מאמר שיטה

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

DOI:

10.3791/53374

⸱

16 בנובמבר 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala Biomedical Center, Uppsala University, 2Department of Surgical Sciences, Otolaryngology and Head & Neck Surgery, Akademiska sjukhuset

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שקדים פלטינים הם מקור עשיר ללימפוציטים B ו-T. כאן אנו מספקים פרוטוקול קל, יעיל ומהיר לבידוד לימפוציטים B ו-T מהשקדים הפלאטיניים האנושיים. השיטה המתוארת הותאמה במיוחד למחקרים על האטיולוגיה הנגיפית של דלקת שקדים המכונה דלקת שקדים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שקדים מהווים חלק ממערכת החיסון ומספקים את קו ההגנה הראשון מפני פתוגנים הנשאפים. בדרך כלל המונח "שקדים" מתייחס לשקדים הפלאטיניים הממוקמים בדפנות הצדדיות של החלק האוראלי של הלוע. שקדים פלאטיניים שהוסרו בניתוח מספקים מקור נגיש ונוח של לימפוציטים B ו-T לחקר יחסי הגומלין בין פתוגנים זרים למערכת החיסון המארח. פרוטוקול וידאו זה מתאר את החיתוך והעיבוד של שקדים פלטינים אנושיים שהוסרו בניתוח, ולאחר מכן בידוד של אוכלוסיות תאי B ו-T בודדים מאותה דגימת רקמה. אנו מציגים שיטה, המפרידה ביעילות בין לימפוציטים B ו-T של שקדים באמצעות פרוטוקול זיקה תלוי נוגדנים. יתר על כן, אנו משתמשים בשיטה כדי להדגים כי אדנו-וירוס אנושי מדביק במיוחד את מקטע תאי ה-T של השקדים. הפרוטוקול שנקבע ישים בדרך כלל לבידוד יעיל ומהיר של אוכלוסיות תאי שקדים B ו-T כדי לחקור את תפקידם של סוגים שונים של פתוגנים בתגובות חיסוניות של שקדים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שקדים הם אוספים של רקמות לימפה עטופות באופן לא מלא השוכנות מתחת לאפיתל במערכת העיכול העליונה ובמגע איתו. בדרך כלל המונח "שקדים" מתייחס לשקדים הפלאטיניים הממוקמים בדפנות הצדדיות של החלק האוראלי של הלוע. השקדים הפלאטיניים הזוגיים יחד עם השקד האף-לוע (אדנואיד), שקדי הצינורות הזוגיים והשקדים הלשוניים מהווים את מה שמכונה "טבעת ולדייר". האחרון אחראי למגע הראשוני בין פתוגנים שנשאפו או נבלעו לבין רקמות הלימפה של מערכת העיכולהאווירית 1,2. ואכן, דיווחים רבים הראו כי ניתן לזהות אנטיגנים חיידקיים וויראליים בדגימות רקמת שקדים2-6.

השקדים הפלאטיניים מורכבים מרקמת לימפה צפופה המכוסה באפיתל קשקשי מרובד שאינו קרטיניזציה. לשקדים יש קריפטות רבות, פלישות אפיתל, החודרות לפרנכימה ומגדילות את שטח הפנים. מבחינה היסטולוגית, השקדים הפלאטיניים מכילים זקיקי לימפה רבים עם מרכזי נבט, שהם האתרים להתבגרות והתמיינות של תאי B (אזורי תאי B). כמו כן, השקדים הפלאטיניים מקיפים תאי T, הנמצאים בעיקר באזורים החוץ-זקיקים (אזורי תאי T). בנוסף לתאי B ו-T, ניתן לזהות גם תאים דנדריטיים זקיקים שונים בשקדים הפלאטיניים1,2.

בשל מיקומם האנטומי, השקדים הפלאטיניים נגישים בקלות על ידי התערבויות כירורגיות. לדוגמה, הסרה כירורגית של שקדים, המכונה כריתת שקדים, מתבצעת באופן שגרתי ברחבי העולם7. בילדים עם היפרפלזיה של שקדים, לעיתים משתמשים בהסרה כירורגית חלקית של השקדים (כריתת שקדים), הגורמת פחות כאב לאחר הניתוח למטופלים. בהתחשב בהצטברות של פתוגנים שונים בשקדים, שקדים שהוסרו בניתוח מספקים הזדמנות ייחודית לחקור את ההשפעה של גורמים נגיפיים וחיידקיים על תפקודי לימפוציטים של שקדים2,8. יתר על כן, ניתן לחקור אם פתוגנים מסוימים מעדיפים להתגורר בתת-אוכלוסיות תאים ספציפיות9. בנוסף, מכיוון שהשקדים הם מקור עשיר ללימפוציטים מסוג B, ניתן להשתמש ביעילות בלימפוציטים B מבודדים של שקדים כדי לחקור את הפעילות של תת-אוכלוסיות שונות של תאי B10. עם זאת, מכיוון שהשקדים הפלאטיניים מכילים תערובת של סוגי תאים, יש צורך בשיטה יעילה להפרדת תת-אוכלוסיות התאים השונות.

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לבידוד יעיל ומהיר של אוכלוסיות תאי שקדים B ו-T מהשקדים האנושיים על ידי שימוש בטכניקת הפרדת תאים מופעלת מגנטית (איור 1). השיטה המתוארת כאן שימושית למדענים שרוצים להעריך את תפקידם של גורמים זיהומיים שונים באיברי לימפה אנושיים כמו שקדים פלאטיניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר את הבידוד של תאי הלימפה מחומר מטופל אנושי ולכן דורש אישור אתי. נעשתה במחקר הנוכחי העבודה ניתנה על ידי המועצה לביקורת האתית אופסלה (DNR. 2013/387).

1. בידוד של תאי mononuclear (MNCs) משקדי הפלטין אדם

זהירות: כל חומר unscreened ממקור אנושי כמו דם, רקמות או נוזלי גוף צריכה להיחשב כחומר שעלול להיות נגוע. לכן, צריכים להיות אחרי נהלי בטיחות ביולוגית מומלצים לטיפול ברקמות האנושיות.

הערה: כדי למנוע זיהום, כל הפתרונות וציוד תרבית תאים חייבים להיות סטרילי. כל המאגרים והפתרונות צריכים להיות מראש מקוררים ושמרו על קרח. רקמות שקדים ותאים מבודדים צריכים להישמר וטיפלו על קרח.

  1. השג שקדים טריים מחולים שעברו כריתת שקדים או tonsillotomy (איור 2). לצלול clum הרקמהנ.ב. לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר מלא פתרון קר כקרח סטרילי הנקס המאוזן מלח (HBSS) בתוספת 5% בסרום שור עוברי (FBS), 10 מ"מ גלוטמין, 0.05 מ"ג / מיליליטר גנטמיצין ו -1% תערובת אנטיביוטיקת antimycotic (פניצילין, סטרפטומיצין וAmphotericin B).
  2. שמור את הצינורות עם דגימות רקמת שקדים שקועות בכל העת על קרח. נסה לעבד את השקדים בהקדם האפשרי, ולא יאוחר מאשר 3 שעות לאחר הסרה כירורגית.
  3. מניחים את השקדים בצלחת תרבית תאי פלסטיק 60 מ"מ על קרח ולשמור על הרקמה טבולה בHBSS. הסר קרישי דם גלויים, שומן ורקמות חיבור עם מלקחיים נקיים ממשטח השקדים.
  4. השתמש בצלחת תרבית תאים חדשה 60 מ"מ המכילה 5 מיליליטר HBSS. חותך את גוש רקמת שקדים לתוך 3-10 ברי מ"מ בעזרת זוג מספריים סטרילי ו / או אזמל.
  5. הכן צלחת תרבית תאים חדשה 60 מ"מ המכילה 10 מיליליטר של HBSS ולמקם 100 מיקרומטר מסננת תא פלסטיק בפתרון HBSS.
  6. העבר את dissשברי שקדים השתקפו למסננת התא עם מלקחיים סטריליות. שימוש בסוף הבוכנה של מזרק פלסטיק, בצורה חלקה לסחוט את שברי רקמות דרך מסננת התא. ודא שברי השקדים שקועים לחלוטין בHBSS.
  7. מחק את מסננת התא עם שרידי הרקמה ולהעביר את ההשעיה תא וכתוצאה מצלחת תרבית תאי 60 מ"מ לתוך צינור צנטריפוגות פלסטיק 50 מיליליטר. השאר את הצינור על קרח בזמן שתמשיך בצעדים 1.8 ו -1.9.
  8. במקרה של שקדים גדולים, גדול מ- 2 סנטימטר בגודלם (איור 2), שברי השקדים לסחוט בשתי מסננות תא כדי למנוע סתימה של הרשת במסננת.
  9. השג את הנפח הסופי של 35 מיליליטר של ההשעיה התא.
    הערה: בשלב זה ניתן להכין את ההשעיה התא להקפאה (ראה סעיף 2).
  10. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות כגון Ficoll לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש. בעדינות שכבת suspens התאיון (שלב 1.9) על גבי פתרון שיפוע צפיפות. הימנע ערבוב של ההשעיה התא ופתרון שיפוע צפיפות.
    הערה: פתרון שיפוע הצפיפות יש חימם עד RT.
  11. צנטריפוגה ההשעיה התא בהרוטור את נדנדה ב 700 XG במשך 20 דקות ב RT. לא להפעיל את פונקצית הבלם בצנטריפוגות כמו בלימה מהירה עלולים לשבש את השיפוע. כמו כן, להשתמש בפונקצית התאוצה הנמוכה ביותר זמינה בצנטריפוגה.
    הערה: לאחר שלב זה צנטריפוגה, להתבונן MNCs כשכבת רכה לבנה בממשק, ותאי דם אדומים (RBCs), fibroblasts ופסולת תא כמשקעים בתחתית של התחתית.
  12. לאסוף בזהירות את שכבת MNCs באמצעות pipet 10 מיליליטר. מניחים את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש.
  13. להוסיף 25 מיליליטר של PBS קר כקרח להשעית התא ולסובב את הצינור ב XG 300 במשך 5 דקות בהרוטור את נדנדה על 4 מעלות צלזיוס.
  14. הסר את supernatant באמצעות pipet 25 מיליליטרוחזור על שלב כביסה תא גלולה פעמים נוספות. לבסוף resuspend התא גלולה ב 15 מיליליטר של PBS.
    הערה: לאחר שלב הכביסה האחרון, אפשר cryopreserve ההשעיה התא (ראה סעיף 2).
  15. החל 10 μl של השעיה תא לתא ספירת תאי hemocytometer ולספור את מספר התאים תחת מיקרוסקופ. לוותר את הכמות המתאימה של תאים (לדוגמא, 2-3 x 10 7) בצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות להפרדת חרוז מגנטי שלאחר מכן. שמור aliquot זה על קרח עד שלב 3.2.

2. Cryopreservation של תאי שקדים

  1. להכין מדיום הקפאה (FBS 90% ו -10% DMSO) ולשמור אותו על קרח. לאחסון לטווח ארוך לשמור על תקשורת ההקפאה ב -20 ° C.
  2. לקבוע את המספר הכולל של תאים באמצעות תא ספירת תאי hemocytometer (שלב 1.15). לחשב את הכמות הנדרשת של מדיום הקפאה בהתאם לצפיפות התאים קפואים הרצוי (למשל, 10 7 תאs / מיליליטר של מדיום הקפאה).
  3. צנטריפוגה ההשעיה התא XG ב 300 במשך 5 דקות. למזוג supernatant מבלי להפריע גלולה התא וresuspend התא גלולה במדיום הקפאה קר כקרח (משלב 2.1).
  4. לוותר על 1 מיליליטר aliquots של ההשעיה התא לתוך צלוחיות סטריליים המיועדות לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי. להקפיא את הבקבוקונים בתא isopropanol ולאחסן אותם ב -80 CO ° / N. לשימור לטווח ארוך להעביר את הבקבוקונים לחנקן נוזלי המכיל מיכל אחסון או מקפיא תא C ° -140.
  5. להפשיר צלוחיות עם תאים קפואים, לחמם אותם במהירות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מייד כשהפשיר, לפזר את ההשעיה התא לתוך 10 מיליליטר של HBSS המחומם מראש (עם תוספים, שלב 1.1) בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. לסובב את הצינור ב XG 300 במשך 5 דקות, להסיר את HBSS וresuspend התא גלולה בצפיפות תאים הרצויה בHBSS (עם תוספים, שלב 1.1).
    הערה: הכדאיות של AF MNCsהפשרת ter היא בעל חשיבות, שכן הנוכחות של תאים מתים תקטין את התשואה הסופית של B מטוהר ולימפוציטים מסוג T.
    הערה: על פי הניסיון שלנו כדאיות תא פחות 80% יפחית את יעילות בידוד תא.

3. חיובי בחירה של T לימפוציטים אוכלוסייה מMNCs השקדים

הערה 1: פרוטוקול זה מבוסס על סלקציה חיובית של לימפוציטים CD3 + T האנושי מMNCs שקדים באמצעות חרוזים מגנטיים מצמידים את נוגדן CD3. אפשר להתחיל מסעיף זה טרי (סעיף 1) או (2 סעיף) MNCs הקפוא.

הערה 2: התחל עם 3 x 10 7 MNCs. לא יעלה על מספר תא זה, מאז עמודות ההפרדה עלולות לסתום וזה יפחית את יעילות הבידוד. השתמש בעמודות גדולות יותר אם יותר תאים יטופלו. כרכי שימוש בפרוטוקול זה כבר מותאם באופן ניסיוני למספר תאינואד בהגדרת הניסוי שלנו.

  1. הכן את חיץ ההפרדה [PBS (pH 7.2), 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 2 מ"מ EDTA]. סנן את חיץ ההפרדה דרך פילטר 0.45 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. ספין ההשעיה MNCs (שלב 1.14) ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. Resuspend גלולה וכתוצאה מכך התאים ב240 μl (80 μl לכל 10 7 תאים) של חיץ הפרדה קר כקרח. מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור 2 מיליליטר סטרילי.
  3. הוסף 20 μl של נוגדן מגנטי CD3 לפתרון התא. דגירה הצינורות עבור שעה 1 ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציף כדי לשמור על תאים בתרחיף.
  4. להעביר את כל ההשעיה התא לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר חיץ הפרדה קר כקרח כדי לשטוף את התאים.
  5. צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בהרוטור את נדנדה.
  6. בינתיים הקים את המפריד ועמודה המגנטיים. צרף את המפריד המגנטי לדוכן ומניח את הטור בseparator. לשטוף את העמודה על ידי החלת 500 μl של חיץ הפרדה קר כקרח. מחק את הזרימה דרך.
  7. מניחים צינור איסוף חדש 15 מיליליטר מתחת לעמודה. שמור את צינור האיסוף על קרח.
  8. בטל supernatant (שלב 3.5) על ידי pipet ועדינות resuspend התא גלולה ב500 חיץ הפרדת μl. החל ההשעיה התא על גבי הטור מראש שטף ולתת לו לרוץ דרך.
    הערה: גושים סלולריים עלולים להדביק את הטור ובכך להקטין את קצב הזרימה. כדי למנוע בעיה זו, להציב מסננת תא פלסטיק 40 מיקרומטר בראש הטור. עובר תאים דרך רשת זה יהיה מאוד לשפר את היעילות של שיטה זו.
  9. לשטוף את העמודה 4 פעמים עם 1.5 מיליליטר של חיץ הפרדה (500 μl 10 7 תאים). חכה למאגר הטור להיות ריק (לא נוזלי יש לשים לב בעמודה) לפני יישום שלב הכביסה הבא.
    הערה: השג את התאים ללא תווית CD3, נחשבים כחלק B לימפוציטים, כפי שהםeluted לתוך צינור האיסוף.
  10. הסר את העמודה מהמפריד והמקום לתוך צינור איסוף 15 מיליליטר חדש. פיפטה 2 מיליליטר של חיץ הפרדה על הטור. באמצעות הבוכנה מסופקת עם הטור elute לימפוציטים מסוג T חיובי שנבחר, אשר נחשבים לחלק הלימפוציטים T.
  11. לקבוע את מספר התאים מטוהרים (שלב 1.15) במידת צורך. השעיות תא מוכנות לניסויים במורד הזרם עכשיו.

4. ניתוח תזרים Cytometry של מבודד השקדים B ו- T לימפוציטים

זהירות: פתרון Paraformaldehyde הוא גירוי ומסרטן חשוד. ללבוש בגדים מתאימים מגן, כפפות, ועיניים / פנים הגנה.

הערה 1: פרוטוקול זה מתאר שיטה לצביעה ישירה של B המבודד ותאי T-ידי תא קרינה המופעל מיון ניתוח (FACS). המטרה העיקרית של שלב זה היא להעריך את טוהר של התא המבודד אוכלוסיות AFter CD3 הפרדת נוגדן מגנטי. לB זה המטרה הוקם וסמני תא T, נוגדנים חד שבטיים fluorophore מצומדות CD20-FITC וCD2-APC, משמשים. גם ההכללה של נוגדני שליטת אלוטיפ מומלץ מאוד להבחין "הרקע" שאינו ספציפי מחייב של נוגדני CD2 וCD20 (ראה שלב 4.8).

הערה 2: אפשר לשמור על שברי תאים המטוהרים בparaformaldehyde 1% פתרון (PFA) בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד למועד מכתים (למשל, למחרת.). גם באותו ההליך ישים אם קיים פער זמן בין הצביעה וניתוח FACS. זכור כי בשני המקרים יש לשטוף תאים כראוי עם PBSA (PBS המכיל 0.2% BSA) חיץ, לפני מכתים או ניתוח FACS.

  1. קח את 6 x 10 6 תאים של MNCs מצעד 1.15 (לפני החלת לעמודה), חלק ב 'הלימפוציטים מצעד 3.9 וחלק הלימפוציטים T מצעד 3.10.
  2. ספין התאהשעיות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס באמצעות הרוטור את נדנדה.
  3. הסר את supernatant עם pipet ולשטוף את התא גלולה פעם אחת עם 1 מיליליטר של PBSA קר כקרח. ספין השעיות תא XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant עם pipet וresuspend תאים ב600 μl של חיץ PBSA קר כקרח.
  4. להוסיף את ההשעיה תא 100 μl לתחתית צינור FACS.
  5. להוסיף של PBS המכיל סרום אנושי מומת 10% חום לכל צינור 100 μl, מערבב היטב ודגירה ~ 1 דקות ב RT או 20 דקות על קרח.
    הערה: לימפוציטים מסוג B נושא קולטנים Fc. כדי לחסום קולטני Fc השברים התא המטוהרים מודגרת עם סרום אנושי מומת 10% חום. הסרום האנושי הוא חום מומת על ידי דגירה על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. מחלקים את סרום החום מומת לaliquots הקטן וחנות קפוא ב -20 ° C.
  6. צנטריפוגה ההשעיה התא XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס בSWing-את הרוטור.
  7. הסר את supernatant עם pipet ולשטוף את התא גלולה עם 1 מיליליטר PBSA. חזור על צנטריפוגה (300 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס).
  8. הוספת 100 PBSA μl לתוך צינור אחד על קרח. מוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים חד שבטיים fluorophore מצומדות, על פי המלצת היצרן (לדוגמא, 20 μl של אנטי-CD20 ו / או 5 μl של נוגדנים-CD2 אנטי בPBSA של 100 μl). הערה: אל תשכח להקצות מספיק צינורות שליטה לניתוח FACS. בפרוטוקול זה יש לכלול את הפקדים הבאים: 1) תאים מוכתמים בנוגדנים נגד CD2 ואנטי-CD20 בנפרד, 2 תאים) מוכתמים הנוגדנים נגד CD2 ואנטי-CD20 שליטת אלוטיפ בנפרד ו, 3) תאים ללא תוספת של נוגדנים.
  9. בקצרה מערבולת צינור דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
  10. לשטוף 2 פעמים עם PBSA. הוסף 2 מיליליטר של 1% פתרון PFA לדגימות. בואו התאים להישאר בפתרון PFA ב 476; C בחושך עד שהזמן של ניתוח FACS.
  11. מייד לפני הפעלת הדגימות במכונה FACS, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBSA (300 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס). דגימות Resuspend ב 1 מיליליטר של PBS ולשמור על 4 מעלות צלזיוס (או על קרח), מוגנות מפני אור, לפני ההפרדה על cytometer את הזרימה.
  12. האם מיון FACS הבא הפרוטוקול מcytometer זרימת היצרן.

5. PCR איתור של Adenovirus DNA במבודד השקדים B ו- T לימפוציטים

הערה 1: פריימרים גן hexon אדנווירוס הם AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') וAdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. פריימרים אלו ליצור amplicon של 139 נ"ב. גן 18S rRNA המארח יכול להיות מזוהה עם tp206 פריימרים (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') וtp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3 "). גודל amplicon הצפוי הוא 300 נ"ב.

הערה 2: בכל PCRטווח כולל שליטה שלילית (H 2 O מזוקק) ושליטה חיובית DNA המתקבלת מקו B תא האנושי (BJAB) נגועה בסוג אדנווירוס האנושי 5 12.

  1. תמצית ה- DNA (מלפחות x 1 10 6 תאים, צעד 3.11) בשיטת טיהור טור מבוססת קרום סיליקה. לחלץ RNA באמצעות פנול וisothiocyanate guanidine פתרון 13.
  2. הוספת 100 DNA ng מ- B ולימפוציטים מסוג T לתערובת תגובה המכילה מאגר 1x HF, 0.2 מ"מ של תערובת אדנוזין deoxynucleotide (dNTP), 0.25 מיקרומטר של כל צבע יסוד ו1 U של האיכות הגבוהה DNA פולימרז בהיקף כולל של 20 μl.
  3. בצע הגברה PCR בתנאי הרכיבה על אופניים הבאים: 30 שניות בdenaturation 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 30 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 67 ° C (hexon) או 58 ° C (18S rRNA) למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. תגובת PCR הסתיימה בצעד ארכה סופי של 7 דק 'ב 72 מעלות צלזיוס.
  4. הפרד את מחזקי PCR וכתוצאה מכךמוצרי ication על 1.5% agarose ג'ל ב1x TBE חיץ ולדמיין להקות הצפויות על ידי צביעה עם כתם חומצות גרעין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרדה יעילה של תוצאות MNCs שקדים בתת אוכלוסיות נקיות במיוחד של לימפוציטים B ו- T. זה אושר על ידי ניתוח FACS באמצעות אנטי CD20 ואנטי-CD2 נוגדנים לזהות B והלימפוציטים T אוכלוסיות, בהתאמה (איור 3 א). לעומת זאת, הפרדה יעילה של תוצאות MNCs שבברי תאים שהם תערובת של תאים משני תת-אוכלוסיות B ו- T לימפוציטים (איור 3).

השקדים B המבודד ולימפוציטים מסוג T (איור 3 א) הם באיכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על התוצאה של פרוטוקול זה הוא השימוש בחומר שקדים טרי כחומר מוצא. לכן, צריכים להיות מעובד דגימות השקדים בתוך 3 שעות לאחר ניתוח. ניתן להשיג שקדים משני מבוגרים וילדים. חומר השקדים מהילדים הוא בדרך כלל קטן יותר עקב הסרה כירורגית החלקית של השקדים (tonsillotomy). לכן, מספר MNCs מתקבל מדגימות tonsillotomy (1 x 10 x 10 7 -1 8) הוא פחות בהשוואה לדגימות כריתת שקדים (1 x 10 x 10 8 -2 9). עם זאת, תהליך בידוד התא יהי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה השוודית לסרטן (11 0253, 13 0469), מועצת המחקר השוודית (K2012-99X-21959-01-3), קרן מרקוס בורגסטרום ומועצת המחקר השוודית באמצעות מענק למרכז המחקר של רנ"א אופסלה (2006-5038-36531-16). אנו אסירי תודה למתקן הליבה של BioVis באוניברסיטת אופסלה על העזרה הרבה בניתוח ה-FAKS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) Gibco14175-053מכיל 5% סרום בקר עוברי (FBS), 10 מ"מ גלוטמין,    0.05 מ"ג/מ"ל ג'נטמיצין ו-1% תערובת אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית
מדיום90% FBS ו-10% DMSO
MACS בופרPBS (pH 7.2), 0.5% BSA ו-2mM EDTA
PBSA PBS מכיל 0.2% BSA
PFAPBS המכיל 1% פרפורמלדהיד (PFA). הכינו טרי. PFA חשוד כמסרטן. ללבוש כפפות ומשקפי מגן.
תערובת אנטיביוטית-אנטי-פטרייתGibco15240-062
60 מ"מ PetridishNunc150326
Dissecting forecepsFisher Scientific1381241
מספריים ישר קשתית פישר סיינטיפיק12912055
אזמלים חד פעמייםSwann-MortonREF 0501
100 μ מסננת תאי פלסטיקm Corning Life Sciences352360
40 μ מסנני תאי פלסטיק M Corning Life Sciences352340
מזרק פלסטיק 2 מ"לBD Biosciences 
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"לSARSTEDT62554502
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"לSARSTEDT62547254
צנטריפוגה במהירות נמוכה עם רוטור בזווית קבועה או דלי מתנדנדThermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll– HypaqueSigma-AldrichF5415-50MLתמיסת Ficoll
סרום עגל עובריתעשיות ביולוגיות040071A
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)SIGMAD2650-5X5ML
MACS MS עמודות Miltenyi Biotec130-042-201
MACS אנושי CD3 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-092-881
מפריד MACS (Octo MACS)Miltenyi Biotec130-042-109
אלבומין סרום בקר (BSA)Merck Millipore1120180100
EDTAAnalaR NORMAPUR20302.293
CD2 מצומד לאלופיקוציאנין ( CD2-APC) BD ביוסיינס 
560642 CD20 מצומד לפלואורסצאין איזותיוציאנט (CD20-FITC) BD ביוסיינס 
סרום אנושי Rockland ImmunochemicalsD119-0100
Phusion High Fidelity DNA PolymeraseThermo ScientificF-530L
FACS צינורותBD Falcon352003
CryotubeSARSTEDT72379
BD LSRII flowcytometerBD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 תוכנהBD Biosciences 
נוקלאוספין דם Macherey-Nagel740951.50ערכת בידוד DNA
TRIzol  מגיבטכנולוגיות חיים15596מגיב בידוד RNA
המוציטומטרPaul Marienfeld GmbH & Co. KGמכשירמונה תאים
0610030 GelRedBiotium41003צבע ג'ל חומצת גרעין 
הקפאה 300185556632

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BTDNAT CD3B CD20

מאמרים קשורים