MRI פונקציונלי optogenetic

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים וניתוח הנתונים הנדרשים לביצוע מוצלח של הדמיית תהודה מגנטית תפקודית אופטוגנטית (ofMRI). ofMRI היא טכניקה חדשה המשלבת קריאת fMRI בשדה גבוה עם גירוי אופטוגנטי, ומאפשרת מיפוי ספציפי לסוג התא של מעגלים עצביים פונקציונליים והדינמיקה שלהם על פני כל המוח החי.

Abstract

ניתן להשיג את חקירת הקישוריות התפקודית של מעגלים עצביים מדויקים על פני כל המוח השלם באמצעות הדמיית תהודה מגנטית תפקודית אופטוגנטית (ofMRI), שהיא טכניקה חדשה המשלבת את הרזולוציה המרחבית הגבוהה יחסית של fMRI בשדה גבוה עם הדיוק של גירוי אופטוגנטי. סיבים אופטיים המאפשרים העברת אורכי גל ספציפיים של אור עמוק למוח in vivo מושתלים באזורי עניין על מנת לעורר באופן ספציפי סוגי תאים ממוקדים שהושרו גנטית לבטא תעלות מוליכות טרנס-ממברנות רגישות לאור, הנקראות אופסינים. fMRI משמש כדי לספק שיטה לא פולשנית לקביעת התגובה הדינמית הגלובלית של המוח לגירוי אופטוגנטי של מעגלים עצביים ספציפיים באמצעות מדידת האות התלוי ברמת החמצן בדם (BOLD), המספק מדידה עקיפה של פעילות עצבית. פרוטוקול זה מתאר את בניית שתלי הסיבים האופטיים, ניתוחי ההשתלה, ההדמיה עם פוטוסטימולציה וניתוח הנתונים הנדרשים לביצוע מוצלח של MRI. לסיכום, הגירוי המדויק ויכולת הניטור של כל המוח של ofMRI הם גורמים מכריעים בהפיכת ofMRI לכלי רב עוצמה לחקר הקונקטומיקה של המוח במצבים בריאים וחולים כאחד.

Introduction

הדמיה תפקודית בתהודה מגנטית optogenetic (ofMRI) היא שיטה חדשנית המשלבת את הרזולוציה המרחבית של fMRI גבוהה בשטח עם דיוק של גירוי optogenetic ^1-11,38, מה שמאפשר מיפוי סוג תא ספציפי של מעגלים עצביים פונקציונלי הדינמיקה שלהם על פני כל מוֹחַ. Optogenetics מאפשר סוגי תאים מסוימים להיות ממוקדים לגירוי על ידי ההקדמה של ערוצי מוליכות הרגישים לאור טרנס-קרום, שנקרא opsins. אלמנטים ספציפיים של מעגלים עצביים הם מהונדסים גנטית כדי לבטא הערוצים הללו, מה שמאפשר אפנון-זמנים אלפית השנייה של הפעילות ללא פגע במוח ^1-15. fMRI מספק שיטה לא פולשנית של קביעת התגובה הדינמית הגלובלית של המוח לגירוי optogenetic של מעגלים עצביים ספציפיים באמצעות המדידה התלויה-דם-חמצן ברמה (BOLD) האות ^16-18, אשר מספקת מדידה עקיפה של פעילות עצבית.

השילוב של שתי הטכניקות הללו, כינת תהודה מגנטית תפקודית optogenetic (ofMRI), יש יתרון על פני שיטות אחרות של פעילות מוח הקלטה במהלך גירוי כגון אלקטרופיזיולוגיה כי זה יכול לספק מבט של המוח כולו ברזולוציה מרחבית גבוהה יחסית. זה מאפשר זיהוי של פעילות עצבית בתגובה לגירוי ממוקד במרחקים גדולים מהאתר של גירוי ללא הצורך בהשתלת אלקטרודות הקלטה פולשנית ^1-11. ofMRI יש יתרון על פני השיטה המסורתית יותר של ביצוע גירוי חשמלי במהלך fMRI, אשר יכולה לגייס תאים מסוגים שונים ליד האלקטרודה ובכך לבלבל את ההשפעה הסיבתית של כל אוכלוסייה ^19. בנוסף, האלקטרודות משמשים גירוי חשמלי והזרם שנוצר יכול לייצר חפצים במהלך ההדמיה MR ^20. ואכן, ofMRI מאפשרת התצפית של ההשפעה על פעילות המוח העולמית מן modulati הספציפיעל מגוון רחב של סוגי תאים באמצעות השימוש בטכניקות מיקוד גנטי מתקדמות כגון מערכת Cre-לקס בחיות מהונדסות או שימוש יזמים. שליטה אופטית קומבינטורית עם ניטור המוח כולו אפשרית עם ofMRI באמצעות השימוש בשתי NpHR המעכבת ChR2 לרגש סוגי תאים מסוימים. ערכת כלי optogenetic הזמין לשימוש ofMRI גם משתפרות במהירות לאורך זמן עם ההקדמה של opsins עם או קינטיקה השתפר אור-רגישות מוגברות, של opsins פונקצית המדרגה התייצבה (SSFOs) או של opsins האדום העביר שעשויות לשלול את דרישת סיבים מושתלים אופטיקה, המאפשר גירוי בלתי פולשני במהלך ההדמיה ^21. אפשרויות אלה אינן זמינות עם גירוי חשמלי.

עם זאת, ממצאי אות נובעות חימום רקמות עקב הצגת אור במוח דווחו ^22, שם שינוי מושרה טמפרטורה של פעמי הרפיה הוכח לייצר pseuלעשות הפעלה. חוקרים ביצוע ofMRI ולכן צריך להיות מודע לבלבל את הפוטנציאל הזה. עם ההגדרה הנכונה ופקדים, הנושא ניתן לטפל. בנוסף, פתרון זמני נמוך יחסית של מדידת תגובת hemodynamic ב fMRI עשוי להיות גורם מגביל עבור יישומים מסוימים של טכניקה זו.

פרוטוקול זה ראשון מתאר את בניית שתלי סיבים האופטיים המאפשרים משלוח של אורכי גל מסוימים של אור עמוק לתוך המוח in vivo. פרוטוקול מכן מתאר את המסירה של וקטור ויראלי קידוד-opsin לאזור המוח מדויק באמצעות ניתוח stereotactic. הבא את הפרוטוקול מתאר את התהליך של MRI פונקציונלי המוח כולו במהלך גירוי האור בו זמנית. לבסוף, הפרוטוקול מתאר ניתוח נתונים בסיסי של הנתונים רכשו.

ראוי לציין, optogenetics המתואר כאן דורש שתל כרוני למסירת אור. עם זאת, שתלי סיבים האופטיים יציבים ביו-compatible, המאפשר סריקה וחקירת אורך של מעגלים עצביים על פני תקופה של חודשים ^23,24.

לסיכום, גירוי מדויק ויכולת ניטור המוח כולו של ofMRI הם גורמים מכריעים בקבלת ofMRI כלי רב עוצמה ללימוד של connectomics של המוח. בנוסף, זה יכול לספק תובנה רומן לתוך המנגנונים של מחלות נוירולוגיות ²⁵ כאשר מצמידים במודלים של בעלי חיים שונים. ואכן, ofMRI נעשה שימוש כדי להבהיר את פעילות הרשת של אזורי משנה בהיפוקמפוס שונים הקשורים התקפים ^8. לכן, מעבדות מעוניינות לענות על שאלות הנוירולוגיה מערכות ברמה תמצאנה טכניקה זו של חשיבות.

Protocol

משפט ואתיקה: הפרוצדורות כאן אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת סטנפורד ועדת שימוש (IACUC).

1. תיקון כבלים הכנת שתלים Ferrule

הערה: למרות תיקון כבלי שתלי טבעת חזוק זמינים מסחריים, ייצור ללא צורך במיקור חוץ אלה מאפשרות עיצובים מיוחדים יעלה פחות.

1. כדי להכין כבל תיקון סיבים להעברת אור הלייזר לשתל במוח, הראשון לבקע של סיבים אופטיים באורך הרצוי.
   1. שימוש קופיץ סיבים, לסיים את הסיב האופטי לייצר קצה שטוח בנקודת הסיום. אם הסיב כבר מצופה עם ז'קט, לערטל את הז'קט עם כלי הפשטה-סיבים מראש.
   2. קליב את הקצה השני של הסיבים האופטיים כדי לייצר את האורך הרצוי עבור הכבל, להבטיח כי שהכבל ארוך מספיק כדי להאריך ממקור האור אל החיה בתוך הנישא שלהסורק.
2. מערבבים כמות קטנה של דבק אפוקסי ב יחס של 1: 1 על פיסת נייר אלומיניום זמן קצר לפני השלב הבא, כמו דבק אפוקסי הופך צמיג מדי 5 דקות שימוש לאחר ערבוב.
3. בעזרת מקל עץ קטן, בעדינות להחיל דבק אפוקסי חלק הסיבים שיונחו בתוך הצד הקעור של טבעת חזוק הקרמיקה ולאחר מכן להחיל טיפה קטנה על פני השטח של הצד השטוח של הטבעת חזוק. לאחר הכנסתו טבעת חזוק, להבטיח כי אורך קטן של סיבים (<0.5 מ"מ) שבולט מן הצד השטוח של טבעת חזוק הקרמיקה. אפשר דבק אפוקסי להקשיח O / N עבור תוצאות אופטימליות.
4. בצד של כבל אופטי תיקון סיבים שיחבר למקור אור הלייזר, בעדינות להחיל דבק אפוקסי חלק סיבים שתונח בתוך הצד הקעור של טבעת חזוק של מחבר PC FC / ולאחר מכן להחיל קטן טיפה על פני השטח של הצד השטוח של טבעת חזוק. לאחר הכנסתו טבעת חזוק, להבטיחכי אורך של סיבים קטנים (<0.5 מ"מ) שבולט מן הצד השטוח של טבעת חזוק. אפשר דבק אפוקסי להקשיח O / N עבור תוצאות אופטימליות.
5. ללטש את קצה שטוח של ferrules לשני הצדדים של הכבל באמצעות דיסק ליטוש באמצעות פינצטה כדי להפעיל לחץ כלפי מטה עדין על טבעת חזוק תוך סיבובים-8 דמות על גיליונות לחיכה תחמוצת אלומיניום (מ 3 מיקרומטר עד 1 מיקרומטר עד 0.3 מיקרומטר חצץ ).
6. לבחון את הקצה השטוח של טבעת חזוק עם מיקרוסקופ בהגדלה 100X. ודא שהמשטח של הקצה השטוח, כולל משטח סיבים האופטי עצמו, ללא שום דבק אפוקסי; להמשיך ליטוש אם דבק אפוקסי נשאר על פני השטח. ודא שמשטח סיבים אופטיים לא שבור או סדוק.
   זהירות: ודא אנשי לקחת שיעורים הדרכת בטיחות לייזר מתאים ללבוש משקפי בטיחות לייזר לפני טיפול בציוד לייזר.
7. חברו את כבל סיב אופטי תיקון סיבים למקור אור הלייזר דרך מחבר FC / PC וליישר את fטיפ iber אל המוקד של המצמד. מדוד את עוצמת השידור לאור הסיבים עם מד כוח על מנת להבטיח את תפוקת אור נאותה.
   הערה: השלבים הבאים הם להכנת ferrules קרמיקה עם סיבים אופטיים להשתלה כרונית לתוך המוח; ferrules קרמיקה חלול במרכז ולבצע סיבים אופטיים כדי לספק אור מכבל תיקון לאזור של (ROI) הריבית בתוך המוח.
8. שימוש קופיץ סיבים, לסיים את הסיב האופטי לייצר קצה שטוח בנקודת הסיום. אם הסיב כבר מצופה עם ז'קט, לערטל את הז'קט עם כלי הפשטה-סיבים מראש.
9. קליב את הקצה השני של הסיבים האופטיים כדי לייצר את האורך הרצוי להשתלה לתוך המוח. לקבוע את אורך הסיב באמצעות אטלס stereotaxic למקד את ההחזר על ההשקעה בתוך המוח.
   1. לדוגמא: למקד ההיפוקמפוס הגבה חולדה הנמצאת במרחק 3.5 מ"מ מתחת גבחת, להבטיח כי אורכו של הסיבים מבצבץ ferrule הוא 3.5 מ"מ + 0.25 מ"מ, והיוו עובי הגולגולת המאפשר מרווח הטעות. לכן, בדוק כי האורך הסופי של הסיבים הוא 3.5 מ"מ + 0.25 מ"מ + 10.5 מ"מ (אורך של טבעת חזוק) = 14.25 מ"מ.
10. מערבב כמות קטנה של דבק אפוקסי ב יחס של 1: 1 על פיסת נייר אלומיניום זמן קצר לפני השלב הבא (דבק אפוקסי הופך צמיג מדי דקות שימוש 5 לאחר הערבוב).
11. בעזרת מקל עץ קטן, בעדינות להחיל דבק אפוקסי חלק הסיבים שיונחו בתוך הצד הקעור של טבעת חזוק הקרמיקה ולאחר מכן להחיל טיפה קטנה על פני השטח של הצד השטוח של הטבעת חזוק. לאחר הכנסתו טבעת חזוק, להבטיח כי אורך קטן של סיבים (<0.5 מ"מ) שבולט מן הצד השטוח של טבעת חזוק הקרמיקה. אפשר דבק אפוקסי להקשיח O / N עבור תוצאות אופטימליות.
12. להבריק את קצהו השטוח של טבעת חזוק באמצעות דיסק ליטוש באמצעות פינצטה כדי להפעיל לחץ כלפי מטה עדין על טבעת חזוק תוך סיבוב דמות -8ים על גיליונות לחיכה תחמוצת אלומיניום (מ 3 מיקרומטר עד 1 מיקרומטר 0.3 חצץ מיקרומטר).
13. לבחון את הקצה השטוח של טבעת חזוק עם מיקרוסקופ בהגדלה 100X. ודא שהמשטח של הקצה השטוח, כולל משטח סיבים האופטי עצמו, ללא שום דבק אפוקסי; להמשיך ליטוש אם דבק אפוקסי נשאר על פני השטח. ודא שמשטח סיבים אופטיים לא שבור או סדוק.
14. זוג טבעת חזוק מלוטשים כבל אופטי תיקון סיבים עם שרוול טבעת חזוק וחבר את כבל התיקון מקור אור לייזר. מדוד את עוצמת שידור האור בקצה הסיב עם מד כוח על מנת להבטיח יעילות נאותה.
15. שמור יומן של תפוקת החשמל הנדרש מן של טבעת חזוק כבל תיקון לכל שתל טבעת חזוק פלט את רמת הכוח הרצוי בקצה של סיבים אופטיים (2.5 mW בפרוטוקול זה). בטל ferrules עם שיעור הנחתה של למעלה מ -50% ועם דפוס פלט שאינו מעגלי.

2. Stereotaxic Impכירורגיה וירוס lantation הזרקה

1. ודא כי כל הפרוצדורות הכרוכות בשימוש בבעלי חיים מאושרים על ידי IACUC המקומי. לשמור על תנאים מזוהמים במהלך ניתוחי הישרדות ידי ביצוע הליכים ספטית, לרבות באמצעות כפפות סטריליות, מסכות סטרילי, וילאות כירורגי סטרילי מכשירי ניתוח עיקור.
   זהירות: ודא כי מנתחים לובשים ציוד מגן אישי נכון (PPE) כוללים משקפי בטיחות לפני תחילת ההליך. בצע את ההליכים בטיחות ביולוגית תקן כשעובדים עם וקטור adeno הקשורים (AAV), מקפיד להימנע מתיז. מפנים את הפסולת AAV במיכל Biohazard.
2. טען מזרק microliter עם מספיק AAV להזרקה לתוך החיה בתוספת נוספת לתת דין וחשבון על הפסדים בהיקף פוטנציאלי (סה"כ 4 μl לכל חיה), שמירה על המזרק על קרח לפני השימוש. בפרוטוקול זה, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP בכל כייל של 4x10 ¹² VG / ml משמש. מניחים את החיה תחת isofluranהרדמה דואר עם בתא אינדוקציה, המחוברים סט מאדה isoflurane דיוק ב 3 - 4% עם מקור גז חמצן.
3. לגלח את הראש עם סכין גילוח חשמלי ולבצע לקרצף כירורגית משולשת על העור באמצעות בבטאדין שטיפת אתנול 70%.
4. לאחר שהחיה היא בהרדמה עמוקה (לבדוק רפלקס בוהן קצב נשימה), לשתק את הגולגולת של החיה במנגנון stereotaxic עם חתיכי מיצוב תוך ולשוניים בר שן.
   הערה: התהליך כולו ייקח 1 - 2 שעות, מן אינדוקציה הרדמה להחלמה.
5. הגדר את ההרדמה ברמה מתאימה (1 - 3% isoflurane על מאדה) ולהמשיך לפקח על סימנים חיוניים של החיה, התאמת הרדמה ככל שיידרש כדי לשמור על קצב הנשימה של ~ 40 נשימות / דקה. נהל משחת עיניים על העיניים של החיה כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
6. ערכו 15 - חתך בקרקפת קו האמצע 20 מ"מ עם אזמל לחזור בו הקרקפת בעזרת hemostats ניתוח מכניסttached אל קרום העצם. למבדה ו גבחת הפניה כדי למקם את המקדח על הקואורדינטות של ROI.
7. לקדוח craniotomy קטן (2 - 3 מ"מ) על ההחזר על ההשקעה עם מקדח שיניים, נזהר שלא לנקב את המוח. לאט להכניס מחט מחוברת אל מזרק microliter דרך craniotomy אל ROI במוח.
8. עם בקר משאבת microsyringe, להזריק 2 μl של פתרון וקטור אל ROI. השתמש קצב הזרימה של 150 nl / min כדי למנוע נזק לרקמות. לאחר הזריקה תושלם, לחכות 10 דקות לפני הסרת המזרק לאט, בקצב של 0.5 מ"מ / דקה.
9. בעקבות הזריקה, לייבש את פני השטח של הגולגולת. למבדה ו גבחת הפניה לאשר קואורדינטות ולאחר מכן הכנס את שתל טבעת חזוק לעומק היעד (למשל: 3.5 מ"מ מתחת גבחת עבור ההיפוקמפוס הגבה) בשיעור של כ 0.5 מ"מ / דקה. הר שתל טבעת חזוק לגולגולת באמצעות מלט שיניים. אחרי המלט שיניים יש הקרושה, לאטום את החתך עם תפרים (סיze 5-0 לחולדות) סביב פקק מלט השיניים.
10. לאחר הניתוח, והמקום חיה בכלוב שלה שוכנו בנפרד עם חצי הכלוב על גבי תנור להתאוששות הרדמה. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. אל תניח את החיה בחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין.
11. לניהול לאחר ניתוח של כאב, לנהל עצירות תת עורי כל 12 שעות במינון של 0.05 מ"ג / ק"ג למשך 24 שעות. נהל אבקה אנטיביוטית יומי על אתר החתך במשך 3 ימים.
12. הסר את התפרים כשבועיים לאחר הניתוח, כדי למנוע scabbing.
13. מתן 4 - 6 שבועות לאחר הזרקת הווירוס לביטוי מספיק גני optogenetic לפני ביצוע ניסויים.

3. MRI פונקציונלי optogenetic

זהירות: נהג במשנה זהירות סביב שדה מגנטי קבוע של סורק MRI. מכשירים וציוד מאובטחיםאף אוזן גרון, כולל מחולל אותות, מקור אור, הנשמה, capnograph ובלוני גז, מספיק רחוק (לפחות מעבר לגבול 5 גאוס).

1. מניחים את החיה תחת הרדמה גז עם בתא אינדוקציה, המחוברים סט מאדה isoflurane דיוק ב 5% עם מקור גז חמצן.
2. לאחר שהחיה היא בהרדמה עמוקה (רפלקס בדיקת הבוהן קצב הנשימה), לצנרר החיה על פי פרוטוקול המפורטים Rivard et al. (2006) על מנת לאפשר ניטור הפחמן הדו-חמצני על ידי capnography ^26. הערה: אינטובציה הוא קריטי בשמירה על רמות נאות של נשיפת CO ₂ במהלך הדמיה.
3. Secure חיה בעריסת הסורק.
   הערה: בפרוטוקול זה, הערש הופק מנהג אבל עריסות כאלה הן גם זמינות מסחריים. תפקידי ערש חולדה כדי לאבטח את החיה בתוך הסורק למסירה של הרדמה, אוויר מחומם בשל הגבלת תנועה.
4. לספק תערובת של isoflurane (ranginז מתוך 1.2 - 1.5%) בכ -60% תחמוצת חנקן וחמצן 40% דרך צינורות דרך העריסה. ודא כי ראשו של בעל החיים הוא מקובע היטב על מנת למנוע הצעת artifacts.
5. לספק אוויר סוער דרך צינורות בעריסה וכנס מדחום רקטלי עם סיכה כדי לפקח על טמפרטורת גוף. נהל משחת עיניים על העיניים של החיה כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
6. חברו את כבל סיב אופטי תיקון סיבים מקור אור לייזר למדידת תפוקת בקצה חוד של כבל התיקון עם מד הכוח.
7. התאם לרמת המתח המתאים (נקבע בעבר בשלב 1.15) כדי לייצר את הפלט הרצוי (2.5 mW בפרוטוקול זה) בקצה של סיבים אופטיים מושתל בתוך המוח. מאז תפוקת החשמל מוגזמת מן סיבים אופטיים עלולה לגרום נזק לרקמות בתוך המוח או לגרום לחימום רקמות שיפיק חפצים האות, לא להגדיל באופן משמעותי את תפוקת החשמל של הלייזרמעבר פלט המיועד.
8. למנוע זליגת אור מן השתל עם חרוט של הקלטת חשמל שחורה עוטף את העיניים של החיה. זוג כבל סיב אופטי אל השתל טבעת חזוק על החיה עם שרוול טבעת חזוק.
9. מניח את הסליל על הראש של החיה. הכנס את העריסה עם בעל חיים לתוך הנישא של הסורק.
   הערה: בפרוטוקול זה, הסינגל לולאת השידור-קבלת הסליל הופק מותאם אישית מכוון מראש כדי לקבל את תדר הרדיו האופטימלי מרקמות המוח.
10. צג קצב הנשימה ואת טמפרטורת הגוף לאורך כל התהליך הזה, התאמת ההנשמה ותנור חימום מלאכותי ככל שיידרש כדי לשמור על ערכים פיזיולוגיים בתוך גבולות (להבטיח הנשיפה כי CO ₂ הוא 3 - 4% על ידי החלפה של ידיות במכונת ההנשמה להתאים תדירות שבץ ונפח וכי הטמפרטורה היא 37 מעלות צלזיוס על ידי לחיצה על החצים עבור הגדרת הטמפרטורה).
11. בחר רצף מיצוב לדמות את מיקום ראש החיה. אם בגשם הוא לא בבית-מרכז iso, להתאים את מיקום ראש החיה וחזור על סריקת המיצוב עד שהמוח הוא בבית-מרכז ISO. בחר רצף shimming ליניארי ולחץ עומס בחלון בחירת רצף. לאחר מכן, לחץ על התחל כדי להפחית inhomogeneities של השדה המגנטי.
    הערה: shimming הוא שלב קריטי שישפיע על השלמות ישירות של נתוני ה- fMRI.
12. בחר רצף T2-weighted ולחץ עומס בחלון בחירת רצף. לאחר מכן, לחץ להתחיל לרכוש תמונות אנטומיים עטרת T2 המשוקלל ברזולוציה גבוהה לפני fMRI כדי לבדוק את שלמות הכוללת של המוח כדי לאשר את מיקום שתל הסיב האופטי.
    הערה: תמונות אלה יכולים לשמש כשכבות האנטומיה של סדרת סריקת ofMRI.
13. חבר כבלי BNC מיציאת המפעילה של סורק ה- MRI כדי הגנרטור הפונקציה כך שמקור אור הליזר הוא מונע על פי פרדיגמה גירוי ניסיון.
    הערה: בפרוטוקול זה, גירוי paradigm הוא 30 שניות של בסיס ואחריו 20 שניות על / 40 שניות לסירוגין במשך שש דקות.
14. בחר שיפוע רב פרוס נזכר הד (GRE) רצף ולחץ עומס בחלון בחירת רצף. לאחר מכן, לחץ על התחל כדי לרכוש 35 מ"מ x 35 מ"מ (2D FOV) ב-מטוס פרוס העטרה עם 0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ רזולוציה מרחבית.
    הערה: רצף GRE משמש כאן יש זמן החזרה (TR) וזמן הד (TE) של TR / TE = 750/12 msec זווית להעיף 30 °.
15. בסיום הסריקה, ולהסיר את החיה מהסורק לפקח עד שהוא התעורר מההרדמה והוא יכול לשמור שכיבה sternal.

4. ניתוח נתונים ofMRI

הערה: השלבים הבאים מבוצעים MATLAB כמתואר בפרסום על תפוקה גבוהה ofMRI ^27.

1. לאחר נתוני הסריקה הגולמיים הועברו למחשב בשימוש לניתוח, להשתמש זזת שחזור חלון כדי לעדכן את התמונה בכל TR, עםצג שציין ספירלה ארבע interleave, 750 TR msec ו -12 msec הד הזמן לרכוש 23 פרוסות לכל סדרת הסריקה. במקום שחזור הקונבנציונלי שבו תמונות fMRI חדשות משוחזרות רק לאחר שכל interleaves נרכש עבור כל פרוסה, שיטת שחזור החלון הזזה משחזרת תמונות לאחר הרכישה של כל interleaf ^27.
2. לעבד את הנתונים הגולמיים לשיקום gridding דו ממדים, תיקון תנועה, וחישוב הזמן, כפי שתואר קודם לכן ^27.
3. השתמש בשיטת קוהרנטיות סף לקבוע ווקסלים מופעלים על ידי חישוב אפנון האחוזים של אות BOLD של כל יחסי voxel לתקופת הבסיס שנאספה לפני גירוי כפי שתואר לעיל ^27. חישוב ערכים קוהרנטיות כמו הגודל של ההתמרה בתדר של מחזורי גירוי חזרו מחולקים הסכום-של-הריבועים של כל רכיבי התדר ^8.
4. בהתבסס על הנתונים של סדרות עתיות לכל נכפי שניתן לראות בטבלה, תמונות תנועת תיקן ממוצעות ששייכים סריקות רצופות של הפרדיגמה הגירוי הזהה ראשונה. ואז ליישר את תמונות 4D הממוצעות למסגרת לתאם משותפת עם התואר-של-חופש שישה טרנספורמציה גוף קשיח בתוספת דרוגה איזוטרופיים להשוואה בתוך ובין חיות כפי שתואר לעיל ^27.

Results

איור 1 ואיור 2 מראים מידע נציג הנובע 20 הרץ (15 רוחב הפולס msec, 473 ננומטר, 30% מחזור עבודה) גירוי optogenetic של הקורטקס המוטורי. הפרדיגמה גירוי של 30 שניות של בסיס ואחריו 20 שניות על / 40 שניות לסירוגין במשך שש דקות היו בשימוש. מחקרים קודמים הראו כי הפרדיגמה הזו מייצרת אות BOLD חזקה מ ^1,8 גירוי optogenetic. איור 1 מציג מופעל ווקסלים זוהה הוא באתר המקומי של גירוי (הקורטקס מוטורי) ו בתלמוס, כתוצאה של קשרים סינפטיים ארוך הטווח בין האזורים אלה. איור 2 מראה כי מידע זמני ניתן ללמוד מן HRFs, כתגובה התלמוס מתעכבת (מדרון ראשוני נמוך יותר) לעומת תגובת הקורטקס המוטורי לאחר גירוי optogenetic.

p_upload / 53,346 / 53346fig1.jpg "/>
איור 1. הפעלת מפת BOLD האיתותים מושרות על ידי optogenetic גירוי של CaMKIIa להביע תאים ב Motor Cortex. ערכים קוהרנטיות של ווקסלים פעיל, המזוהה אלה מסונכרנים באופן משמעותי על גירויים חוזרים ונשנים, מוצג מעולפת על פרוסת אנטומיים העטרה משוקללת T2. נתונים שנאספו במשך שש דקות, 30 שניות תקופה (בסיס 30 שניות ראשוניות ושישה גירוי מחזורי של 20 שניות על / 40 שניות מנוחה עם 473 אור ננומטר, 20 הרץ, 15 רוחב הפולס msec) מרוכזים לתוך מפת הפעלה חד. פרוסות סדרתית פסוקות 0.5 מ"מ ואת המיקום של שתל הסיב האופטי הוא כונה על ידי משולש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

Motion של הנושא במהלך ההדמיה מהווה מקור משמעותי של חפץ שניתן להוביל לפגם בנתונים. כראוי אבטחת החיה על ערש ההדמיה יכולה למזער חפצים כגון יהיה שמירה על רמות הרדמה מתאימות. הנה, השתמשנו isoflurane אבל הרדמה חלופית, כגון medetomidine או קטמין ו xylazine, צריך להיות גם נחשב. עם זאת, הרמות והבחירה של הרדמה יכולות להשפיע פרמטרים רבים במוח, כולל תגובת BOLD ^28. Isoflurane יכול לגרום לשינויים רגישים עצבי ^29. הרדמה אחרת גם יכולה להשפיע עיכוב סינפטי GABA ^30. לכן, הבחירה של הרדמה חשובה בעת ביצוע ofMRI נתון ויכולתה להשפיע על פעילות עצבית. ofMRI בהעדר ההרדמה אפשרי אבל יכול להיות מאתגר עם תנועה מוגברת מן החי, אשר יכול להיות מופחת אם החיה היא מורגל; כגון מחקרי ofMRI ערים בוצעו בעברnd ימנע את ההשפעה של בלבול הרדמה על המוח ^9,10. תיקון תנועת אלגוריתמים לאחר עיבוד יכולים לשמש כדי למתן את ההשפעות של תנועה מאוד. כמה שיטות אלה קיימים, כולל אלגוריתם גאוס-ניוטון ההופכי המועסקים פרוטוקול זה, אשר ממזער את סכום ריבועי עלות פונקציה של תמונת ייחוס ותמונה תחת תיקון. האלגוריתם הוא שימושי משום שהוא מאפשר תיקון תנועה מהיר חזק, באמצעות עיצוב פלטפורמה במקביל GPU כדי לקצר את זמן עיבוד ^27.

לשיקום נתונים בפרוטוקול זה, תוכנות שנכתבו מותאם אישית בסביבת MATLAB שמשו שחזור gridding דו ממדים, שבו דגימות ספירלה משוחזרות ב k-שטח לדימויי gridded ^31-33. נתוני סדרות עתיות נוצרו על ידי חישוב אפנון האחוזים של אות BOLD של כל יחסי voxel לתקופת הבסיס שנאספה לפני גירוי. ווקסלים שסדרת זמן היו synchronized לבלוקים של גירוי optogenetic עם ערך קוהרנטיות של 0.35 ומעלה הוגדרו ווקסלים מופעלים; ערך קוהרנטיות זו מקבילה לערך P פחות מ -10 ^{-9 8.} ערכי קוהרנטיות חושבו את הגודל התמר בתדר של מחזורי גירוי חזרו מחולקים הסכום-של-הריבועים של כל רכיבי התדר ^8,27. שגיאת Familywise ניתן לשלוט באמצעות תיקון Bonferroni להשוואות מרובות. ניתן להשתמש בשיטות של ניתוח אלטרנטיבי, כולל בדיקות סטטיסטיות פרמטרית כגון מודלים ליניאריים כללי (GLMs). שיטת קוהרנטיות דורשת פחות ידע מוקדם של HRF בהשוואת לדגם ליניארי כללי הקונבנציונלי. לכן, זה יתרון כאשר בוחנים נתונים באמצעות ofMRI. עם זאת, שיטת קוהרנטיות ניתן להשתמש רק עבור נתונים עם עיצובים לחסום או את עיצובים הקשור לאירוע עם קבוע interstimulus מרווח אין להשתמש בנתוני ofMRI עם אירוע-רלה אחרטד עיצובים או עיצובים מעורבים. בהמשך לכך, דוגמנות סיבתי דינמית (DCM) ניתן להשתמש כדי לנתח אינטראקציות בין איזורים במוח שזוהו באמצעות ofMRI. DCM היא טכניקה סטטיסטית בייס פתחה לניתוח של קישוריות תפקודית מתגובות מערכת לתשומות ניסיוניות במהלך fMRI ^34.

בעיות טכניות נוספות ofMRI נדונות כאן. עלולים להיפגע שתלים או לנפול, מה שמוביל את הסרת החיה המושפעת מן המחקר. Re-השתלת ניתוחים אינם מומלצים בשל אי ודאות הנוספת של מיקוד אותו ROI כמו ניתוח ההשתלה המקורי ובשל נושאי רווחת בעלי חיים. בגלל הכמות של זמן ומשאבים רבים מושקעים בכל מקצוע בעלי חיים, השיקול של כוחו של החומר הוא דאגה משמעותית בבחירת דבק דנטלי מתאים לשימוש במחקרים ofMRI. ניתוח ההשתלה מהווה גורם קריטי למקסם את תוחלת החיים של implant ובכפוף חיה. לדוגמא, על מנת להבטיח כי הגולגולת היא יבשה לפני החלת מלט השיניים והצבת כמות מספקת של מלט סביב שתל טבעת חזוק הקרמיקה יכולה להבטיח יציבות לאורך ציר זמן החודשים ארוכי הפוטנציאל של החיה במהלך תקופת המחקר. בנוסף, עיצובי כלוב חלופיים יכולים להיחקר ודן עם מתקן הטיפול בבעלי החיים המקומי כדי למנוע כלובים עם צמרות חוט החזקת המזון ומים, כי לעתים קרובות לבלוט לתוך הכלוב ולספק הזדמנויות החיה לפגוע השתל. חשוב לציין, מלט השיניים חייב להיות שנבחר בקפידה על מנת להפחית לכלוכים המשפיעים הדמיה ומלט חלופי יכולים להיבדק על ידי יישום על רוח רפאים והדמיה בתוך סורק לפני השימוש בניסויים בבעלי חיים. ניסוי וטעייה עם מכתיר שיניים שונים הראו כי הבטון להשתמש בפרוטוקול זה נותן חפצים מעטים יחסית. אתגר טכני נוסף בביצוע ofMRI הוא הדיוק של מיקום סיבים אופטיים על ROI המיועד, בהתחשב extrמרחקים קטנים emely שיכול להתקיים בין גרעינים במוח ^35. לאחר השלים ניתוחי ההשתלה, סריקות אנטומיים משוקללים T2 יכולות לשמש כדי לקבוע מיקום נכון על ידי שכיסה על אטלס מוח. המיומנות של המנתח ותרגול ביצוע ניתוחים אלה יכול לשפר את שיעורי מיקום נכונים. סגולי והביטוי של opsin בבית ROI המיועד ניתן לאמת בסיומו של המחקר על ידי מרוססת החיה ותיקון במוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה או הקרינה אנדוגני של חלבון כתב מתויג אל opsin לשם ויזואליזציה. חלבוני כתב אלה ניתן colocalized גם עם חלבונים אחרים על מנת להבטיח כי opsin מתבטא סוגי התאים העצביים הרצויים ^1,8,15,25. כאמור, חפצים שיכולים להתעורר בעת ביצוע ofMRI עקב חימום רקמת משלוח אור ^22. חימום הרקמות גורם שינוי של פעמי הרפיה, וכתוצאה מכך אות BOLD שווא. כדי להבטיח כי activation הנובע גירוי אור במהלך ofMRI אינו בשל חפץ זה, בקרות opsin השלילית צריכות להתבצע בו גם חיות מוזרקות מלוחות או חיות הזריקו וקטורי fluorophore המלא (כגון AAV-CaMKIIa-EYFP) עוברות ofMRI. בנוסף, בנויים היטב רק שתלי סיבים אופטיים עם יעילות העברת אור טובה צריכים לשמש כדי להסיר את הצורך להשתמש בכוחות ליזר גבוהים. מחקרי ofMRI בוצעו הפעלה אשר שווא עקב חימום רקמות לא הייתה בעיה ^1,6-8,10,11.

לגבי הבחירה של וקטור להציג את גני optogenetic הנדרשים לתוך הנוירונים לביטוי, AAVs אינם ידוע לגרום למחלה בבני אדם ולכן הם אופציה נוחה, בהינתן רמת הבטיחות הביולוגית הנמוכה נדרשה להשתמש בתכשירים אלו (BSL-1). בנוסף, מספר רב של ליבות וקטור לשאת AAVs ארוז עם גני optogenetic שונים במלאי ועם קפסיד מרובה. סרוטיפ של AAV חייב להיבחר בased על יעד אוכלוסיית תאים שנועד להבטיח רמות ביטוי אופטימליות ^36,37. Lentiviruses יכול לשמש גם, אך דורש רמת בטיחות ביולוגית גבוהה. פרק הזמן הנדרש עבור ביטוי מספיק של גני optogenetic הוא משתנה בהתאם לדגם חיה המסוים, על AAV מסוים בשימוש על הפרדיגמה הניסוי הספציפי. בפרוטוקול זה, חולדות ספראג Dawley ב -11 שבועות משמשות ומחקרי optogenetic להתחיל ארבעה עד שישה שבועות לאחר הזרקת וירוס. עכברים טרנסגניים יכולים לשמש גם במחקרים optogenetic. יש צורך לבצע ניסויים ניסיוניים לקביעת הסכום המסוים של הזמן הנדרש עבור ביטוי מספיק של opsins. פרדיגמות גירוי יכולות להשתנות בהתאם opsin הספציפי בשימוש. בפרוטוקול זה, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP משמש ואת הפרדיגמה גירוי הוא 20 שניות על / 40 שניות מנוחה. אם אתה משתמש SSFO, הפרדיגמה הגירוי תשתנה בגלל SSFO דורש דופק אור קצר רק כדי להיות activated ואז דופק אור קצר באורך גל אחר יופסק.

דאגה קריטית נוספת בעת ביצוע ofMRI מונע זליגת אור מממשק שתל טבעת חזוק עם הכבל אופטי תיקון סיבים במהלך גירוי optogenetic למנוע אות מוח מבלבלת שמקורם גירוי חזותי, גם כאשר החיה היא מורדם. קונוסים של הקלטת חשמל שחור יכול לשמש כדי לחסום את האור מן ferrules וכדי לכסות את העיניים של החיה. חשוב לציין, ערכים פיסיולוגיים כוללים טמפרטורת CO ₂ וגוף נשיפה של הנושא חייבים להיות מתוחזק כראוי לאורך כל תקופת ההדמיה. CO ₂ הנשיפה צריך להישמר בין 3 - 4% ואת טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס. בנוסף, רצפי shimming להפחית הומגניות ככל האפשר בשדה המגנטי לפני תחילת ofMRI סורק מאוד קובע את איכות נתוני BOLD שהתקבלו. פיקוח על גורמים אלההוא קריטי בהפקת נתוני ofMRI אמינים. בפרוטוקול זה, לייזרים DPSS משמשים כמקור האור לגירוי optogenetic. בגלל אור הלייזר הוא עקבי, יותר כוח מספיק יכול להיות מסופק בקלות דרך סיבים אופטיים. מקורות אור LED מצמידים סיבים אופטיים זמינים מיצרנים מסחריים, אבל יש את החסרון של כוח ירדה של העברת אור. מקור אור לייזר דורש יישור כל כבל אופטי תיקון סיבים מסוים, אך עם תרגול, יישור שניתן להשיג זאת במהלך שניות עד דקות.

יישומים עתידיים של ofMRI כוללים שימוש opsins הדור הבא כגון opsins האדום העביר לאפשר גירוי פולשני במהלך הדמיה. בנוסף, השתלת MRI התואם EEG או אלקטרודות להקלטה דומה יחד עם שתל הסיבים האופטי עלולה לאפשר לרכישת נתונים ברזולוציה גבוהה זמניים בנוסף נתונים ברזולוציה מרחבית הגבוהים של MRI. ofMRI עם electrophysiolהקלטת ogical יכולה לספק מידע נרחב על הקישוריות התפקודית של המוח. לסיכום, את הכוח של ofMRI לפקח על כל המוח בתגובה לגירוי של אוכלוסיות תאים ספציפיים שהוגדרו על ידי זהות גנטית או אנטומי עושה ofMRI כלי קריטי להשתמש בחקר מחלות נוירולוגיות של connectomics של מוח בריא.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7 סורק טסלה	Agilent Technologies	Discovery MR901 System
Sprague Dawley חולדות	צ'ארלס ריבר	Crl: SD	11 שבועות
קליבר סיבים	Fujikura	CT-05
סיבים אופטיים מולטי-מוד	Thor Labs	AFS105/125Y
מסיר סיבים	Thor Labs	T08S13
שרוול מפוצל קרמי	מוצרי סיבים מדויקים	SM-CS1140S
	Thor Labs	G14250
	Stoelting Co.	50975
טבעות זירקוניה קרמיות מולטימוד מוצרי	סיבים מדויקים	MM-FER2002
FC / PC מחבר מולטימוד	Thor Labs	30128C3
דיסק ליטוש סיבים אופטיים	מוצרי סיבים מדויקים	M1-80754
גיליון חיפוי תחמוצת אלומיניום, 0.3 ומיקרו; m	Thor Labs	LFG03P
גיליון חיפוי תחמוצת אלומיניום, 1 ומיקרו; m	Thor Labs	LFG1P
גיליון חיפוי תחמוצת אלומיניום, 3 ומיקרו; m	Thor Labs	LFG3P
מיקרוסקופ ביולוגי דו-עיני 40X-1,000X	Amscope	B100
משקפי בטיחות לייזר	Kentek	KXL-62W01
473 ננומטר DPSS לייזר	זוהר	LRS-0473
594 ננומטר DPSS לייזר	זוהר	LRS-0594
סט			מפתח משושה אלן2.0 מ"מ (5/64 אינץ') ליישור קצה הסיבים לנקודת המוקד של המצמד במד כוח הלייזר
, חיישן Si, 400-1,100 ננומטר	Thor Labs	PM121D
איזופלורן (איזותזיה)	הנרי שיין	איזופלורן 50033
עם תא אינדוקציה	VetEquip	901806
NanoFil 100 ומיקרו; l מזרק	World Precision Instruments	NANOFIL-100
UltraMicroPump עם בקר SYS-Micro4	Precision Instruments	UMP3-1
	A.M.P.I.	מאסטר-8
סטריאוטקס בעלי חיים קטנים	דיוויד קופף מכשירים	דגם 940
דגם 683 מאוורר לבעלי חיים קטנים	מכשירי הרווארד	550000
סוג 340 קפנוגרף	הרווארד מכשירים	733809
מקדחה דנטלית (ערכת מיקרו-מנוע סיבובית)	Foredom Electric Co.	K.1070
משחת עיניים (דמעות מלאכותיות)	רוגבי	00536-6550-91
סטריליזטור מכשירים	CellPoint Scientific	Germinator 500	מעקר חרוזי זכוכית
אבקת אנטיביוטיקה	פייזר	NEO-PREDEF	ניאומיצין סולפט, איזופלופרדון אצטט וטטרקאין הידרוכלוריד
בופרנורפין משכך כאבים	Hospira	NDC:0409-2012	חומר מבוקר לוח III, מלאי 0.3 מ"ג/מ"ל