הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

סיכום

על ידי השתלת חרוזים ספוגים בגורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות לעוברים מתפתחים, ניתן לבדוק ישירות את השפעותיהם in vivo. בפרוטוקול זה מושתלים חרוזים בניצן הגפה כדי לקבוע את ההשפעות של מולקולות אלו על ביטוי גנים והעברת אותות.

תקציר

שימוש בעוברי עוף אפשר לבדוק ישירות את ההשפעות של שני גורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות על ביטוי גנים והפעלה של מסלולי העברת אותות. טכניקה זו מאפשרת המשלוח של מולקולות איתות בשלבי התפתחות מוגדרות במדויק לזמנים מסוימים. לאחר ניתן לקצור זו עוברים וביטוי גנים בדקו, למשל, על ידי הכלאה באתר, או הפעלה של מסלולי העברת אותות נצפו עם immunostaining.

בחרוזים זה וידאו הפרין הספוג בFGF18 או חרוזים 1-X2 AG הספוג בU0126, מעכב MEK, הם מורכבים לניצן האיבר באוב. זה מראה כי FGF18 גורם ביטוי של Myod וזירחון ERK וביטוי Myod שני אנדוגני וFGF18 המושרה הוא מעוכב על ידי U0126. חרוזים הספוגים באנטגוניסט חומצה רטינואית יכולים להגביר אינדוקציה Myod מוקדמת על ידי FGF18.

גישה זו יכולה להיות לנואד עם מגוון רחב של גורמים שונים צמיחה ומעכבים ומותאם בקלות לרקמות אחרות בעובר המתפתח.

מבוא

עוברי עופות סיפקו כלי רב עוצמה ללימוד פיתוח במשך שנים רבות ^1. אחד מהמאפיינים השימושיים ביותר שלהם הוא שהם קלים יחסית לתמרן. פיתוח חיצוני מאפשר לפתוח את הביצה כדי לגשת לעובר ולבצע micromanipulations השונים, כולל דוגמאות, כגון מערכת הכימרה שליו-חומוס הקלאסית ללימוד תא גורל ^2,3, ההזרקה של רטרווירוסים לביטוי יתר ברקמות ספציפיות במהלך פיתוח ^4,5 ותרבות explant לזהות מקורות איתות התפתחותית ^6. לאחרונה מפלצות שנוצרו בין מארחים ללא תווית עם שתלים מקו עוף מהונדס להביע GFP הראה כי שילוב של השתלה קלסית ושינוי גנטי יכול לספק תובנות חשובות פיתוח ^7,8.

הקלות שבה ניתן להשפיע עובר העופות הפכה אותו מודל מצוין לחקר איברפיתוח ^9. היישום של גורמי גדילה ספציפיים לאיברי פיתוח in vivo כבר סייע בזיהוי גורמים המשנים דפוסי איבר ^10,11 וממשיך לספק תובנות תהליך זה ^12. גישה זו שימשה גם כדי ללמוד את הגורמים המווסתים את התפתחות שרירים וחשפה תפקידים למספר רבים של אותות כגון ¹³ Wnts, ¹⁴ ו ^-15 BMPs HGF.

לאחרונה טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לחקור את אותות שליטה ביטוי גני myogenic בניצן האיבר והראתה כי אינטראקציות בין FGF18 וחומצה רטינואית יכולות לשלוט על העיתוי של ביטוי Myod ^16. באמצעות שילוב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות שניתן לטעון על חרוזים ולאחר מכן השתילו ישירות לתוך רקמות ספציפיות בשלבי התפתחות מוגדרים נותנת ההזדמנות להתערב כמעט בכל זמן ובאזור במהלך פיתוח. זה נעשה שימוש כדי Investigate תהליכים רבים, כולל דפוסי somite ^17,18, מפרט עצבי ^19, הגירה עצבית פסגת ²⁰ והארכת ציר ^21.

כאן אנו מתארים שיטה להשתלת חרוזים ספוגים באו גורמי גדילה או מעכבים לפיתוח גפיים עוף. זה נעשה שימוש כדי לקבוע את ההשפעות של אותות אלה על ידי ניתוח myogenesis ביטוי שריר גן ספציפי עם הכלאה באתר. אנו מתארים שתלים או באמצעות חרוזים הפרין ספוגים, המשמשים לגורמי גדילה, או חרוזים 1-X2 AG למולקולות קטנות הידרופובי כגון חומצה רטינואית או מעכבי מולקולה קטנים של מסלולי איתות ספציפיים. עם זאת חרוזים אחרים זמינים גם אשר היו בשימוש כדי לספק את שני ²² FGFs ושש ^23.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: כל הניסויים האלה לעקוב אחרי הטיפול בבעלי החיים וקווים מנחים אתיים של אוניברסיטת נוטינגהם.

1. הכנת חרוזים הפרין להארכה

1. לשטוף חרוזים הפרין ביסודיות בPBS לפני השימוש. הערה: ניתן לאחסן חרוזים על 4 מעלות צלזיוס כתרחיף בPBS.
   1. בחר חרוזים להשתלה על ידי הוצאתם מהמנייה עם טפטפת 20 μl לירידת 1 מיליליטר של PBS. לאחר מכן להשתמש micropipette מוגדר 2 μl להעביר חרוזים לירידה של 20 μl של PBS בצלחת פטרי 3 סנטימטר. בחר חרוזים מבוססים על גודל ו, באמצעות סטריאו מיקרוסקופ לנתח, להעביר חרוזים נבחרו עם קצה פיפטה P2; הסובבים 100 מיקרומטר הקוטר הוא אידיאליים.
2. הסר את PBS מהחרוזים. להסיר את רוב הנוזל עם טפטפת μl 20 ואת הנוזל שיורית על ידי פעולת נימים עם מלקחיים שענים בסדר. שים לב: חשוב להסיר כמה שיותר כך צמיחת פקטוr אינו מדולל כאשר הוא הוסיף לחרוזים.
3. פיפטה גורם הגדילה ישירות על חרוזים. לFGF18 להוסיף 0.5 μl של FGF18 רקומביננטי מחדש ברמה של 0.5 מ"ג / מיליליטר בBSA 0.1% ב PBS. מניחים כמה טיפות של מים בקצוות של המנה, כדי למנוע את הנוזל מתאדה מ.
4. דגירה חרוזים עבור שעה 1 ב RT. הסר את טיפות מים מהצלחת עם פיפטה פסטר ומניח על קרח מוכן להשתלה.
5. אם נדרש העברה (לחרוזים שקופים) 4-5 חרוזים 2% פנול אדומים לפני השתלה כדי לעזור לחזות אותם. יש לשטוף בPBS לפני העברה לעובר.

2. הכנת חרוזים 1-X2 AG להארכה

1. לפני שימוש derivatize חרוזים עם 0.2 חומצה פורמית N.
   1. כדי לעשות שימוש זה מרית להעביר חרוזים לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 1ml של 0.2 חומצה פורמית N ולשטוף על פלטפורמה רועדת עבור שעה 1.
   2. ואז להסיר את החומצה פורמית עם טפטפת P1000 ולהחליף עם 1מיליליטר של מים. לשטוף עבור שעה 1 ולחזור על שש פעמים כדי להסיר נותר חומצה פורמית.
   3. הסר נוזל שנותר עם טפטפת P1000 ולאחסן את החרוזים על 4 מעלות צלזיוס. הערה: אין צורך להסיר את כל שאריות המים בשלב זה.
2. הסר גלולה קטנה של חרוזים של כ 5-10 μl נפח מהמניות בעזרת מרית קטנה לצלחת פטרי 3 סנטימטר ולהוסיף 1 מיליליטר של DMSO (או לפי ממס התרופה מומסת ב). הערה: זה אמור לספק כמה מאה חרוזים שממנו ניתן לבחור את הגודל הנכון.
3. לאחר מכן להשתמש פיפטה P2 מוגדרת 2 μl להעביר חרוזים של כ -100 מיקרומטר קוטר לירידה של 20 μl של ממס בצלחת פטרי עוד 3 סנטימטר.
4. הסר ממס עם טפטפת μl 20 וכל ממס שייר עם טפטפת 2 μl. החלף עם 20 μl של התרופה שיש להחיל.
   הערה: לעקביות לפזר את התרופה בריכוז של 100 מיקרומטר בDMSO (או שאי פעם ממס משמש),aliquot לתוך 20 μl ולאחסן ב -80 ° C כמו כמה מעכבי מולקולה קטנים אינם יציבים ועדיף להימנע מהקפאה-הפשרה חוזרת ונשנית. אם יש צורך אז לדלל את התרופה לריכוז הרצוי לפני השרייה חרוזים. ריכוזים יעילים ייתכן שיהיו הצורך לקבוע באופן אמפירי לכל תרופה.
5. דגירה עבור שעה 1. להגן מפני אור רב של מולקולות אלה הם רגישים לאור.
6. לפני השתלת העברה 4-5 חרוזים עם טפטפת P2 מוגדר 2 μl לμl 20 של 2% פנול אדומים מומס במים. לבצע שלב זה באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו לדמיין את החרוזים. הסר חרוז אחד עם מלקחיים שענים קנס או לולאת חוט ולשטוף בPBS לפני העברה לעובר. אל תשאירו חרוזים ב 2% פנול אדומים ליותר מ -15 דקות לפני השימוש כמו זה יכול לגרום לאובדן של פעילות.

3. הכנת מחטי טונגסטן

1. חותך חוט טונגסטן קנס ל3-4 סנטימטר אורך. הכנס חתיכת חוט אחד לסוףפיפטה פסטר זכוכית ולהמס במבער בונזן לתקן בעמדה. הכן עד 10 מחטים על מנת להבטיח כי יש חלקי חילוף אם הם ניזוקו במהלך שימוש.
2. הנח את קצה החוט לתוך להבת מבער ולהחזיק אותו שם עד טונגסטן זוהר לבן והקצה חד (כ 2-3 דקות). הערה: במהלך שימוש המחט ניתן לנקות ו- חידד מחדש במבער בהתאם לצורך.
   הערה: גם מחטים אלה יכולים לשמש כדי להפוך את הלולאות להעברת חרוזים. לגעת בעדינות את המחט לספסל וזה יהיה לכופף כדי ליצור לולאה.

4. עוברים הכנה לתל חרוז

1. דגירה ביצים עם סופו של הדבר הבוטה עד שהם מגיעים לשלב הרצוי (3-5 ימים עבור רוב מניפולציות ניצן האיבר). שימוש בברז מלקחיים בוטה על הקצה הקהה לשבור את הקליפה ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי להסיר את הקליפה ולחשוף את העובר. ודא קרום קליפת הביצה הוא גם הוסר.
   הערה: ניתן להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS עם פיפטה פסטר לסייע בזה אם הקרום נדבק לחלמון. בעדינות פיפטה PBS על פני השטח של החלמון, לתפוס את הקרום עם המלקחיים, נזהר שלא לפגוע בחלמון, ומשוכים בעדינות מהביצה.
2. הסר עד 5 מיליליטר של חלבון מן הביצה עם מזרק 10 מיליליטר ומחט 19 G. קח רק את מה שנחוץ כדי להבטיח את העובר לא ליצור קשר עם הקלטת משמשת לאטום את הביצה כהסרה של נפחים גדולים יותר יכול להפחית את שיעורי הישרדות עובר.
3. כדי להמחיש את העובר להוסיף 5-6 טיפות של דיו הודו אמנים עד 15 מיליליטר של PBS המכיל 100 פניצילין U ו 0.1 מ"ג סטרפטומיצין / מיליליטר. להזריק 0.5-1 מ"ל ישירות תחת העובר עם מזרק 1 מיליליטר ומחט 25 G.
4. להוסיף 2-3 מיליליטר של PBS עם 1% בסרום עוברי עגל ופניצילין 100 U ו 0.1 מ"ג סטרפטומיצין / מיליליטר לתוך הביצה על מנת להבטיח את העובר אינו מייבשים. בעזרת מלקחיים שענים חידדו להסיר את קרום vitelline ולפתוח את amnion מעל ניצני איבר הפיתוח. להבטיח את העובר לא להתייבש ו, במידת הצורך, להוסיף עוד PBS / FCS.
   הערה: ניצני האיבר ניתן לראות צמחים לזווג בכנף של העובר באופן ברור. בשלבים אלה העובר יהפוך הלוואי כגון הנכון הוא בדרך כלל עליון. כתוצאה מכך היא בדרך כלל קלה יותר להרכיב חרוזים לגפיים תקין ולהשתמש באלה עזבו כפקדים נגדי.
5. השתמש בחוט טונגסטן חידד לעשות חתך לניצן האיבר שבו חרוז יהיה מושתל. הימנע חיתוך לאורך כל הדרך ניצן האיבר שבו אפשרי אם כי בשלבים צעירים זה קשה.
   הערה: בעוברים גדולים יותר (שלב HH 22 ומעלה) ניתן לבחור אזורים ספציפיים של ניצן האיבר להשתלה, אך בשלבים צעירים זה קשה יותר כאיבר הניצן עצמו הוא קטן. כמו כן, חשוב לזכור כי ניצן האיבר יגדל עבר חרוז המורכבים כל כך, במיוחד בשלבים צעירים, חרוז יישאר בגפה הפרוקסימלית.
6. להרים חרוז משני גורם הגדילה או תרופה או באמצעות wa קנס נוסףמלקחיים tchmakers או לולאה עשויה ממחט טונגסטן. אם חרוז כבר ספוג באו DMSO או פנול אדום, לשטוף בPBS לפני היישום לעובר. העבר את חרוז לעובר עם המלקחיים / לולאת חוט. לאחר מכן השתמשתי בחוט טונגסטן חידד להכניס את חרוז לתוך החתך.
7. להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS / FCS לביצה להבטיח כי העובר נשמר התייבשות, אך להימנע יישום ישירות על העובר עצמו כמו זה יכול לגרום נזק לעוברים ולגרום חרוז שחלץ. לאטום את הביצה עם קלטת ולחזור לחממה.

תוצאות

בשלב HH 21 Myod לא בא לידי ביטוי בפיתוח myoblasts איבר למרות הכתמה ניתן לראות בmyotome של somites הפיתוח (איור 1 א). איור 1 מציג הכלאה באתר לMyod 6 שעות הבאות שתל חרוז FGF18. Myod מושרה בmyoblasts הקרוב לחרוז בעוד אין ביטוי באיבר הנגדי. שיתוף השתלת חרוז הספוג בU0126, מעכב ספציפי של MEK, האינדוקציה FGF18 לוקים של Myod (איור 1 ג). כמו כן השתלת חרוז U0126 בשלב HH 21 ומחפש ביטוי Myod לאחר 24 שעות מפחיתה את הביטוי אנדוגני של M...

דיון

השימוש בשתלי חרוז מיושמים ישירות לפיתוח רקמות באובו הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח את התפקיד של איתות גורם גדילה במהלך הפיתוח נותן שליטה ללא תחרות על השלב ההתפתחותי שבו הם מיושמים ומשך חשיפה.

הבחירה של החרוזים לכל סוג של מולקולה חשובה. מולקולות קטנות הידרופובי, כגון המעכבים המתוארים כאן וחומצה רטינואית, בדרך כלל נקשרות גם לחרוזי 1-X2 AG derivatized למרות שיש צורך לבדוק את האפקטיביות של כל מעכב בחרוזים אלה באופן אמפירי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חרוזי אקריליק הפרין	Sigma	H5263	חרוזי האקריליק-הפרין המשמשים הופסקו. עם זאת ניתן להשיג מוצר חלופי, חרוזי אגרוז הפרין, חתול מס' H6508. אלה שקופים כל כך קשה לעבוד איתם אך ניתן לצבוע אותם באדום פנול באותו אופן כמו חרוזי AG 1-X2,
חרוזי AG 1-X2	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel חרוזים כחולים	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	חרוזים אלה שימשו עם מגוון גורמי גדילה כולל Shh ו-FGFs וניתן להשתמש בהם להחלפת חרוזי הפרין
FGF18	Peprotech	100-28	השעו ב-PBS עם 0/1% BSA, הכינו מינון חד פעמי של 0.5-1ul ואחסנו ב-80&C. אצוות וספקים יכולים להשתנות ולכן יש לבדוק ריכוזים שונים כדי לקבוע מינון יעיל.
U0126	איתות סלולרי	9903	בצע מלאי של עד 20 מ"מ ב-DMSO ואחסן במחירים חד פעמיים ב-80 מעלות צלזיוס.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	השעו ב-DMSO ואחסנו בכמויות חד-פעמיות בטמפרטורה של -80&80 מעלות צלזיוס.
דיו הודי שחור	Windsor and Newton	5012572003384 (30 מ"ל)	בעוד שקיימות חלופות למוצר זה יש לנקוט בזהירות מכיוון שחלק מהדיו רעיל לעוברים
חוט טונגסטן, קוטר 0.1 מ"מ. 99.95%	Alfa Aesar	10404
פניצילין / סטרפטומיצין	Sigma	P0781	מדולל פי 100 ב-PBS/דיו ו-PBS/FCS