הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לזהות mRNA הספציפי תאים סרטניים המייצג גרורות בתוך רקמת הריאה עכבר.

תקציר

מחלה גרורתית היא ההתפשטות של תאי גידול ממאירים מאתר הסרטן הראשוני לאיבר מרוחק, והוא הגורם העיקרי למוות הקשורים לסרטן ^1. אתרים נפוצים של התפשטות גרורה כוללים ריאות, בלוטות לימפה, מוח, ועצם ^2. מנגנונים המניעים את גרורות אזורים אינטנסיביים של חקר הסרטן. כתוצאה מכך, מבחני יעילים למדידת נטל גרורתי באתרים מרוחקים של גרורות הם אינסטרומנטלי לחקר הסרטן. הערכה של גרורות ריאה במודלים של גידול החלב מבוצעת בדרך כלל על ידי תצפית איכותית ברוטו של רקמת הריאה הבאה לנתיחה. שיטות כמותיות להערכת גרורות כיום מוגבלות לvivo לשעבר ובטכניקות הדמיה מבוססת vivo הדורשות פרמטרים הגדרת משתמש. רב של טכניקות אלה בכל רמת האורגניזם ולא הרמה התאית ^3-6. למרות ששיטות הדמיה חדשות יותר ניצול מיקרוסקופיה רב-פוטון מסוגלות להעריך metastasis ברמה התאית ^7, נהלים האלגנטיים ביותר שמתאימים יותר להערכת מנגנוני הפצה ולא הערכה כמותית של נטל גרורתי. הנה, שיטה במבחנה פשוטה להעריך כמותית גרורות מוצגת. שימוש בזמן אמת PCR (qRT-PCR), mRNA הספציפי תאים סרטניים יכול להתגלות בתוך רקמת הריאה עכבר.

מבוא

ניתוח qRT-PCR מוצע כשיטת להערכת גרורות סרטנית. שיטה זו מוצע כאלטרנטיבה עבור משתמשים שמעוניינים בהערכת גרורות אבל אין גישה לציוד ספציפי כגון ציוד ההדמיה in vivo או מסוגל stereoscope הקרינה. דיון בשיטות נפוצות הוא שהוצגו אחרי הפגנה לאיך ניתוח qRT-PCR יכול לשמש גם כנפרד או כשיטת לוויה להעריך גרורות. יש הליך זה הפוטנציאל לספק ניתוח כמותי של נטל גרורתי.

שיטות סטנדרטית של ניתוח ברוטו, כוללים הדמיה של ריאות תחת סטראו, כמו גם חתך סידורי אחרי hematoxylin ו eosin מכתים (H & E) של רקמת ריאה, הן לכימות, אך מסתמכות במידה רבה על פרמטרים הגדרת משתמש לספירת ^2-5. בעת ההערכה כל ריאות באמצעות סטראו, גרורות משטח רק גדולות הם Visible וניתוח דורש חוקר להיות בעל ידע סביר של מבנה האנטומי ריאות כדי לקבוע מה מהווה נגע גרורתי. תיוג ניאון של תאים סרטניים עם סמן כגון GFP ושימוש בסטראו המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / הפליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר לGFP) מסייע בתהליך זה, אבל הגושים סרטניים משטח רק לזיהוי . בנוסף, הקרינה מזיהום דם, שהוא נראה באותם פרמטרים כמו GFP, עלולה להוביל לזיהוי שגוי של נגעים גרורתי אפשריים.

חתך של הריאה ואחרי צביעת H & E לדמיין גרורות ריאות הוא שיטה שימושית להעריך micrometastases ותהליכים מיקרוסקופיים אחרים, כולל חדירת תאי מערכת חיסון, אך לעתים קרובות דורש שימוש בכל רקמת הריאה להטבעת פרפין, חתך, ונהלים מכתים. לכן, נהלים במורד הזרם אינם אידיאליים הבאים metho זהד. למרות כימות, הליך זה דורש החוקר להעריך במספר רב של סעיפי ריאות מוכתמים לכל בעלי חיים על מנת להבטיח שהניתוח מהווה את כל מבנה 3D של הריאות. כתוצאה מכך, זה סוג של בדיקה הוא לצרוך זמן, יכול להוביל לספירת שגיאה, ומסתמך במידה רבה על ניתוח שיקול דעת חוקר.

כמה בטכניקות ההדמיה vivo (למשל MRI, PET, SPECT) משמש כיום לבצע או לבדוק תהליכים ביולוגיים במודלים של מכרסמים ניסיוניים ^8. בvivo ההדמיה bioluminescent היא שיטה נפוצה המשמשת לרכישת נוף ברוטו של גרורות ^9. טכניקה זו מיושמת בדרך כלל על מנת להעריך את הנוכחות של פעילות העיתונאית לוציפראז בשל ההצטברות של תאים סרטניים, שמתוכננים להכיל אלמנט תגובת לוציפראז, שמתגוררים באיברים מסוימים כמו בלוטת החלב לאחר השתלת תאים סרטניים והריאות על גרורות ספונטניות ¹0. יזואליזציה של פעילות העיתונאית לוציפראז מושרה על ידי הנוכחות של מצע luciferin (D-luciferin). בלוציפראז מזרז decarboxylation חמצוני של D-luciferin לoxyluciferin יצירת פליטת אור. בעוד אינפורמטיבי, שיטה זו מוגבלת על ידי מספר גורמים, כולל יציבות מצע (כלומר מחצית חיים קצרים), הפצה הולמת של מצע שתלוי איך הוא מועבר לחיות ניסוי, ורגישות נמוכה של גילוי ^9. הכשרון עיקרי לטכניקה זו הוא שהיא אינה פולשני, יכולה להתבצע על בעלי חיים, ויכולה להוביל לזיהוי של גרורות תאים סרטניים באיברים רבים שאולי לא נקצר בדרך כלל בנתיחת ^9,10.

היבט חיובי אחד בvivo טכניקות הדמיה הוא שרקמת הריאה היא באין מפריע ומאפשרת לנהלים משניים כמו הטבעת פרפין או כפי שהוצג כאן, ניתוח qRT-PCR. עם זאת, בגלל qRT-PCR הוא theoretically מדד רגיש יותר של זיהוי, הערכה גולמית עשוי שלא לחשוף את המספרים נמוכים של תאי גידול הנוכחיים בריאות. אמנם שימושי, ניתן להחליף את טכניקות ההדמיה שתוארו לעיל או בתוספת שיטת qRT-PCR תיארה כרגע. יש qRT-PCR הפוטנציאל לספק מידה רגישה של mRNA הנגזר גידול בתוך ריאות.

פרוטוקול

הפרוטוקול כדלקמן הנחיות ותקני טיפול בבעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC) והטיפול בבעלי חיים המוסדי שלה וועדת שימוש (IACUC).

1. ריאות Dissection

1. נתיחת גידול החלב (אופציונאלי בהתאם למטרות מחקר והאם הזרקת ניתוח גידול ראשוני או וריד זנב בוצעה).
   1. להרדים עכבר באמצעות מנה קטלנית של ההרדמה isoflurane לפי IACUC ורגולצית אוניברסיטה. לאשר מתת חסד, על ידי נקע בניתוח.
   2. על לוח הקצף, סיכה עם סיכות לנתיחה על ידי הצבת עכבר על גבה עם גפיים התפשטות.
   3. ריסוס עכבר עם 70% אתנול.
   4. בעזרת מלקחיים, לתפוס את החלק התחתון של בעלי החיים במרכז.
   5. שימוש במספריים, לחתוך כלפי מעלה לכיוון הצוואר דרך העור, נזהר שלא לנקב את חלל הצפק של העכבר.
   6. לקצץ עור באיברים לחשוף רקמת גידול.
   7. לנתח את רקמת גידול ויחסי ציבורeserve ידי שיטה מועדפת, כגון הקפאה או קיבעון, לניתוח נוסף (לא נידון בהרחבה בפרוטוקול זה).
2. נתיחת רקמת ריאה.
   1. אם רקמת גידול הייתה לקצור כפי שתוארה לעיל, להצמיד כל עור עודף.
   2. בעזרת מלקחיים, לתפוס הצפק בקצה תחתון של בעלי החיים ולהתחיל לחתוך כלפי מעלה לכיוון בסיס הצוואר.
   3. בזהירות לחתוך לאורך הצדדים שמאל וימין של להיות זהיר, כדי למנוע ניתוק כל כלי דם שעלול לדמם לתוך חלל בית חזה כלוב הצלעות. הסר את עצמות צלעות על ידי חיתוך שמאלה וימינה דרך מנות סרעפת והעליונה של כלוב הצלעות.
   4. בעזרת מלקחיים לתפוס את קנה הנשימה של העכבר ולמשוך קדימה.
   5. לנתק את קנה הנשימה עם מספריים לנתיחה ולהסיר ריאות מעכבר.
      הערה: הלב עשוי להישאר מחובר לריאות. במקרה זה, לנתח בזהירות לב מריאות להיות זהיר, כדי לאסוף את כל חמש האונות (ראה איור 1 ).
   6. לשטוף בעדינות עם PBS להסיר דם עודף.
3. הערכה גסה של רקמת ריאה.
   1. אפשרות 1: in vivo הדמיה.
      1. הדמיה לוציפראז, ~ 10 דקות לפני הדמיה, נותן חיות 150 מ"ג / קילוגרם מינון של luciferin ידי הזרקת intraperitoneal (IP). ריאות תמונת in vivo בבעלי חיים בהרדמה או על ההסרה לאחר הנתיחה (איור 2) ^5.
   2. אפשרות 2: הערכה גולמית.
      1. בדוק ריאות תחת מיקרוסקופ סטריאו לדמיין גושים סרטניים. הערה: אם התאים GFP שכותרתו, מסוגל סטראו הקרינה המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / פליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר) כדי לזהות GFP ניתן להשתמש כדי לבחון ריאות stereoscopically לקרינה לפני העיבוד.
   3. אם ריאות הן להיות מנותחות באופן מיידי, המשך לסעיף "בידוד RNA". אחרת, הצמד רקמות הקפאה באמצעות liquחנקן id או קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.

בידוד 2. RNA

הערה: ניתוח הנציג, RNA היה מבודד באמצעות ערכת בידוד RNA (ראה חומרי רשימה). בעוד הניתוח הנוכחי משתמש המוצר של יצרן אחד ספציפי, מגוון רחב של ערכות בידוד זמין ממספר ספקים מכובדים. בנוסף, שיטות צנטריפוגה שאינה מבוססות ערכה הן גם אופציה. צריך גם להיות מוכן cDNA ממדגם RNA השליטה חיובי, כגון קו סלולארי או פלסמיד, לניתוח עקום סטנדרטי. לחלופין, שליטה חיובית ספציפית לסט הבדיקה תחל ניתן לרכוש (ראה חומרי רשימה).

1. אם באמצעות רקמה קפוא בעבר, לאסוף רקמה קפוא בקרח יבש.
2. Homogenize רקמות באמצעות אחת מהשיטות כגון הבאות: מכתש ועלי טחינה שבוצעה על ידי יד על קרח יבש לאחר הקפאת רקמה בחנקן נוזלי; homogenizer רקמות או התקן ניתוק מכאנילהצעתו של היצרן; sonication, או שיטה מועדפת אחרת.
   הערה: ניתוח הנציג, השיטה המועדפת להומוגניזציה היא sonication.
   1. לניתוח שהוצג באיור 3, להכין מאגר תמוגה (בתנאי בערכת בידוד RNA) ו- 2-mercaptoethanol ביחס של 20 μl 2-mercaptoethanol לכל 1 מיליליטר של חיץ תמוגה. רקמה גלולה ב300 חיץ תמוגה μl בתוספת 2-mercaptoethanol לכל 30 גרם של רקמה וsonicate במשך 10 שניות עם sonicator נקבע על משרעת של 30%.
   2. אם משתמש במכתש ועלי, רקמת קרקע גלולה במאגר תמוגה 300 μl לאחר הטחינה.
3. להוסיף K proteinase 10 μl לחיץ 590 μl TE (10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA). להוסיף פתרון K 600 proteinase μl לכל 300 μl (כלומר לכל 30 מ"ג) של רקמה. דגירה של 10 דקות ב RT.
   הערה: זמן עיכול עשוי להשתנות.
4. צנטריפוגה דגימות ≥13,000 גרם במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות.
5. העברת supernatant לצינורות חדשים.
6. להוסיף 450 אתנול μl (96% -100%) לכל 900 μl של supernatant כדי לזרז RNA.
7. העבר את 700 μl של תערובת lysate / אתנול לעמודה.
8. צנטריפוגה דגימות ≥13,000 גרם דקות 1 כדי לאגד RNA לטור.
9. בטל פסולת נוזלית ולהוסיף supernatant נותר לעמודה ספין שוב.
10. ברגע שכל lysate הוא הסתובב בטור, להוסיף 350 μl של הצפת לשטוף 1 לחלק העליון של דגימות עמודה ו צנטריפוגות ב≥13,000 גרם במשך 30 שניות.
11. בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק.
12. הכן DNase על ידי ערבוב 5 יחידות של DNase אני אנזים עם 5 μl של 10x DNase ו -40 μl של מים חופשיים DNase / RNase לדגימה (נפח כולל של 50 μl / מדגם).
13. הוסף 50 μl של DNase לערבב לכל עמודה והדגירה במשך 15 דקות ב RT.
14. להוסיף 350 μl של הצפת לשטוף 1 לעמודה ו צנטריפוגות סםPles ב≥13,000 גרם במשך 30 שניות.
15. בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק.
16. להוסיף 600 μl של הצפת לשטוף 2 לעמודת ספין 30 שניות ב≥13,000 ז.
17. בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק.
18. הוסף 250 μl של הצפת לשטוף 2 ו צנטריפוגות 2 דקות ב≥13,000 ז.
19. שים חלק מעמודה לתוך צינור אוסף חדש וזורקים צינור איסוף ישן.
20. להוסיף 50-100 μl של מים חופשיים RNase / DNase לעמודה ודגירת דקות 1.
21. ספין 1 דקות ב≥13,000 ז.
22. eluate שנאסף באמצעות עמודה כדי להגדיל את תשואת RNA להפעיל מחדש.
23. לשימוש מיידי, לשמור על דגימות קרח ולהמשיך לכימות. לשימוש מאוחר יותר, הצמד הקפאת קרח יבש או חנקן נוזלי. חנות במקפיא -80 ° C עד צורך.

3. ראשית סטרנד סינתזה

הערה: ניתוח הנציג, טרנסקריפטאז התגובה (RT) בוצעה Fערכת סינתזת irst סטרנד cDNA המיועדת לqRT-PCR (ראה חומרי רשימה).

1. אם דגימות נאספו בעבר, להפשיר צינורות על קרח.
2. למדוד כמות RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
3. באמצעות 0.5-2 מיקרוגרם של רנ"א הכל, לבצע סינתזת גדיל ראשונה באמצעות טרנסקריפטאז ליצור מניית cDNA.
   1. ב, צינורות RNase / PCR ללא DNase / צלחות סטרילי, להכין את תערובת התגובה (טבלת 1). מערבבים בעדינות וצנטריפוגה. לתכנת מכונה סטנדרטית PCR (טבלה 2).
4. לדלל תגובה מוגמרת לנפח רצוי (בדרך כלל 50-100 μl) באמצעות nuclease ללא מים סטריליים.

4. בזמן אמת PCR

הערה: ניתוח הנציג, ירוק SYBR היה בשימוש. עם זאת, כל שיטה העדיפה ניתן להחליף בהתאם לשיקול דעתו של המשתמש.

1. שימוש cDNA שליטה חיובי, להגדיר עקומה סטנדרטית עבור כל קבוצת פריימר.
   1. לניתוח הראה שn איור 3, להכין את העקומה סטנדרטית לHER2 האנושי באמצעות היצרן מומלץ cDNA בקרה החיובי (ראה חומרי רשימה). לGAPDH עכבר, להשתמש בcDNA ריאות שליטה השלילי כדי ליצור עקומה סטנדרטית. עבור כל בדיקה, סדרתי לדלל cDNA 1: 4 כדי לייצר 5 תקנים.
2. לחשב את מספר הדגימות כוללת, אשר צריך לכלול את העקומה סטנדרטית ודגימות ניסוי.
   הערה: הניתוח שתואר כאן, 2-3 חזרות ניסיוניות לדגימה נותחו. ניתוח עקום סטנדרטי בוצע כדי ליצור מודל רגרסיה ליניארית פשוט שניתן ליישם על מנת לקבוע את הסכום היחסי של HER2 וGAPDH לדגימה לחשב כמות מנורמלת סופית. ניתוח זה גם יבטיח כי יעילות פריימר היא נאותה לניתוח ביד.
3. בRNase / צינור סטרילי, ללא DNase, להכין תערובת אב (לוח 3).
   1. לחשב עמון תערובת אמןלא לדגימה. בהיקף של עד למדגם אחד או יותר. השתמש בתערובת אב כל גן ניסויי של עניין, כמו גם בקרה פנימית כגון GAPDH. השתמש בצבעי יסוד לGAPDH בריכוז סופי של 200 ננומטר.
      הערה: הבקרה הפנימית היא שימושית במיוחד כאשר מנסים להבחין בין מקור תא האנושי ועכבר.
      הערה: ריכוז פריימר לHER2 היה מותאם ונקבע על ידי היצרן.
4. הכן צלחת בדיקה המכילה cDNAs μl 1 מתאים לכל דגימה סטנדרטית או ניסיונית. להקצות מדגם cDNA לפחות 1 / גם עבור כל בדיקה פריימר. להוסיף 19 μl של תערובת אמן בכל טוב עבור כל בדיקה פריימר.
   הערה: נתוני הנציג באיור 3, דגימות cDNA נותחו בשני עותקים עבור כל בדיקה פריימר וגרף כממוצע של שתי דגימות.
5. תגובה לרוץ בqRT-PCR מכונה באמצעות מומלצת או נבדקה פרוטוקול PCR בעבר. ראה טבלת 4 לפרוטוקול PCR משמש לנתונים הנציג באיור 3 ואיור 4.

תוצאות

מעבר לזמן שנדרש כדי לבצע את החיסון הראשוני של תאי גידול לבעלי החיים הניסיוניים ואם ביצוע, עיקרי בניתוח גידול vivo, קציר הרקמות, בידוד RNA, וניתוח qRT-PCR הוא הליך 1-2 יום (איור 1) .

דוגמא לניתוח ברוטו היא ההדמיה bioluminescent להעריך תאים סרטניים בתוך רקמת הריאה. כאן, ניסוי tumorigenesis החלב בוצע כדי להעריך אם סו...

דיון

פרוטוקול זה מתאר שימוש בqRT-PCR להעריך גרורות תאים סרטניים החלב לריאות תוך שימוש במודל עכבר xenograft. הוא הכיר בכך שטכניקות אחרות, כוללים הדמיה bioluminescent, זמינות והם גם יעילים לאיתור גרורה למרות שיש ערכים משלהם ומגבלות. הנתונים שהוצגו עולה כי qRT-PCR מספק אמצעי אפקטיבי של גילוי mRNA הנגזר גידול ברקמת ריאה לכימות של גרורות כוללת. מוצע כי ניתוח qRT-PCR מספק שיטה משנית שיכול להשלים או לבצע במקום טכניקות הדמיה אלה. טכניקה זו עשויה להיות מתאימה ביותר עבור סביבות מחקר עם גישה מוגב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-מרקפטואתנול	פישר	BP176-100
DNAse	תרמו מדעי	EN0521
ערכת בידוד RNA GeneJet	Thermo Scientific	K0732
iScript שעתוק הפוך סופרמיקס עבור QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq אוניברסלי SYBR ירוק סופרמיקס	ביו-רד	172-5121
בדיקה ירוקה PrimePCR SYBR: ERBB2, אנושי	ביו-רד	100-25636
תבנית PrimePCR לבדיקה ירוקה של SYBR: ERBB2, אנושי	ביו-ראד	100-25716
		פריימר gapdh	עבור-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGG