כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח תסיסנית melanogaster שימוש ב Flywalk פרדיגמה

Summary

Flywalk מערכת מעקב האוטומטי משמש לכימות ברזולוציה גבוהה של מודרך ריח התנהגות בmelanogaster תסיסנית.

Abstract

בסביבתם הטבעית, חרקים כגון החומץ לטוס תסיסנית melanogaster מופגזים עם כמות עצומה של odorants כימי השונה. כדי לסבך את העניינים עוד יותר, הריחות זוהו על ידי מערכת העצבים החרקים הם בדרך כלל לא תרכובות בודדות אלא תערובות הרכב יחסי ריכוז ו משתנים. זה מוביל לסכום כמעט אינסופי של גירויי ריח שונים שצריכים להיות מוערכים על ידי מערכת העצבים.

כדי להבין שהיבטים של גירוי ריח לקבוע את הערכתה על ידי הזבוב, זה לכן רצוי לבחון מודרך ריח התנהגות כלפי ניחוחי רב ותערובות ריח ביעילות. ישירות לתאם התנהגות לפעילות עצבית, התנהגות צריכה לכמת במסגרת זמן דומה ובתנאים זהים לגירוי בניסויי neurophysiological. עם זאת, bioassays חוש הריח המשמש כיום רב בneuroethology תסיסנית למדי specialized גם כלפי יעילות או לרזולוציה.

Flywalk, מערכת מסירת הריח ומעקב אוטומטית, מגשרת על הפער בין היעילות ורזולוציה. היא מאפשרת הקביעה מתי בדיוק מנות ריח מגורה זבוב הולך בחופשיות, וכדי לקבוע את animal's תגובה התנהגותית דינמית.

Introduction

מטרת העל של כל מחקר neuroethological היא להקים קשר סיבתי בין מדינות הפעילות של תאי עצב בודדים או מעגלים עצביים וההתנהגות של האורגניזם. כדי להשיג מטרה זו פעילות עצבית והתנהגות צריכה להיות במעקב בתנאי גירוי זהים ותנאי גירוי אלה אידיאלי צריכים להיות דומים לאלה של מערכת העצבים תחת בדיקה התפתחה הגיוני של. במיוחד כאשר מדובר בהתנהגות bioassays, הדרישות אלה הוכיחו די תובעניות מבחינה היסטורית בדרוזופילה melanogaster neuroethology חוש הריח.

ברגע ששוחרר מהמקור, נוצות ריח במהירות להתפרק לדקים חוטים עם דיפוזיה הסוערת שנגרמה על ידי תנועת אוויר להיות הקובע העיקרי של הפצת ריח ^1. כתוצאה מכך, חרקים ניווט לכיוון מקור ריח חווה גירוי לסירוגין עם חבילות ריח וביניהם מרווחים משתנה של אוויר נקי. שְׁנֵיהֶםהליכה וחרקים מעופפים - כולל תסיסנית - כבר הוכיח לנצל משטר גירוי לסירוגין זה לניווט על ידי גואה נגד הרוח על מפגש פלומה ובעיקר מרגש רוח צולבת בהעדר הריחות ^{2 - 5.} ואילו נהלי גירוי בניסויים פיסיולוגיים לחקות במידה רבה אלה חרקים עלולים להיתקל בסביבתו הטבעית או על ידי עננים בודדים מתן של ריחות וביניהם תקופות ממושכות של אוויר נקי או רצפי גירוי דינמיים ^6-11, רב bioassays התנהגות בשימוש בneuroethology תסיסנית כגון assay מלכודת , זירות שטח פתוח או T-מבוך להסתמך על ריח הדרגתיים ^{12 - 15.} עם זאת, בגלל ריח הדרגתיים על ידי הגדרה משתנות בריכוז בהתאם למרחק ממקור הריח, התנהגות מסוימת לא ניתן לייחס לריכוז ריח מדויק באמצעות פרדיגמות אלה. בנוסף, שיפועשיפוע ריח ביקורתי תלוי במאפייני physicochemical של odorant. שיפוע של מתחם תנודתיות גבוהה יהיה רדוד יותר שנוצר על ידי תרכובת פחות תנודתי ולכן גם קשה יותר לעקוב אחר לאורגניזם להסתמך על מדידת הבדלי ריכוז בחלל כאמצעי היחיד של ניווט ^{16 - 20,} דבר שעלול להוביל לפרשנות שגויה העדפות ריח במיוחד במבחני בחירה. השפעה זו היא גם מזיקה מאוד כאשר חוקר התנהגות כלפי תערובות ריח, כי זה מוביל ליחסי רכיב תערובת שונים בכל נקודה במרחב, ולכן שוב מונע מתאם ברור בין פיזיולוגיה והתנהגות.

בעוד זבובי חומץ נוטים לצבור על תסיסת פרי, הם בודדים בניווטם כלפי מקורות מזון ואתרי ההטלה. עם זאת, פרדיגמות התנהגות רבות ולא בודקים בעלי חיים בודדים המשמשות בneuroetholo תסיסניתGY לבחון את ההתנהגות מודרכת ריח של קבוצות של זבובים ומשיכה הוא הבקיע כחלק מזבובי בחירת הריח על גירוי שליטה. ניסויי עוקבה אלה תרמו רב להבנת neuroethology זבוב ורב של התצפיות שנעשו על ידי שימוש בהם יכול להיות מאושר בניסויים חד-זבוב. עם זאת, היא נצפתה שעפה יכולה להשפיע כל החלטת other's ²¹ ובמקרים קיצוניים ההערכה של ריח יכולה לעבור מאדישות להימנעות בהתאם לצפיפות אוכלוסיית ^22. בנוסף, תוצאות מסוג כזה של ניסויים אלה לעתים קרובות לספק רק את נקודת הסיום של רצף של החלטות התנהגותיות ולא התבוננות מה הזבוב עושה בזמן שהוא עושה את זה, שיהיו רצוי בעת הניסיון לתאם התנהגות עם פעילות עצבית. ניסויי עוקבה ברזולוציה נמוכה ולא אלה בניגוד ידי שיטות יחידה לטוס ברזולוציה גבוהה כגון זירות קשורות טיסה והליכונים המאפשריםלתצפית ישירה של תגובות התנהגותיות בזמן הגירוי מוצג ^20,23,24. עם זאת, ניסויי עוקבה עדיין פופולריים, כי הם יעילים מאוד ומספקים תוצאות חזקות גם בcomparably גודל מדגם נמוך בגלל שונות בין-אישיות ובין-משפט הן ממוצעים החוצה באופן חלקי בשל התצפית של אוכלוסיות על פני תקופות זמן ארוכות. בעוד טיסה והליכון קשורים כנראה לספק סטנדרטי הנוגעים להצגת גירוי והחלטה זמנית זהב, הזירות משמשות מיועדות לבעלי חיים יחידים ולכן מנת להשיג גודל מדגם דרוש לניתוח סטטיסטי זמן רב. לאחרונה כמה גישות אחרות פותחו המאפשרות רכישה יעילה של נתונים התנהגותיים ברזולוציה גבוהה בשילוב עם משטר גירוי מוגדר היטב. אלה כוללים 3D מעקב ללא השגחה של זבובי חומץ מרובים בwindtunnel בשילוב עם 3D מודל מדויק של פלומת ריח ⁵ , מעקב של זבובים בודדים מרובים בתאי בחירה מסופקים עם זרמי אוויר משני הצדדים ²⁵ ואת הפרדיגמה Flywalk ^26.

בFlywalk, 15 זבובים בודדים נמצאים בצינורות זכוכית קטנים ומנוטר באופן רציף על ידי מצלמה מעל תחת האורות אדומים תנאים. ריחות מתווספים קרון רציף של 20 סנטימטר / sec ולנסוע דרך צינורות הזכוכית במהירות קבועה. הקרון הוא humidified ידי העברתו דרך 250 בקבוקי מיליליטר המכילים מים מזוקקים (אדים) לפני הכניסה למערכת מסירת הריח. עמדות flies' נרשמות בתוך אזור כיכר של העניין (ROI) המקיף את רוב אורכו של צינורות הריח (אך לא כולל את הקצוות החיצוניים של הצינורות (כ 5 מ"מ בכל צד) שבו הזבובים אינם יכולים לנוע למעלה או נוסף בכיוון הרוח) בערך בזמן של מצגת ריח (איור 1 א ', ב'). זהויות לטוס נשמרות קבועות על ידי T מערכת המעקבhroughout הניסוי על בסיס Y-העמדות (כלומר שפופרת זכוכית הגבולות שלהם) שלהם. גירוי ריח מושגת באמצעות מכשיר גירוי רב-רכיב המאפשר ההצגה של עד 8 ​​ריחות אחת וכל תערובות האפשריות ^26,29 (איור 1). במהלך ניסוי מבוקר על ידי מחשב המסדיר את מערכת מסירת הריח ואיסוף טמפרטורה ולחות מידע (מחשב 1, איור 1 ג). מחשב זה שולט גם datalogger (להתחיל / הקלטה להפסיק) במחשב שני ברציפות שעוקב עמדות לטוס ב 20 מסגרות לשנייה (מחשב 2). טוס עמדות, מצב שסתום ריח (כלומר נקודת הזמן של פתיחת שסתום), מזהה ריח, טמפרטורה ולחות סביב מחזורי גירוי ריח מחוברים במחשב 2. בדרך זו מידע על ריח ולעוף עמדות מסונכרנות ומיוצאים כקובץ csv-קבצים ש יכול להיות מעובד יותר ונותח באמצעות ניתוח שגרה אישית בכתב. כיהמערכת כולה היא בשליטת מחשב, ללא התערבות אנושית יש צורך בהפעלה ניסיונית.

Protocol

פרטי הבנייה וטכני של Flywalk תוארו במקום אחר ²⁶ (במקרה של בעיות של ההקמה זו הוקמה, מידע נוסף ניתן לקבל מחה"כ). כאן נתמקד בהוראות מפורטות על הטיפול בפרדיגמה שתעזור להשיג תוצאות אמינות.

1. טיפול בזבוב

1. אחורי עף נמוך לתרבויות בינוניות צפיפות על מדיום מזון ²⁷ תחת 12 שעות: 12 שעות אור: משטר אפל ב23-25 ​​מעלות צלזיוס ו -70% לחות יחסית. לשם כך, לאפשר 20-30 מבוגרים יצאו זה עתה עף להתרבות בבקבוקון מזון גדול לשבוע 1, ואז להשליך זבובים בוגרים ולחכות לצאצאים לצוץ.
2. לאסוף 30-40 (גיל <24 שעות) זבובים בוגרים יצאו זה עתה והגיל בחדש בקבוקון המכיל בינוני אוכל ²⁷ למשך 3-5 ימים.
3. עשרים וארבע שעות לפני תחילת הניסוי התנהגותי: העבר את כל 30-40 שנאספו בעבר 3-5 D ישן (ראה 2.2) טס לvi חדשאל מכיל התוספת קצף גומי לחה או נייר טישו לח באמצעות aspirator.
   הערה: אל לטשטש זבובים באמצעות CO _2.

2. הכנת התקנת Flywalk

1. השתמש בבקבוקים 250 מיליליטר במכשירי אדים. מלא מכשירי אדים עם מים מזוקקים 100 מיליליטר.
2. הכן בקבוקוני ריח.
   1. הכן 500 μl 10 ^-3 דילולים של אצטט ריחות הטהורים אתיל, וטיראט אתיל, אצטט isopentyl ו2,3-butanedione בשמן מינרלי הממס.
   2. חבר את שני שסתומי בדיקת כדור לכל בקבוקון ריח. שים לב שסתום לבדוק לאפשר זרימת אוויר חד כיוונית בלבד. לכן, להתחבר סתומה לבדוק באופן כזה שהאוויר יכול להיכנס לבקבוקון בצד אחד ולהשאיר אותו בצד השני.
   3. הסר את המכסה של צינור תגובה 200 μl PCR. פיפטה של ​​כל דילול ריח 100 μl לתוך צינור תגובה נפרד ולמקם את הצינורות בבקבוקוני ריח נפרדים. כמו כן להכין בקבוקון ריח אחד המכיל רק את oi מינרלי הממסl.
   4. חוזקה לאטום את בקבוקוני ריח על ידי סגירתם באמצעות תקעי נירוסטה ואטמי גומי.
   5. חבר 5 בקבוקוני ריח (4 ריחות המכילים 1 ומכילים שמן מינרלים) למערכת אספקת הריח. הקפד לחבר אותם בכיוון הזרימה תקין. חיבור הלא נכון לא רק לסכן את הניסוי המתוכנן, אבל זה יכול גם לזהם את מערכת המסירה.
3. בדקו דליפות על ידי איטום היציאה של תא הערבוב של מכשיר הגירוי. ודא, כי כל זרמי האוויר לפני מכשיר הגירוי עכשיו בהדרגה לרדת לאפס. אם לא, לבדוק אם קיים דליפה שעכשיו ניתן לזהות על ידי הקול שריקה אוויר עוזב את המערכת.
4. להעביר בזהירות 15 זבובים בודדים עד 15 צינורות זכוכית בודדים באמצעות aspirator וצינורות זכוכית קרובים בשני הצדדים תוך שימוש במתאמים המתאימים.
   הערה: מאחר המערכת חייבת להיות הרמטית לניסויים מוצלחים, להבטיח שמתאמים שיתאימו צינורות זכוכית בחוזקהושים לב שצינורות זכוכית עלולים להישבר במהלך שלב זה. לטפל כדי למנוע פציעות על ידי לבישת כפפות ומשקפי מגן.
5. חבר את צינורות זכוכית להתקנת Flywalk ו, מכאן והלאה, לחכות לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי, כדי לאפשר זבובים להרגיל לסביבה החדשה.
6. לאחר שחבר את צינורות זכוכית: לבדוק את ההודעה של זרימת מטרים במורד הזרם הדיגיטלי במחשב 1 אם 16 הזרמים האוויר לאחר צינורות הזכוכית מסתכמים לזרימת האוויר שנכנסה למערכת. כמו כן, בדוק במחשב 1, אם לחות היא בין 60% ו -80%.
7. פרוטוקול גירוי עיצוב שליטה הרצף והתזמון של גירויי ריח הוצגו לזבובים. כדי להשיג למשל את הנתונים שתוארו, 4 ריחות בהווה ובשליטה (שמן מינרלים) ביחידים וכל המשולש האפשרי ותערובות quarternary של הריחות בו זמנית במשך 40 פעמים בכל. להגדיר משך דופק 500 אלפיות שניים בהפרש של 90 שניות interstimulus ואקראי רצף גירוי.
8. לעבור על liמקור להילחם (LED-אשכול; λ = 630). הקפד לספק מספיק אור למעקב יעיל מבלי להגדיל את הטמפרטורה בתוך צינורות הזכוכית.
9. הגדר את האזור של עניין של מערכת המעקב על ידי גרירת מסגרת על פני השטח כדי להיות במעקב באופן כזה שכל 15 צינורות הזכוכית כלולים וכ 5 מ"מ של קצות הצינורות אינם נכלל.
10. הגדר את 14 קווי הפרדה מקבילים בין צינורות הבודדים במערכת המעקב על ידי שינוי Y-עמדותיהם בתסריט המקביל לשמור בודד טס לזיהוי לאורך כל הניסוי. הקפד למקם אותם באופן כזה שתמיד יש שפופרת זכוכית אחד בין שני קווים מפרידים כזה, כי רק אחד זבוב יהיה במעקב בין כל סט של שתי שורות.
11. הקפד להגדיר פרמטרים מצלמה בצורה כזאת, כי הזבובים מעקב אמין לאורך צינורות הזכוכית. אם זבובים איבדו בשולי האזור של עניין, להגביר את הבהירות או רווח של מעקב שלoftware. הימנע תנודות מכאניות של מערכת המעקב. עקוב אחר שימוש בתוכנה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
12. התחל ניסוי על ידי הפעלת פרוטוקול הגירוי. שיא flies' XY-קואורדינטות ב 20 fps (פריימים לשניים) ולהיכנס בשילוב עם מצב שסתום ריח בקבצי טקסט.

ניתוח 3. נתונים

הערה: השלבים הבאים בניתוח הנתונים automatized באמצעות רוטינות אישית בכתב המתוכנת בר 'בגלל צעדים אלה הם קריטיים להשגת תוצאות משמעותיות הניתוח יהיה בכל זאת להיות מוצג באופן צעד-אחר-צעד. הנתונים הגולמיים לניתוח הם ה- csv-קבצים המכילים מידע על מצב מסונכרן שסתום ריח, מספר דופק בניסוי ו- X-15 עמדות לטוס בס"מ על ציר זמן משותף למחזור גירוי ריח אחד. קוד מותאם אישית לניתוח נתונים יכול להיות מסופק על פי דרישה.

1. ה- csv קובץ פתוח, למצוא נקודת זמן של פתיחת השסתום סמלה ידי צ'הnge בעמודה המייצגת את מעמד השסתום.
2. לחשב את הפונקציה ליניארית של עמדת ריח של הטופס
   F (t) = S T * + i
   כאשר t הוא זמן במחזור הגירוי, שלה מהירות הרוח (כאן 20 סנטימטרים / sec) וליירט אני יכול להיות מחושב באמצעות נקודת זמן הריח נכנס לצינורות בעמדה 0 (פתיחת שסתום בתוספת עיכוב).
3. מצא את הנקודה שבה ריח הזמן ולעוף x-עמדה מצטלבות לכל לטוס ולהגדיר נקודת זמן זו ל0. הערה: בדרך זו עמדות לטוס מיושרות לכל individual's נתקלת בריח.
4. תכלול זבובים יושבים בקצוות מאוד של האזור של עניין.
5. לחשב את המהירות מX-ידי חלוקת תפקידי עקירה לאורך ציר x על ידי מרווח הזמן (100 אלפיות השני) וההליך חוזר לכל מחזור גירוי.
6. כדי להשיג בזמן קורסי מהירות כפי שמוצג באיור 2E לחשב זמן כמובן מהירות ממוצעת לכל זבוב וריח ומאלו בזמן כמובן ממוצע לריח מסוים.
7. כדי להשיג עקירה נקי כפי שמוצג באיור 3 ג לחשב את העקירה הנקי בתוך 4 שניות לאחר דופק הריח לכל אירוע מעקב ולאחר מכן העקירה נטו הממוצעת לזבוב וריח.

4. ניקוי נוהל

1. זכוכית צינורות נקיים
   1. הסר זבובים ומתאמים מצינורות זכוכית ולספוג צינורות זכוכית בחומר ניקוי.
   2. יש לשטוף את צינורות זכוכית מתחת למים מזוקקים ריצה ולייבש אותם באמצעות אוויר דחוס.
   3. צינורות זכוכית חום ב 200 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות.
2. מערכת אספקת ריח נקי
   1. הסר את כל בקבוקוני הריח וצינורות מתא הערבוב המרכזי.
   2. הסר מתאמי צינורות מתא הערבוב.
   3. תא ערבוב נקי על ידי שטיפתו בתמיסת ניקוי מעבדה וממסים (למשל אתנול, אצטון). בצע את הפעולות הבאות מתחת למכסת מנוע המעבדה.
   4. תא ערבוב יבש באמצעות אוויר דחוס ולחמם אותו ב 200 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות.
3. נקי בקבוקי ריח ובדוק שסתומים
   1. הסר תקע פלדה (אטם גומי שנזרק) ושסתום לבדוק מבקבוקוני ריח ולספוג את כל המרכיבים בתמיסת ניקוי מעבדה.
   2. רכיבי Sonicate באמבט אולטרסאונד ולשטוף אותם במים מזוקקים.
   3. נקה את כל המרכיבים מלבד שסתומים לבדוק עם אתנול ואצטון. בצע את הפעולות הבאות מתחת למכסת מנוע המעבדה.
   4. רכיבים יבשים באמצעות אוויר דחוס ולחמם אותם ב 200 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות.
   5. שסתומי בדיקה נקיים מבפנים על ידי שטיפתם עם אתנול ואצטון באמצעות מזרק (לשקול כיוון זרימה). בצע את הפעולות הבאות מתחת למכסת מנוע המעבדה לובשת משקפי מעבדה. בגלל אצטון תוקף חלקי גומי, מייד סתום סימון יבש על ידי שטיפתם עם אוויר דחוס.
   6. הסר ריחות שייר ידי פועם אוויר דרך שסתומים לבדוק במשך כמה ימים. השתמש בחממה ב 60 ° C ואוויר 1 שניות באוויר שניות / 1 את המשטר לצעד זה ניקוי.

Results

בגלל זבובים מותר להפיץ באופן חופשי בתוך צינורות הזכוכית שלהם בין פולסים ריח ודופק הריח עובר דרך צינורות הזכוכית במהירות קבועה זבובים נתקלים הריח בזמנים שונים בהתאם לx-עמדתם בזמן הגירוי. כתוצאה מכך, onsets של המסלולים במעלה הרוח שעוררו דופק msec 500 של אטרקטיבי 10 ^-3 דילול של אתיל אצטט מעוכבים בכ -1 שניות לזבובים בסוף מורד הרוח של צינורות הזכוכית שלהם בהשוואה לאלו של זבובים יושבים קרוב יותר ל הסוף נגד הרוח במהירות רוח של 20 סנטימטר / sec ואורך 20 סנטימטרים צינור זכוכית <...

Discussion

למרות שמערכת Flywalk מופיעה ולא מתוחכמת במבט ראשון, להגדיר פעם אחת ולהפעלתו היא קלה לשימוש ומייצר תוצאות מאוד חזקות. להדגיש את העקביות של התוצאות הופקו במבדק זה ניתן לומר כי תוצאות הנציג המוצגות כאן התקבלו כמעט 2 שנים לאחר שהחלק מהתוצאות שמוצגים במחקר קודם ²⁹ עם התקנה שונה באמצעות תוכנת מעקב חדשה ומקור אור. עם זאת, תגובות attractant הן - למרות אמפליטודות תגובה מעט גבוהה יותר - דומה מאוד לאלה שפורסמו בעבר בעניין הדינמיקה שלהם.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
הגדרת Flywalk	מותאמים אישית		זמינים לפי בקשה
מכשיר גירוי	מותאמים אישית		זמינים לפי בקשה
אשכול LED	מותאמים אישית		זמינים לפי בקשה
HD Pro Webcam C920	Logitech, לוזאן, שוויץ
2 מחשבים
Flywalk תוכנת גרסה 1.0 שנטענה מחדש	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 תוכנה	National Instruments, אוסטין, טקסס
מזון זבוב סטנדרטי	מותאם אישית
בקבוקוני זבוב סטנדרטיים	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, גרמניה
בקבוקוני זבוב סטנדרטיים	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, גרמניה
שואב	מותאם אישית
שמן מינרלי	סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)
ריחות	סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)
200 ומיקרו; l צינורות תגובה PCR	Biozym Scientific GmbH, אולדנדורף, גרמניה