. להוסיף 37 גרם של מוח לב עירוי עד 900 מיליליטר של מים מטוהרים ומערבבים היטב עם בר מערבבים ובוחש מגנטי תוך חימום עד 70 מעלות צלזיוס לפזר את האבקה לחלוטין.
2. החיטוי המרק ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מגניב על גבי הספסל עד המרק מגיע לטמפרטורת חדר. במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך.
3. לפזר, על ידי ערבוב עם בר ומערבבים מגנטי, 6.02 גרם של מלח נתרן פניצילין G ו -10 גרם של סולפט סטרפטומיצין לתוך 50 מיליליטר של מים מטוהרים בטמפרטורת חדר. מוסיף מים מטוהרים נוספים כדי להביא את הנפח הכולל עד 100 מיליליטר. סנן את הפתרון דרך קרום polyethersulfone 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק סטרילי.
4. הסביבה נקיה מחיידקים להוסיף פניצילין המסונן ופתרון סטרפטומיצין למוח לב עירוי מרק התקרר ומערבבים היטב (בר מערבבים או בקבוק מערבולת ביד) כדי להפוך את מדיום תחבורת ויראלי.
5. הסביבה נקיה מחיידקים לבדוק את ה- pH של מדיום התחבורה הנגיפי; במידת צורך, להתאים את ה- pH 7.4 ± 0.2 באמצעות HCl או NaOH.
6. לבצע בדיקות אבטחת איכות במדיום התחבורה הנגיפית על ידי בדיקה לשפעת חלבון מטריקס וירוס על ידי RRT-PCR, כפי שתואר על ידי ג'אנג והרמון. ²²
7. לוותר 5 מיליליטר של מדיום התחבורה הנגיפי לתוך בקבוקי פוליאתילן בצפיפות גבוהה סטרילי עם קיבולת 8 מיליליטר. תווית הבקבוקונים לשימוש בתחום.
8. אחסן את הבקבוקונים מוכנים לשימוש בcryo-תיבות סטנדרטיים ב -20 ° C עד לגביית מדגם.

2. אוסף של באף מגבונים מחזירים

1. להפשיר את המספר המתאים של בקבוקונים מייד לפני לטעום אוסף; בקבוקון אחד יהיה צורך לחזיר שנדגמו. מפשיר בחדרטמפרטורה אורכת כ 30-45 דקות. שמור את הבקבוקונים המופשרים לקרר בשקיות קרח עד לשימוש.
2. ציוד מגן אישי מתאים דון כפי שהוכתב על ידי המצב (למשל סרבל, כיסויי אתחול, מונשמים, אטמי אוזניים, וכו ').
3. הזן את השטח לבעלי החיים. במידת הצורך, להגביל את החזיר לאזור קטן אבל לא לרסן. אל תעיר נחים בעלי חיים.
4. לשים על זוג כפפות חד פעמיות בחינה. יש להיזהר שלא לזהם את הכפפות על ידי חזירי נגיעה, אנשים, או חפצים דוממים.
5. השתמש ביד בכפפה כדי להסיר 5.08 סנטימטרים סטרילי × 5.08 סנטימטר (2 ב. × 2 ב.) תחבושת כותנה מאריזתו. יש להשתמש פדה גזת סטרילי בכל ההזדמנות אפשרית. פדה גזה עטופה בנפרד הן נוחה יותר לשימוש מאשר אלו עטופים בשתי פודים גזה לכל חבילה.
6. החזק את תחבושת כותנה עם קצות האצבעות של יד אחת לחשוף כמה שיותר משטח אפשרי לדגימה.
7. נגב את התחבושת על פני החוטם של החזיר, לוקחטיפול נוסף להיכנס לnares החיצוני במידת האפשר. לאסוף הפרשות מהאף גלויות (כ 1 מיליליטר) עם אותו התחבושת.
8. שימוש באותה היד, לקפל את התחבושת על עצמה כדי להקל על מיקום בבקבוקון המכיל בינוני תחבורת ויראלי.
9. שימוש מצד השני, להסיר את הכובע מהבקבוקון והנח את רפידת הגזה המקופלת לתוך הבקבוקון. לסכם את הבקבוקון ולנער את הבקבוקון כדי להבטיח הערבוב של התחבושת ובינוני תחבורת ויראלי.
10. הסר את הכפפות ומקום בקיבול מתאים. לשנות כפפות בין כל חזיר.
11. ודא מזהה הבקבוקון. מספר שיא זיהוי חזיר, גיל, מין, סימנים קליניים, והערות אחרות הכרחית על ידי חוקר.
12. צ'יל הדגימות מייד לאחר איסוף. לשקול ביצוע aliquots של המדגם לפני ההקפאה כדי למנוע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. בהקדם האפשרי לאחר איסוף, למקם את הדגימות על קרח יבש לתחבורה למעבדה. אחסן את הבקבוקונים ב -80° C עד הבדיקה היא יזמה.

3. וירוס איתור של שפעת חומצות גרעין

1. להפשיר הדגימות באמבט חרוז יבש 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לסיים מפשיר את הדגימות על גבי הספסל בטמפרטורת חדר למשך 20-30 דקות. בנוסף בו זמנית של כמה בקבוקונים לחרוזים יגרמו האמבטיה כדי לחמם; יש להיזהר לא לחמם יותר מדי כמו לבקבוקונים.
2. הסר של מדיום תחבורה נגיפי 100 μl להפקת RNA.
   1. השתמש בתפוקה גבוהה (96 בפורמט צלחת היטב) פלטפורמת חרוז מגנטית לחילוץ RNA ממספר גדול של דגימות. ³¹
3. השתמש במבחני PCR טרנסקריפטאז בזמן אמת לשפעת זיהוי המהיר וירוס. ³¹

4. בידוד של וירוס שפעת ממגבונים באף

1. להפשיר את הדגימות כפי שתואר לעיל בסעיף 3.1
2. פנק את הדגימות מופשרים עם סולפט גנטמיצין (1,000מיקרוגרם / מיליליטר), amphotericin B (22.5 מיקרוגרם / מיליליטר), וסולפט kanamycin (325 מיקרוגרם / מיליליטר).
3. לחסן לכליות כלבי מדין-דארבי (MDCK) תאי האפיתל כפי שתואר לעיל. ³²

תוצאות

שימוש מוצלח בשיטה זו מניבה RRT-PCR תוצאות ש, מלווה בשימוש בבקרה פנימית במהלך הפקת RNA וRRT-PCR, דגימות תכנית לא הכילו מעכבי PCR מכל פסולת סביבתית הרימה במהלך דגימה. לאחר חיסון מדגם, בארות בידוד וירוס צריכה להיות חופשיות של פסולת סביבתית גלויה מהמדגם. יש הסכמה סבירה בין תוצאות RRT-PCR ותוצאות בידוד נגיף מתוך ההבנה שPCR לעתים קרובות מניב שיעור חיובי גבוה יותר מאשר IAV בידוד נגיף בגלל PCR מזהה חומצת גרעין נגיפית, לא וירוס קיימא בהכרח.

דיון

איסוף דגימות מחזירים באמצעות מטליות האף-הטה פוליאסטר הוכיח שימושי בניהול מעקב IAV; עם זאת, השימוש בנוהל ספוגית האף מעכב את מאמצי מעקב עקב השימוש הנדרש של מלכודת לאיפוק. מגבוני האף מייצגים עידון של טכניקות דגימת חזירים הנוכחיות כדי למזער את הלחץ על אנשים וחזירים במהלך איסוף דגימה. בעוד השיטה פותחה ולמאומתת בהגדרות חזירים תערוכה, זה יכול להיות מיושם בקלות למצבים אחרים שבם זיהוי אנטה-מורטם של IAV בחזירים יש צורך (כלומר חזירים מסחריים, שווקי בעלי החיים חיים, מחקר ביו-רפואי, <...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicillin G Sodium Salt	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Streptomycin Sulfate	AMRESCO LLC	0382
Gentamicin Solution	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 מ"ג/מ"ל
Amphotericin B Solution	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Kanamycin Sulfate	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax מערכת	TPP טכנו מוצרי פלסטיק AG	99150
בקבוקי אבחון Nalgen	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE עם סגירת PP לבנה
ספוג גזה Dermacea, 8 שכבות	Covidien	441211	5.08 ס"מ ופעמים; 5.08 ס"מ (2 אינץ' ופעמים; 2 אינץ')
כפפות בחינת ניטריל	בחירה בטוחה	19-170-010 (A-D)