שקדים פלטינים הם מקור עשיר ללימפוציטים B ו-T. כאן אנו מספקים פרוטוקול קל, יעיל ומהיר לבידוד לימפוציטים B ו-T מהשקדים הפלאטיניים האנושיים. השיטה המתוארת הותאמה במיוחד למחקרים על האטיולוגיה הנגיפית של דלקת שקדים המכונה דלקת שקדים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם
במאמר זה
סיכום
תקציר
שקדים מהווים חלק ממערכת החיסון ומספקים את קו ההגנה הראשון מפני פתוגנים הנשאפים. בדרך כלל המונח "שקדים" מתייחס לשקדים הפלאטיניים הממוקמים בדפנות הצדדיות של החלק האוראלי של הלוע. שקדים פלאטיניים שהוסרו בניתוח מספקים מקור נגיש ונוח של לימפוציטים B ו-T לחקר יחסי הגומלין בין פתוגנים זרים למערכת החיסון המארח. פרוטוקול וידאו זה מתאר את החיתוך והעיבוד של שקדים פלטינים אנושיים שהוסרו בניתוח, ולאחר מכן בידוד של אוכלוסיות תאי B ו-T בודדים מאותה דגימת רקמה. אנו מציגים שיטה, המפרידה ביעילות בין לימפוציטים B ו-T של שקדים באמצעות פרוטוקול זיקה תלוי נוגדנים. יתר על כן, אנו משתמשים בשיטה כדי להדגים כי אדנו-וירוס אנושי מדביק במיוחד את מקטע תאי ה-T של השקדים. הפרוטוקול שנקבע ישים בדרך כלל לבידוד יעיל ומהיר של אוכלוסיות תאי שקדים B ו-T כדי לחקור את תפקידם של סוגים שונים של פתוגנים בתגובות חיסוניות של שקדים.
מבוא
שקדים הם אוספים של רקמות לימפה עטופות באופן לא מלא השוכנות מתחת לאפיתל במערכת העיכול העליונה ובמגע איתו. בדרך כלל המונח "שקדים" מתייחס לשקדים הפלאטיניים הממוקמים בדפנות הצדדיות של החלק האוראלי של הלוע. השקדים הפלאטיניים הזוגיים יחד עם השקד האף-לוע (אדנואיד), שקדי הצינורות הזוגיים והשקדים הלשוניים מהווים את מה שמכונה "טבעת ולדייר". האחרון אחראי למגע הראשוני בין פתוגנים שנשאפו או נבלעו לבין רקמות הלימפה של מערכת העיכולהאווירית 1,2. ואכן, דיווחים רבים הראו כי ניתן לזהות אנטיגנים חיידקיים וויראליים בדגימות רקמת שקדים2-6.
השקדים הפלאטיניים מורכבים מרקמת לימפה צפופה המכוסה באפיתל קשקשי מרובד שאינו קרטיניזציה. לשקדים יש קריפט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול מתאר את הבידוד של תאי הלימפה מחומר מטופל אנושי ולכן דורש אישור אתי. נעשתה במחקר הנוכחי העבודה ניתנה על ידי המועצה לביקורת האתית אופסלה (DNR. 2013/387).
1. בידוד של תאי mononuclear (MNCs) משקדי הפלטין אדם
זהירות: כל חומר unscreened ממקור אנושי כמו דם, רקמות או נוזלי גוף צריכה להיחשב כחומר שעלול להיות נגוע. לכן, צריכים להיות אחרי נהלי בטיחות ביולוגית מומלצים לטיפול ברקמות האנושיות.
הערה: כדי למנוע זיהום, כל הפתרונות וצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרדה יעילה של תוצאות MNCs שקדים בתת אוכלוסיות נקיות במיוחד של לימפוציטים B ו- T. זה אושר על ידי ניתוח FACS באמצעות אנטי CD20 ואנטי-CD2 נוגדנים לזהות B והלימפוציטים T אוכלוסיות, בהתאמה (איור 3 א). לעומת זאת, הפרדה יעילה של תוצאות MNCs שבברי תאים שהם תערובת של תאים משני תת-אוכלוסיות B ו- T לימפוציטים (איור 3).
השקדים B המבודד ולימפוציטים מסוג T (איור 3 א) הם באיכו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על התוצאה של פרוטוקול זה הוא השימוש בחומר שקדים טרי כחומר מוצא. לכן, צריכים להיות מעובד דגימות השקדים בתוך 3 שעות לאחר ניתוח. ניתן להשיג שקדים משני מבוגרים וילדים. חומר השקדים מהילדים הוא בדרך כלל קטן יותר עקב הסרה כירורגית החלקית של השקדים (tonsillotomy). לכן, מספר MNCs מתקבל מדגימות tonsillotomy (1 x 10 x 10 7 -1 8) הוא פחות בהשוואה לדגימות כריתת שקדים (1 x 10 x 10 8 -2 9). עם זאת, תהליך בידוד התא יהי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה השוודית לסרטן (11 0253, 13 0469), מועצת המחקר השוודית (K2012-99X-21959-01-3), קרן מרקוס בורגסטרום ומועצת המחקר השוודית באמצעות מענק למרכז המחקר של רנ"א אופסלה (2006-5038-36531-16). אנו אסירי תודה למתקן הליבה של BioVis באוניברסיטת אופסלה על העזרה הרבה בניתוח ה-FAKS.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) | Gibco | 14175-053 | מכיל 5% סרום בקר עוברי (FBS), 10 מ"מ גלוטמין, 0.05 מ"ג/מ"ל ג'נטמיצין ו-1% תערובת אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית |
| מדיום | 90% FBS ו-10% DMSO | ||
| MACS בופר | PBS (pH 7.2), 0.5% BSA ו-2mM EDTA | ||
| PBSA | PBS מכיל 0.2% BSA | ||
| PFA | PBS המכיל 1% פרפורמלדהיד (PFA). הכינו טרי. PFA חשוד כמסרטן. ללבוש כפפות ומשקפי מגן. | ||
| תערובת אנטיביוטית-אנטי-פטריית | Gibco | 15240-062 | |
| 60 מ"מ Petridish | Nunc | 150326 | |
| Dissecting foreceps | Fisher Scientific | 1381241 | |
| מספריים ישר קשתית | פישר סיינטיפיק | 12912055 | |
| אזמלים חד פעמיים | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μ מסננת תאי פלסטיק | m Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μ מסנני תאי פלסטיק M | Corning Life Sciences | 352340 | |
| מזרק פלסטיק 2 מ"ל | BD Biosciences | ||
| צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"ל | SARSTEDT | 62554502 | |
| צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל | SARSTEDT | 62547254 | |
| צנטריפוגה במהירות נמוכה עם רוטור בזווית קבועה או דלי מתנדנד | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll– Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | תמיסת Ficoll |
| סרום עגל עוברי | תעשיות ביולוגיות | 040071A | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS עמודות | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS אנושי CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| מפריד MACS (Octo MACS) | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| אלבומין סרום בקר (BSA) | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| CD2 מצומד לאלופיקוציאנין ( CD2-APC) | BD ביוסיינס | ||
| 560642 CD20 מצומד לפלואורסצאין איזותיוציאנט (CD20-FITC) | BD ביוסיינס | ||
| סרום אנושי | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS צינורות | BD Falcon | 352003 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII flowcytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 תוכנה | BD Biosciences | ||
| נוקלאוספין דם | Macherey-Nagel | 740951.50 | ערכת בידוד DNA |
| TRIzol מגיב | טכנולוגיות חיים | 15596 | מגיב בידוד RNA |
| המוציטומטר | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | מכשיר | מונה תאים |
| 0610030 GelRed | Biotium | 41003 | צבע ג'ל חומצת גרעין |
מקורות
- Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
- Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
