שימוש יחיד Sensillum הקלטה לזיהוי תגובות חוש הריח Neuron של באגס במיטה לSemiochemicals

סיכום

פשפשי מיטה מסתמכים על נוירונים של קולטני ריח השוכנים ברגישות הריח של האנטנות שלהם כדי לזהות סמיוכימיקלים בסביבה. תוך שימוש בהקלטת סנסילום יחידה, אנו מדגימים שיטה להערכת תגובת פשפש המיטה לסמיוכימיקלים ולחקור את תהליך הקידוד הכרוך בכך.

תקציר

מערכת חוש הריח החרקים ממלאת תפקיד חשוב באיתור semiochemicals בסביבה. בפרט, sensilla המחושים שבית נוירונים בודדים או מרובים בפנים, נחשב על מנת להפוך את התרומה הגדולה בתגובה לגירויים הכימיים. ישירות על ידי הקלטת פוטנציאל פעולה בSensillum חוש הריח לאחר חשיפה לגירויים, הקלטת Sensillum יחידה טכניקה (SSR) מספקת גישה רבת עוצמה לחקירת התגובות העצביות של חרקים לגירויים כימיים. לבאג המיטה, שהוא טפיל אדם ידוע לשמצה, סוגים שונים של Sensillum חוש הריח כבר מאופיינים. במחקר זה, שהראינו תגובות עצביות של sensilla חוש הריח באג המיטה לשני גירויים כימיים והתגובות תלויות-מינון לאחד מהם בשיטת SSR. גישה זו מאפשרת לחוקרים לערוך הקרנה מוקדמת לגירויים כימיים בודדים בsensilla חוש הריח באג המיטה, אשר יספק מידע רב ערך עבור development של משיכה באג המיטה חדשה או דוחי והטבות מאמצי שליטת באגים המיטה.

מבוא

באג המיטה הנפוץ Cimex lectularius L (פשפשאים: Cimicidae), כectoparasite זמני, הוא חרקים מוצצי דם מחויבים, מה שאומר שההישרדות, הפיתוח, והרבייה שלהם דורשים מקורות דם ממארחים, כוללים שני בני אדם ובעלי חיים ^1,2. למרות העברת נגיף דווחה לעתים רחוקות בגלל ג lectularius, המטרד העוקצני שנוצר על ידי התפשטות משפיע ברצינות מארחים פיזי ופסיכולוגי ^3. ההקדמה והשימוש נרחב בחומרי הדברה כימיות, במיוחד DDT, הורידו את הסיכון של מכת ועד סוף 1950 היו מכת ברמה כה נמוכה שהם כבר לא היו דאגה ציבורית רצינית. עם זאת, מספר גורמים אפשריים שהביאו להתעוררות מחודשת באוכלוסיות באג מיטה ברחבי העולם, כגון צמצום השימוש בחומרי הדברה, ירידה של מודעות ציבוריות, עלתה נוסעת פעילות, והפיתוח של התנגדות להדברה ^4-9.

אותות כימיים בסביבה מזוהות ומוכרים על ידי חרקים דרך איברי חוש הריח כגון אנטנות ומשושי לסת. Sensilla חוש הריח על אנטנות החרקים לשחק תפקיד מכריע באיתור אותות הכימיים אלה. המולקולות הכימיות להיכנס לציפורן המחושים הדרך נקבוביות על פני השטח הציפורן. Odorant מחייב חלבונים בלאגד הלימפה המחושים למולקולות הכימיות אלה ולהעביר אותם על קולטנים odorant ^10. קולטנים odorant ושיתוף קולטן מהערוץ הלא סלקטיבי יון קטיון על הקרום העצבי, אשר depolarized פעם המולקולות הכימיות אלה מוכרים על ידי קולטנים odorant ^11.

הקלטת Sensillum יחידה (SSR) פותחה כדי לזהות את השינוי תאי בפוטנציאל הפעולה נגרמים על ידי היישום של שני גירויים כימיים או שאינו כימיים. על ידי החדרת אלקטרודה הקלטה לימפה Sensillum ואלקטרודה התייחסותלחלק אחר של גוף החרק (בדרך כלל גם עיניים המורכבות או הבטן), קצב הירי של הנוירונים בתגובה לגירויים יכול להיות מוקלט ^12. שינויים במספר הקוצים מייצגים את הרגישות של החרקים לגירויים ספציפיים. גירויים כימיים של זהויות וריכוז שונים יעוררו תגובות עצביות שונות, עם שיעורי ירי שונים ומבנים זמניים, ולכן יכולים לשמש כדי לחקור את תהליך הקידוד של החרקים לכימיקלים ספציפיים.

לבאג המיטה המשותף, שתי צורות מיניות חולקות את אותו דפוס של sensilla חוש הריח על האנטנות: תשע sensilla מחורץ C היתד, 29 E כמו שיער (E1 ו- E2) sensilla, וזוג אחד כל אחד מDα, Dβ, יתד חלקה Dγ sensilla ^13,14. כנוירונים מרובים זוהו בכל סוג של Sensillum, זה לא קל להבחין פוטנציאל הפעולה מתא העצב שונה שוכנו באותו Sensillum, כך לניסוי זה טוטהמספרי l של פוטנציאל פעולה נספרו off-line לתקופה msec 500 לפני ואחרי הגירוי. מספר פוטנציאלי פעולה לאחר הגירוי היה חסר ממספר פוטנציאלי פעולה לפני הגירוי ומוכפל בשניים כדי לכמת את השינויים בקצב הירי בכל Sensillum פרט בקוצים לשניים ^15.

פרוטוקול

1. הכנה של מכשירים, פתרונות גירויים, ובאגים מיטה

1. הכן פתרון KNO ₂ 50% (w / v) בבקבוק 20 מיליליטר.
2. לחדד שני microelectrodes טונגסטן בפתרון ₂ KNO ב 5 V על ידי טבילת אלקטרודות טונגסטן שוב ושוב פנימה והחוצה מהפתרון.
   1. בערך לחדד את חוט טונגסטן על ידי טבילה כ -10 מ"מ של חוט טונגסטן ובמתוך פתרון KNO ₂ במהירות של 2 מטבלים / שניות לכ -5 דקות, אשר מאוד יכול לצרוך את הקצה הקדמי של חוט טונגסטן.
   2. בעדינות לחדד את האלקטרודה על ידי טבילה על 1 מ"מ של קצה חוט ובמתוך הפתרון במהירות של 2 מטבלים / שניות לדקות לפחות 1 כדי להפוך את נקודה של האלקטרודה בסדר וחדה. בדוק את קוטר קצה האלקטרודה מתחת למיקרוסקופ לעתים קרובות עד שהוא מגיע 0.2-0.5 מיקרומטר, שאמורה להיות בסדר מספיק כדי לנקב את הציפורן של Sensillum חוש הריח באג המיטה.
      שים לב: בעוד חד באופן ידניening אלקטרודה, מהירות הטבילה של חוט טונגסטן לפתרון KNO ₂ אינה קבועה כל הזמן. עם יותר בפועל, זה הרבה יותר קל לשמור על מהירות קבועה יחסית בחידוד האלקטרודה. זמן החידוד הוא גם לא בטוח תלוי איך קנס אלקטרודה צריכה להיות. כאן, קצה האלקטרודה עם הקוטר של ~ 0.2 מיקרומטר די מספיק כדי לנקב באמצעות Sensillum חוש הריח.
3. לדלל כל אחד מהגירויים הכימיים בsulfoxide דימתיל (DMSO) מהמתחם המסודר לריכוז ראשוני של 1:10 נ נ / כפתרון מניות. ליצור סדרה של דילולים עֲשׂוֹרִי תלוי כמה מינונים נדרשים בניסוי, שוב עם DMSO, מכל אחת ממניות הפתרונות עבור כל כימי. הנה, להשתמש 10% (+) - β-pinene וeucalyptol.
4. מניחים את הימים שלא קבלו מזון או שבעה לאחר האכלה-פשפשים בוגרים (זכר או נקבה) מFt. המושבה דיקס (מתנה מד"ר היינס באוניברסיטת קנטאקי) לשימוש בtהוא להתנסות בצלחת פטרי.
   הערה: אין מספר מדויק לפשפשים ממוקמים בצלחת פטרי. זה יכול להיות כמה או הרבה.

באג המיטה 2. אנטנות הכנה

1. לטשטש פשפשים על קרח (2-3 דקות).
2. לתקן שתי האנטנות וגוף חרק על coverslip מיקרוסקופ עם קלטת דו צדדי ולהסיר את הרגליים עם מספריים עדינים.
3. השתמש בסיכה קטנה לגעת אנטנות בעדינות כדי לתקוע אותם בקלטת בהתמדה.
4. לנוח coverslip נגד כדור קטן (~ קוטר 1 סנטימטר) של שעוות שיניים כדי להקל על מניפולציה ולהתאים אותו לזווית מתאימה (~ 90 מעלות) לאלקטרודה ההקלטה (איור 1).
5. ברגע שהשיג, למקם את הבאג המיטה תחת מיקרוסקופ סטריאו, להפעיל את מקור האור הקר ולהתאים את עוצמת התאורה עד האנטנה בבירור מוצגת, ולהתמקד במיקרוסקופ השוטון השני של אנטנת באג המיטה בהגדלה גבוהה (720X) .
   הערה: עוצמת ההארה השתמשה בניסוי לא נרשמת, שבאמת תלוי איך העיניים של הנסיין מרגישים את עוצמת התאורה.

3. יחיד Sensillum הקלטה

1. חבר את מגבר קדם (10X) עם בקר רכישת אות, אשר מחובר עם המחשב להקלטת אות והדמיה. הפעל את המחשב ולהפעיל את התוכנה, למשל, AutoSpike32 ולחץ על המצב "שיא" משורת התפריטים. לאחר מכן לבחור את "גל" כדי להתחיל בהקלטת אותות הגל.
   הערה: קו שטוח פועל מהשמאל לימין של המסך שוב ושוב צריך עכשיו להיות גלוי. הנה, חלון ההקלטה נמשך 40 שניות. הקלטת גל מקס היא 10 שניות. קצב דגימה נבחרת הוא 96000 וקצב דגימה דיגיטלי הוא 240. יש 0% קיזוז וללא סינון, אין תיקון לאותות ההקלטה. כל הגדרות הפרמטר הבאות בתוכנה ניתן לשנות בהתאם לצורך.
2. הפעל את הרמקול המחובר למגבר קדם, המשמש להציג את מצב גוון לתגובות עצביות מSensillum מחושים.
3. הכנס את האלקטרודה ההתייחסות לתוך הבטן של באג המיטה התייצב.
   הערה: אלקטרודה ההתייחסות נערכה על ידי מתכת עומדת מצורף מגנטית לאוויר-השולחן.
4. לאחר האלקטרודה ההתייחסות כבר מחוברת לבטן של באג המיטה, להזיז את האלקטרודה ההקלטה, אשר מחוברת למגבר קדם והופעלה על ידי micromanipulator, לקראת הסוף האחורי של האנטנה של באג המיטה.
5. כאשר האלקטרודה ההקלטה היא במגע עם הקצה הימני של האנטנה, לעבור על המיקרוסקופ ולאתר את האלקטרודה בהגדלה נמוכה.
6. התאם את האלקטרודה ההקלטה תוך הגדלת בהדרגה את ההגדלה עד ששתי האלקטרודה וSensillum המחושים נמצאים באותו המישור ונראה בבירור מתחת למיקרוסקופ.
   הערה: בשלב זה, הוא מיקרוסקופ רגילly בהגדלה הגבוהה ביותר.
7. הכנס את האלקטרודה ההקלטה לתוך הפיר של Sensillum באמצעות micromanipulator וללכת קצת יותר לעומק אם רעש הרקע הוא גבוה בהשוואה לפוטנציאל הפעולה.
8. ברגע שפוטנציאל פעולה ברור הם נצפו מSensillum נרשם, למלא micropipette עם 10% (+) - β-pinene. השתמש בmicropipette להפקיד aliquot 10 μl של 10% (+) - β-pinene על רצועת נייר סינון (~ 3 x 15 מ"מ) ממוקמת בתוך הזכוכית פיפטה פסטר.
   1. חבר את פיפטה נטענת בשקע של זרימת דופק הצינור של בקר הגירוי ולמקם את קצה פיפטה לתוך החור הקטן בצינור מכוון את האנטנה.
9. כאשר כל החיבורים הללו התייצבו, לדכא footswitch של בקר הגירוי לספק נשיפת 0.5 שניות של גירוי (0.5 ליטר / דקה) לתוך זרם אוויר humidified הרציף. ההקלטה של ​​פוטנציאל פעולה תהיה ביוזמתו זמנית כאשר footswitch הוא מדוכא. תהליך ההקלטה יהיה אחרון במשך 10 שניות החל 1 שניות לפני הגירוי.
10. לספור את פוטנציאל הפעולה לא-מקוון לשתי תקופות 500 אלפיות שניות, אחד לפני ואחד אחרי הגירוי. לחסר כל שינוי בשיעור העלייה החדה במהלך 500 לאחר הגירוי msec מהפעילות הספונטנית שנרשמה במהלך 500 האלפיות השניים לפני ולהמיר את הספירה לקנה המידה המקובלת של / קוצים שלהם על ידי הכפלה על ידי 2.

החלפת 4. Stimulus בSSR

1. ברגע שfootswitch כבר מופעל, לספק 10% (+) - β-pinene בפיפטה על אנטנות באג המיטה ולהקליט את התגובה לodorant הספציפי הזה במשך 10 שניות, לאחר שטפטף מוסרת.
2. תווית אחרת פיפטה החדשה עם eucalyptol 0.001% להיבדק. מניחים חתיכה קטנה של נייר סינון עליהם 10 μl של הגירוי יושמה, לפיפטה החדשה.
3. חכה 2-5 דקות עד שהגירוי הוא vapori לחלוטיןzed בפיפטה הזכוכית. צרף את פיפטה על השקע של זרימת דופק הצינור.
4. הכנס את קצה פיפטה לתוך החור הקטן של הצינור מכוון את האנטנה. לדכא footswitch ולהתחיל הקלטת 10 שניות.
5. נתק את פיפטה ולהכין פיפטה אחרת עם eucalyptol 0.01%.
6. בדוק את כל שאר המנות של eucalyptol (מ0.001% עד 10%) בsensilla המחושים להתבונן התגובות תלויות-מינון. מבחן מרוב לדלל את המינון לפחות לדלל.

תוצאות

הקלטת Sensillum יחידה היא טכניקת חקירה רבת עוצמה המשמשת במחקרים של אקולוגיה כימית חרקים ופיזיולוגיה עצבית. חוקר את התגובות העצביות של חרקים לתרכובות נדיפות שונות, במיוחד אלה שנחשבו מבחינה אקולוגית הקשורים להישרדות ולהתפתחות של החרקים, לא רק נותן לנו תובנות רבות ערך לתהליך olfaction חרקים, אבל גם פותח אפיקים חדשים ומבטיחים שעלולה להוביל לפיתוח של חומרים כימיים חדשים שימושיים להדברת מזיקים.

דיון

הטכניקה יחידה Sensillum ההקלטה נעשתה שימוש נרחב בבדיקת התגובות העצביות של חרקים כגון זבובי פירות, יתושים וחרקים במיטה לגירויים כימיים שונים בסביבה. גירויים כימיים אלה לעתים קרובות הם מומסים ובדילול מלא בממס נפוץ כדי להכין מנות שונות של טיפולים. עם זאת, ממסים שונים יכולים לייצר שיעורי שחרור שונים לגמרי לגירויים. מחקרים קודמים על כמה חרקים נחקרו בהרחבה כגון תסיסנית melanogaster, אנופלס gambiae, quinquefasciatus Culex וAedes aegypti לי ב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חוט טונגסטן	A-M SYSTEMS	#716500	משמש להכנת האלקטרודה
KNO2	Sigma	#310484	משמש לחידוד חוט הטונגסטן
ספק כוח AC	BK Precision	1653A	מתן המתח בחידוד חוט הטונגסטן
Leica Z6 APO מיקרוסקופ	Leica	10447424	משמש לתצפית על הרגישות
בקר סימולוס	Syntech	CS-55	משמש לשליטה ביישום הגירוי
בקר רכישת USB 4 ערוצים	Syntech	IDAC-4	תצוגה בזמן אמת על המסך של כל האותות לפני ובמהלך ההקלטה
מקור אור	SCHOTT	A20500	מתן מקורות אור לתצפית
Micromanupulator	Leica	115378	משמש לתנועה קלה של רמקול אלקטרודה
	Juster	95a	מחובר עם בקר רכישה IDAC-4 ומספק צליל לאות
מעמד מגנטי	Narishige	GJ-1	משמש להחזקת אלקטרודת הייחוס, פשפש מיטה מיוצב וצינור אספקת גירוי
TMC שולחן בידוד רטט TMC		63-500	משמש לבידוד הרטט מהציוד
Coverslip	Tedpella	2225-1	משמש להחזקת פשפש המיטה
סרט דו צדדי	3M	XT6110	משמש לייצוב פשפש המיטה על קליפ הכיסוי
שעווה דנטלית	Dentakit	DK-R012	משמש לתמיכה בקליפ הכיסוי שבו פשפש המיטה מיוצב