כימות של גרורות סרטן השחלות תוך הצפק

סיכום

גרורות סרטן השחלות מאופיינת בנגעים תוך-צפקיים מפוזרים רבים, כך שכימות חזותי מדויק של עומס הגידול הוא מאתגר. כאן אנו מתארים שיטה לכימות במקום ומחוץ לגוף של עומס גידול גרורתי באמצעות תאי גידול עם חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) והדמיה אופטית.

תקציר

סרטן שחלות אפיתל (EOC) הוא גורם המוות המוביל מממאירות גינקולוגית בארצות הברית. התמותה נובעת מאבחון של 75% מהנשים עם מחלה בשלב מאוחר, כאשר גרורות כבר קיימות. EOC מאופיין בגרורות תוך-צפקיות מפוזרות ומפוזרות באופן נרחב. תאים נושרים מעוגן הגידול הראשוני במזותל המצפה את חלל הצפק כמו גם באומנטום, וכתוצאה מכך גרורות רב-מוקדיות, לעתים קרובות בנוכחות מיימת צפקית. המאמצים במעבדה שלנו מכוונים להבנה מפורטת יותר של הגורמים המווסתים את הצלחת EOC גרורתית. עם זאת, כימות עומס הגידול הגרורתי מהווה אתגר טכני משמעותי בשל המספר הגדול, הגודל הקטן והפיזור הרחב של הנגעים ברחבי הצפק. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח גרורות EOC באמצעות תאים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) יחד עם הדמיה מולטי-ספקטרלית in vivo. לאחר הזרקה תוך-צפקית של תאי גידול המסומנים ב-RFP, עכברים מצולמים מדי שבוע עד למועד ההקרבה. בשלב זה, חלל הצפק נחשף בניתוח ואיברים מצולמים באתרם. לאחר מכן איברים מנותחים מונחים על תבנית שקופה מסומנת ומצולמים ex vivo. הסרת אוטו-פלואורסצנטיות של רקמות במהלך עיבוד תמונה באמצעות פירוק מולטי-ספקטרלי מאפשרת כימות מדויק של עומס הגידול היחסי. לשיטה זו יש תועלת במגוון יישומים, כולל מחקרים טיפוליים להערכת תרכובות שעלולות לעכב גרורות ובכך לשפר את ההישרדות הכוללת.

מבוא

סרטן שחלות אפיתל (EOC) הוא הגורם השכיח ביותר למוות ממאיר גינקולוגיות, עם אבחנות חדשות 21,290 המשוער בארה"ב בשנת 2015 ו ¹ 14,180 מקרי מוות. הרוב המכריע (> 75%) של נשים מאובחנים עם מחלה בשלב מאוחר (שלב III או IV) מאופיין גרורות תוך הצפק מפוזרות פרוגנוזה גרועה. ישנות מחל חלל הצפק בעקבות כימותרפיה כקו הראשון הן גם נפוצות ומייצג אחד גורמים עיקריים של ^2,3 תמותה. EOC גרורה ידי מנגנון ייחודי המעורבים הוא המשך ישיר מן הגידול הראשוני לאיברים הצפק שכנות כמו גם על ידי ניתוק או שפיכת התאים מפני שטח גידול הראשוני כמו תאים בודדים או אגרגטים רבים תאיים. תאים הם לשפוך לתוך חלל הצפק, שבה הם להתנגד הנגרמת ניתוק אפופטוזיס ^4. הצטברות של מיימת הצפק שכיחה, כפי תאים סרטניים לשפוך לחסום ניקוז לימפטי הצפק tumors לייצר גורמי גדילה אשר משנים חדירות כלי הדם. חלק של תאים סרטניים לשפוך לצרף אל פני השטח של איברים הצפק ומבנים כולל המעי, הכבד, omentum ו לפדר, ואז הם לעגן מתרבים כדי לייצר נגעים משניים מרובים לתפוצה רחבה ^3,5. גרורות Hematogenous הן נדירות. לפיכך, ניהול קליני מורכב בדרך של ניתוח cytoreductive כולל "debulking אופטימלי", המוגדר כריתה של כל הגידול גלוי (לא משנה כמה קטן). Cytoreduction השלם קשור לעלייה משמעותית בהישרדות הכוללת ^6,7 והיא קשורה עם האתגר של זיהוי והסרה של נגעים <0.5 סנטימטר.

במודלים של בעלי חיים קטנים הוכיחו שירות במחקר סרטן השחלות בשיפור ההבנה שלנו של התקדמות מחלה וכן יש להציג תעודת מזהה של סמנים פרוגנוסטיים ובדיקה של תרופות רומן או גישות טיפול משולב. ככל העיקריהאתר של שכיחות סרטן השחלות גרורות הוא חלל הצפק, מודלים orthotopic של גרורות EOC כרוך בניתוח ואפיון של המחלה intraperitoneal. למרות חלו שיפורים אחרונים ביכולת תאים סרטני תמונה, אפילו ברמה של התא הבודד, עדיין קיימים קשיים משמעותיים בכימות ניטל גידול גרורתי של EOC. אתגרים אלה נובעים בשל מספר, גודל ומיקום אנטומי של גרורות. יתר על כן קיים צורך לתאי סרטן התווית כדי להבדילם תאי מארחים נורמלים. מחקרים קודמים מנוצלים פרוטוקולי תיוג מבוסס נוגדן או transfection של תאים סרטניים עם ^8,9 בלוציפראז. תיוג פלורסנט ישיר של תאים סרטניים דווח לראשונה על ידי Chishima ועמיתים לעבודה בשנת 1997 ^10. תוויות פלורסנט אינן דורשות תוספת של מצע אקסוגניים ולספק סגולי תאים סרטניים מעודן, מתן אמצעים יעילים יותר כדי לעקוב אחר גרורות סרטן ^11,12 .

בזאת אנו מתארים שיטת הדמיה אופטית ניתוח כמותי של מחלה גרורתית באמצעות מודל xenograft orthotopic syngeneic המורכב חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) -tagged בתאי סרטן שחלות murine ID8 ¹³ ועכברים חיסוני המוסמכות C57 / BL6. אנו מדגימים שיטה חדשה של כימות נטל הגידול היחסי שילוב in vivo לשעבר vivo הדמיה עם הסרת פלואורסצנציה אוטומטי רקמות. לגישה הזאת יש פוטנציאל השירות במחקרים שנועדו להעריך את ההשפעה של שינויים ספציפיים גנטיים, אפיגנטיים או מיקרו-סביבתיים ו / או שיטות טיפול על גרורות איבר ספציפי של סרטן השחלות.

פרוטוקול

כל המחקרים vivo ב אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים נוטרדאם ועדת שימוש והשתמשו עכברות C57 / BL6J.

1. תרבית תאים Murine סרטן השחלות

1. הפוך את מדיום תרבית תאי סרטן שחלות murine ID8 כדלקמן: 1 ליטר של בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) השלים עם 4% עובריים שור סרום (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / אינסולין מיליליטר, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin ו 5 ng / ml נתרן סלניט.
2. Transduce תאים סרטניים בשחלות murine ID8 ¹³ לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) באמצעות חלקיקי lentiviral רכש מסחרי מבטאי RFP ועם סמן בחירה (blasticidin גן). שים לב חלבון פלואורסצנטי ירוק ניתן להשתמש, אבל מספק אותות הקרינה חלשה.
   1. בסמוך לפני התמרה, תרבות תאים 50 - 70% מפגש ולהוסיף בינוני טרי (ללא פניצילין / סטרפטומיצין) הכולל 1 מיליליטר polybrene (5 מיקרוגרם / מיליליטר סופיריכוז).
   2. בעדינות פיפטה RFP-lentivirus (20 μl) dropwise לתוך צלחת לדגור על 37 ^מעלות צלסיוס למשך 72 שעות. הסר בינוני דגירה עם מדיום חדש למשך 24 שעות. להתחיל לבחור תאים transduced ידי הוספת blasticidin עד בינוני התרבות (5 מיקרוגרם / מ"ל), ויעקוב אחרי התאים האדומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (figure1).
3. תרבות התאים מתויג RFP במדיום ID8 ידי זריעה כ 10 ⁶ תאים לתוך צלחת בתרבית רקמה באופן חזותי באמצעות ימי מיקרוסקופ אור עד monolayer התא הוא ומחוברות.
4. כאשר ומחוברות, למסוק את התאים באמצעות טריפסין (0.25%, 3 דקות) ולחזור הבקבוק אל האינקובטור 37 ^מעלות צלסיוס עד שהתאים מנותקים.
5. לנטרל את טריפסין עם 6 מ"ל של מדיום תרבות ID8 המכילה סרום. פיפטה מעלה ומטה כנגד בתחתית הצלחת, ולאחר מכן להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 1200 סל"ד במשך 2 דקות, ולאחר מכן לשאוב את המדיום באמצעות GLפיפטה תחת.
6. שוטפים את התאים עם בופר פוספט (PBS) על ידי resuspending בעדינות 6 מ"ל PBS חם צנטריפוגה כמו 1.5 לעיל. Re- להשעות ב PBS לריכוז סופי של 5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. שמור את התאים חמים (37 ^מעלות צלסיוס) עד הזרקה.

2. תוך הצפק הזרקה של תאים ID8 בתחום ההדמיה vivo

1. להזריק כל עכבר עם 2 מ"ל של הפתרון ID8-PBS חם עבור סכום כולל של 10 מיליון תאים באמצעות הזרקה תוך הצפק (IP). אפשר תאים סרטניים לגדול in vivo במשך כ -10 שבועות עם הדמיה חייה מדי שבוע.
2. מיד לאחר ההזרקה ובכל שבוע לאחר מכן, לשקול את העכברים ואז להרדים כל העכבר באמצעות isofluorane (קצב הזרימה של 2.5% ב 0.5 L / min O ₂ זרימה). הערה: עכברים נשקלו, ולא כמדד כמותי של נטל הגידול, אלא מדד כללי יותר של התקדמות פיזית עכבר הפרט לאורך כל תקופת המחקר. עכברים לשקולts הושוו עם ערכים למשקל הקודם שלהם.
   1. להרדים עכברים על ידי הנחת בתא isofluorane. לשמור על הרדמה קבועה בזמן סריקה על ידי מיצוב ראש העכבר בחרוט האף לחשיפה isofluorane קצב זרימה 2.5% לאורך כל ההליך.
3. השתמש קרם מקריח כדי להסיר את השיער על הגוף והבטן של כל עכבר, כמו השיער השחור יגרום הנחתה של אות הקרינה. עכברים שטופים במים חמים לאחר היישום של קרם המקריח מיובש עם מגבות נייר RT.
4. בעוד מורדם, לסרוק את כל הגוף של כל עכבר באמצעות מערכת דימות אופטי חיה קטנה. סרוק את כל העכברים במדגם בכל נקודת זמן. השתמש בפרוטוקול השני בשלב הבא (איור 2 א):
   1. בשלב 1, להתבונן שכותרתו fluorescently (RFP) תאים סרטניים, לבצע רכישה multispectral לגבות סך של 5 תמונות באמצעות מסננים עירור של 440 ננומטר, 460 ננומטר, 480 ננומטר, 520 ננומטר ו -540 ננומטר, ואת מסנן פליטה של ​​600 ננומטר. השתמש פרמטרי רכישת הבאים: חשיפה רמה 15 שניות, 2 x 2 binning, FOV של 160 מ"מ, f _stop של 1.1.
   2. בשלב 2, להתבונן על חית כולה, לרכוש תמונת החזרה באמצעות מסנן עירור פתוח (אור לבן), מסנן פליטה פתוח, חשיפה סטנדרטית של 0.2 שניות עם binning 2 x 2 ו FOV של 16 סנטימטר. שים לב: בפעם הדמיה בפועל הוא ~ 1 דק '.

3. עכבר Dissection ו Image Acquisition

1. כאשר הדמיה לחיות מראת הנוכחות של הצטברות תערוכה תוך הצפק מחלה או חיות נרחבות של מיימת (כפי שמעידים נפיחות בטנית), פסד או רווח של משקל גוף יותר מ -20%, עייפות או סימנים אחרים של מצוקה, להרדים כל עכבר באמצעות CO ₂ הרדמה ואחריו נקע בצוואר הרחם.
2. חותכים את העור anteriorly לאורך קו האמצע הגחון של העכבר, באמצעות dissectio מחודדn מספרי, מהחלק העליון של הירכיים לתחתיות כלוב הצלעות. קח בזהירות רבה כדי לחתוך רק את שכבת העור (איור 2Bi). בעדינות להפריד את העור מרקמת הצפק, להיות בטוח שלא לנקב את קיר הבטן.
3. בעזרת מספריים לנתיחה מחודדים, לחתוך רוחבי הוא בחלק התחתון של כלוב הצלעות והחלק העליון של הירכיים ליצור שני קפלי העור (איור 2 ב II, III).
4. מניח כל עכבר בצד הגחון שלו (חלל הצפק פונה כלפי מטה) עם שולי העור ופתח ולסרוק כל עכבר עם מוסדותיה באתרו באמצעות מערכת דימות אופטי חיה הקטנה (איור 3 א ', ב').
   1. השתמש באותו הפרמטרים רכישת תמונה כמתואר-2.4.2 2.4.1..
5. המשך ביתור את העכבר על ידי לחילוץ איברים הצפק בודדים כולל כבד, omentum / לבלב, קיבה, סרעפת, מעי דק, מעי גס, שמאלה הצפק תקינים, שחלות, kidneys, לפדר ואת כרית השומן.
   1. שים לב, למנות, ולהקליט גידולים גלויים על כל איבר. השתמש קליפר למדוד את הקוטר של כל גידול.
   2. לייעד גידולים פחות מ -2 מ"מ קוטר קטנים, בין 2 ו -5 מ"מ כבינוני ו יותר מ -5 מ"מימ כמו גדולים.
6. מניח את האיברים על תבנית סריקת איבר (איור 4) שמזהה במיקום קבוע מראש עבור כל איבר. השתמש PBS לשמור על האיברים לחים.
7. סרוק כל גיליון של איברים באמצעות מערכת דימות אופטי חיה הקטנה (איור 3 ג, ד).
   1. השתמש באותו הפרמטרים רכישת תמונה כמתואר בשלב 2.4.
8. לאחר סריקה, איברי המקום בפורמלין 10% כדי לאפשר עיבוד עוקב עבור היסטולוגיה.

כימות 4. נטל הגידול ב התמונות דואר קרינה

1. על מנת להפחית את כמות קרינה אוטומטית בכל סריקת multispectral, ראשון unmix את הקבצים באמצעות תוכנה זמינה עם מערכת הדמית חיה הקטנה.
   1. טען תחילה RFP: בקובץ ספקטרלי Vivo, ואחריו Autofluor: בתיק האדום Vivo בחלון תמונות צרוף ובחר Unmix.
2. לייצא את הקבצים .bip כמו 16 ביט .tiff (ללא שינוי) הפורמט.
3. השתמש בתוכנת ImageJ (לשעבר vivo איברים ואז גוף העכבר המלא עם איברים באתרו).
   1. השתמש באפשרות קובץ> פתיחה כדי לפתוח את קבצי .tiff 16 ביט של קבצי תבנית סריקת איבר ImageJ.
   2. תחת תמונה> התאם> הבהירות / ניגודיות, לבחור להגדיר את המינימום מוצג ערך ל -0 ואת המקסימום הוצג ערך 35,353 ולאחר מכן, תחתשולחנות תמונה> בדיקה, בחרו רד הוט. הערה: מודלים של בעלי חיים שונים ידרשו רמות בהירות שונות, אך חשוב לשמור על הבהירות העקבית לאורך מחקר נתון.
   3. בעזרת כלי הבחירה Freehand, לצייר באזור צורה חופשית של מבחר עניין (ROI) סביב כל איבר ולהשתמש בכלי מדידה (CTRL + M) כדי לחשב את שטח הפנים של כל איבר; להקליט את שטח הפנים של כל איבר בגיליון אלקטרוני.
   4. עם ROI נמשך סביב כל איבר, קליק ימני בתוך ROI ובחר שכפלו לכלול רק האיבר.
   5. בעוד אני מסתכל על האיבר היחיד, תחת תמונה> התאם> סף, לבחור כדי לקבוע את הסף של התמונה לרמת סף תחתונה של + 1200 רמת סף עליונה של + 1700 בחר only האזורים הכי בהיר קורנים ולבדוק כדי לבחור רקע כהה; ובחר אישור. הערה: התמונות עשויות לדרוש מניפולציה ידנית של מחווני סף ImageJ כך שהאזורים הבהירים בעבר נבחרו לשלב ניתוח, כפי שפורטה לעיל. מודלי מחלה שונים ידרשו מגבלות סף שונות, אך חשוב לשמור על רמות הסף אחידות בכל מחקר נתון.
   6. תחת לנתח> לנתח חלקיקים, לשנות את גודל (פיקסלים ^ 2) עד 10-אינפיניטי, לבחור התכנית: מתאר, לבדוק כדי לבחור רק "הצג תוצאות" ולחץ על אישור כדי למדוד גם את תחומי וצפיפות משולבת הגלם של אזורים בהירים אלה, גידולים ייחשבו.
   7. רשום את הערכים של שטח פנים ואת הצפיפות המשולבת גלם של כל מבחר גידול המוצגים שולחן תוצאות באותו גיליון אלקטרוני המכיל את שטח פנים איברים.
   8. תחת לנתח> כלים> בר כיול, להוסיף סרגל מידת כיול לתמונות של האיברים. הערה: בדוגמה זו, זה נעשה על ידי שינוי מיקום עליון מימין, צבע המילוי השחור, צבע לייבל ווייט, מספר התוויות עד 5, עשרוני מקומות 0, גודל גופן 12 ואת זום פקטור ל -4.0 ולאפשר טקסט מודגש.
   9. תחת קובץ> שמירה בשם ..., שמור את מונטאז בתור .TIFF וכן JPEG.
   10. השתמש באפשרות קובץ> פתיחה כדי לפתוח את הקובץ בפורמט JPEG של האברים ולאחר מכן, תחת הוספה <תיבת טקסט , להוסיף תוויות איבר ידי יצירת תיבת טקסט מתחת לכל אחת משלוש שורות של איברים.
   11. השתמש באפשרות קובץ> פתיחה כדי לפתוח את כל 16 קבצי .tiff קצת סריקות הגוף המלאות ב ImageJ לפי סדר מספר עכבר.
   12. תחת תמונה> התאם> הבהירות / ניגודיות, לבחור להגדיר את המינימום מוצג ערך ל -0 ואת המקסימום הוצג ערך + 35,353 ולאחר מכן, תחת 'תמונה'> שולחנות בדיקה, בחרו רד הוט.
   13. תחת קובץ> שמירה בשם ..., שמור את מונטאז 'בתור. Tiff וכן JPEG.

ניתוח 5. נתונים

1. מוסיף את אזורי בחירת גידול צפיפויות משולבות גלם, בהתאמה, עבור כל איבר של כל עכבר ולהקליט את אזור גידול איבר הכולל עבור כל עכבר.
2. לנרמל באזור הקליט integrat גלםערכי צפיפות ed עבור הגודל של כל איבר על ידי חלוקת שטח הגידול הכולל וערכי צפיפות משולבים הכוללים גלם על ידי שטח פן איבר המתאים (טבלת 1).
3. לחשב ולתכנן את הממוצע של שני אזורי משטח גידול המנורמלים ואת ערכי צפיפות המנורמלים גלם המשולב (איור 5 א ', ב').
4. השוואת ערכים ממוצעים אלה לאלה שהושגו על ידי חזותית לספור את הגידולים שהיו גלויים לעין בלתי מזוינת במהלך הבדיקה של כל איבר עבור גרורות.

תוצאות

המנגנון גרורתי של סרטן השחלות מאופיין גרורות תוך הצפק מפוזרים מאוד מורכבות נגעים רבים בגדלים שונים, כולל מספר קטן (<2 מ"מ) נגעים. לפיכך, השימוש של תאים סרטניים שכותרתו RFP (איור 1) ו דימות אופטי מספק שיטה חלופית כדי ספירה ידנית ומדידה של גודל הנגע. התפתחות נטל הגידול לאורך זמן ניתן לקבוע על ידי שקילה שבועית של עכברים ומדידה של ההקף הבטן כדי לאמוד הימצאות אפשרית של מיימת. דימות אופטי בשנת vivo מספק גישה משלימה להערי...

דיון

בניגוד למחקרים באמצעות תאי סרטן שחלות אדם חייב להתנהל בעכברי immunocompromised, הפרוטוקול המתואר לעיל מנצל מערכת חיסון תקין עכברי C57 / BL6 ותאי סרטן שחלות murine syngeneic. אמנם זה מאפשר הערכה של פוטנציאל התפקיד של מחלחל חיסוני התקדמות גידול וגרור, הנוכחות של שיער כהה על פני שטח הבטן הופכת הדמיה פחות רגישה. שימוש מקריח להסיר שיער לפני ההדמיה משפרת רכישת תמונה, אבל היא גוזלת זמן, במיוחד עבור ניסויים הדורשים הדמיה אורכת. 'עירום' עכברים חסרי שיער ניתן להשתמש בפרוטוקול זה ואי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
סרום בקר עוברי	Gibco	10437-028
פניצילין/סטרפטומיצין
תוסף מדיה אינסולין-טרנספרין-נתרן סלניט	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme מערכת הדמיה לבעלי חיים קטנים	Bruker Corp.
תוכנת Bruker Multispectral	Bruker Corp
חלקיקים לנטי-ויראליים עם חלבון פלואורסצנטי אדום	GenTarget, Inc.	LVP023
טריפסין לתרבית תאים	קורנינג	25-053-CI
PBS	קורנינג	21-040-CM
(כגון קרם מסיר שיער נאיר)	רכישות מבית מרקחת	לא ישים
	http://imagej.nih.gov/ij/		להורדה חינם
כלי ניתוח (מלקחיים)	מכשיר כירורגי רובוז	כלי ניתוח RS 5130
(מספריים)	מכשיר כירורגי Roboz	RS 5910

קרם אפילציה תוכנת ImageJ