אנו מפרטים פרוטוקול לניטור התנהגותם של נויטרופילים ומונוציטים בוורידים מזנטריים במצב יציב ובתנאים דלקתיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית בעכברים מורדמים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת
במאמר זה
סיכום
תקציר
תגובה חיסונית יעילה תלויה בגיוס מהיר של כדוריות דם לבנות בדם לאתר של זיהום או פציעה. חוקר הגירת יקוציט in vivo הוא חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של הגירת Transendothelial יקוציט ואינטראקציה עם האנדותל של כלי דם. גישה רבת עוצמה אחד כרוכה מיקרוסקופיה intravital בעכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין.
כאן אנו מציגים פרוטוקול למונוציטים הדמיה ונויטרופילים בCX 3 iv עכבר CR1 GFP / WT הוזרק נויטרופילים שכותרתו צבע כתומים עם מיקרוסקופ confocal הפוך. זמן לשגות סרטים שנאספו מ -30 דקות לכמה שעות של הדמיה מאפשרים הניתוח של התנהגות יקוציט בעורקי mesenteric תחת שני תנאי המדינה ודלקתיים יציבים. אנו גם מתארים את הצעדים כדי לגרום לדלקת בכלי דם באופן מקומי עם TLR2 / TLR1 אגוניסט Pam3SK4 ולפקח על subsequeגיוס NT של נויטרופילים ומונוציטים.
גם הטכניקה שהוצגה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר אוכלוסיות אחרות של לויקוציטים ולחקור מולקולות מעורבות בגיוס לויקוציטים או סחר באמצעות גירויים אחרים או עכברים מהונדסים.
מבוא
נויטרופילים ומונוציטים הם תאים של מערכת החיסון המולדת, כי כל זמן במחזור הדם. על פציעה או זיהום, אותות דלקתיים לגרום diapedesis לויקוציטים לרקמות שנפגעו ונגועים, במסמך ייזום תגובה חיסונית תאית 1-3. המהירות של גיוס לויקוציטים קובעת את התוצאה החיובית של התגובה החיסונית. תהליכים מורכבים אלה מסתמכים על מולקולות ספציפיות (למשל, selectins, כמוקינים מאוגדים האנדותל) הנוכחיות על האנדותל המודלק המסייעות להקמת קשר דבק בין כדוריות דם לבנות במחזור והאנדותל 1-3 בדי לקבל תובנות על המולקולות מעורבות ביקוציט מפל גיוס, חשוב לדמיין את קינטיקה של גיוס תא ולעקוב אחר ההתנהגות של כל תא / אוכלוסייה. שיטה יעילה כרוכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: נהלי בעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה המוסדית האתית של טיפול בבעלי חיים בז'נבה, שווייץ ולשכת הווטרינרית המחוזית. מספר אישור GE / 63/14.
1. הכנת תרחיף תא בודד ממח העצם
- עכבר קורבן (8-12 בן שבוע) נקע בצוואר רחם. לעקר רגליים אחוריות עם 70% אתנול. להסיר עור מרגליים אחוריות.
- לנתח את עצמות ירך עכבר וtibias ולהסיר רקמה מרגליים עם אזמל. יש לשטוף את הרגליים עם 90% אתנול ומקום לתוך צלחת תרבות מלאה PBS.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כתב היד מתארת פרוטוקול מותאם כדי לפקח על התנהגותם של מונוציטים ונויטרופילים בורידי mesenteric של עכברים מורדמים בזמן אמת בקלות. השימוש בתא thermostated-37 ° C הוא חובה כדי לשמור על הטמפרטורה של העכבר וגם בשל התנועה תלויה בטמפרטורה של לויקוציטים. הכנה של העכבר מוצגת באיור 1. איור 2 מציג את כל האזור ראה מתחת למיקרוסקופ. אור מועבר מאפשר זיהוי של ורידי mesenteric (חץ אדום) ועורקים (חץ כחול).
טיפול .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מתודולוגיות מתוארות בכתב היד הזה מספקים גישה עקבית ללמוד ביעילות מונוציטים ונויטרופילים התנהגות בעורקי mesenteric בתנאי מדינה ודלקתית יציבים.
הצעד המכריע של ההכנה הוא חוסר תנועה של המעי עם רקמות הרטובות-PBS. אם מבוצע כראוי, כלי mesenteric הם יפה נחשפו על coverslip לרכישת תמונה. זה מאפשר את הבחירה של כמה תחומי העניין לפקח יקוציט התנהגות בעורקי mesenteric.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי EMBO (ל-Y.E.), Foundation Machaon (ל-Y.E.) ו-SNSF (ל-B.A.I). אנו מודים למתקן הליבה של ההדמיה הביולוגית על הזמינות של מיקרוסקופ ה-A1r של Nikon ועל הסיוע הטכני. אנו מודים לגברת קלריסה בארטלי על התיקון באנגלית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 5 מ"ל צינורות תחתונים עגולים מפוליסטירן | בקטון דיקינסון | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4 מ"מ | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker כתום CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep מגנט | תאי גזע טכנולוגיות | 18000 | |
| EasySep עכבר נויטרופילים ערכת העשרה | טכנולוגיות תאי גזע | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| שמן טבילה סוג A | ניקון | כל שמן צמיג | |
| Life Box בקרת טמפרטורה | מערכת הדמיית | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R מיקרוסקופ קונפוקלי | Nikon | A1R | מיקרוסקופ הפוך, שלב x/y/z ממונע, תוכנת אלמנטים |
| NIS PBS | Life Technologies | D8537 | |
| פנול אדום חינם DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | כל מדיום נטול פנול אדום מתאים |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | להרכיב מחדש בסרום PBS |
| עכברוש | תאי גזע | הכלולות בערכת העשרת נויטרופילים של עכבר EasySep | |
| צלחת תרבית רקמות 100 | TPP | 93100 |
מקורות
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
