אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

סיכום

השכבה החיצונית של המוח הקטנה הגרגר היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למקד שינוי גנטי לשכבה זו בשיאו של שגשוג באמצעות vivo electroporation והתרבות של פרוסות המוח הקטן לשעבר מעובר חומוס עוברי יום 14.

תקציר

השכבה החיצונית של המוח הקטן גרגיר (EGL) היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח, ומודל מצוין לחקר התפשטות והבחנה עצביות. בנוסף, שינויים אבולוציוניים של יכולת שגשוגה היו אחראים להרחבה הדרמטית של גודל המוח הקטן באמניוטים, מה שהופך את המוח הקטן מודל מצוין ללימודי Evo-Devo של מוח החוליות. תאים המרכיבים את EGL, אבות גרגיר המוח הקטן, גם מייצגים תא משמעותי ממוצא למדולובלסטומה, גידול העצבי בילדים הנפוץ ביותר. בעקבות הגברה מעבר, מבשרי גרגיר להעביר רדיאלית לשכבת גרגרים הפנימית של המוח הקטן שבו הם מייצגים את האוכלוסייה העצבית הגדולה ביותר במוח של היונקים הבוגר. בחומוס, השיא של התפשטות EGL מתרחש לקראת סוף השבוע של הריון השני. על מנת למקד את השינוי גנטי לשכבה זו בהשיא של שגשוג, שפיתחנו שיטה למניפולציה גנטית דרך electroporation vivo לשעבר של פרוסות המוח הקטן מעובר חומוס עוברי יום 14. שיטה זו משחזרת כמה היבטים חשובים של in vivo פיתוח נוירון גרגיר ויהיה שימושי ביצירת הבנה מעמיקה של התפשטות תאי גרגיר המוח הקטן ובידול, ולכן פיתוח של המוח הקטן, אבולוציה ומחלה.

מבוא

המוח הקטן יושב בקצה הקדמי של המוח האחורי, והוא אחראי לאינטגרציה של עיבוד חושי ומוטורי במוח הבוגר, כמו גם ויסות תהליכים קוגניטיביים גבוהים יותר ^1. ביונקים וציפורים, ברשותה מורפולוגיה משוכללת וfoliated בכבדות, מוצר של הגברה מעבר הנרחבת של אבות במהלך פיתוח שמייצר יותר ממחצית תאי העצב במוח הבוגר. המוח הקטן היה נושא של לימודים לneurobiologists במשך מאות שנים ובעידן המולקולרי כמו כן זכה לתשומת לב משמעותית. זה מתייחס לא רק לביולוגיה מעניינת מיסודה, אלא גם לעובדה שהוא מעורב בכבדות במחלות של בני אדם כוללים הפרעות גנטיות התפתחותיים כגון הפרעות ספקטרום האוטיסטי ² והבולטת ביותר בסרטן במוח הקטן, מדולובלסטומה ^3, המהווה את המוח בילדים הנפוץ ביותר גידול. חשוב לציין, זה מערכת מודל מצוינת בתוך "שich ללמוד הקצאת גורל וneurogenesis במהלך התפתחות מוח ^4. בשנים האחרונות, יש לו גם הוקם כמערכת מודל למחקר ההשוואתי של התפתחות המוח, בשל המגוון העצום של צורות המוח הקטן ראו על פני תולדות הגזע חוליות ^5-10.

המוח הקטן מתפתח ממחצית הגב של 1 rhombomere במוח האחורי והתפתחותית ¹¹ מורכב משתי אוכלוסיות עיקריות אב, שפת rhombic ואזור חדרית. שפת rhombic משתרעת סביב אזור הגב של neuroepithelium של המוח האחורי בגבול עם צלחת הגג. זה הוא מקום הולדתו של הנוירונים מעוררים glutamatergic של המוח הקטן ^12-14. אזור חדרית מוליד נוירונים המעכבים GABAergic המוח הקטן, בולט ביותר נוירונים פורקינג הגדולים ^14,15. בהמשך פיתוח (מיום העוברי על 13.5 בעכבר; E6 בחומוס ^16), ProGen glutamatergicitors להעביר בעקיפין משפת rhombic וליצור שכבת pial של אבות: אזור אב המשני נקרא השכבה החיצונית גרגיר (EGL). זה שכבה זו שעוברת הגברה המעבר הנרחבת שמובילה למספרים של נוירונים גרגיר הענק שנמצאו במוח הבוגר.

הפצת נשק בEGL נקשר ארוכה למיקום תת-pial שנובע מהגירה משיקה משפת rhombic ^17, עם המעבר ליציאת מחזור התא והתמיינות עצבית של אבות להיות קשורה עם יציאתם מהשכבה החיצונית EGL למרכז EGL ^18. הגירה משיקה נרחבת של תאי גרגיר לאחר mitotic בציר המדיאלי-רוחב מתרחשת באמצע וEGL הפנימי ^19, לפני הגירת רדיאלי סופית לשכבה הפנימית של גרגיר קליפת המוח הקטן הבוגרת. הגירה של תאים משפת rhombic על פני השטח של המוח הקטן תלויה באיתות CXCL12 מפיא ^20-22 ותאי גרגיר להביע קולט CXCL12 CXCR4. ההגירה משיקה שלהם היא בכך מזכיר את זו של בעקיפין neocortical הנודד אוכלוסיות interneuron מעכבות ^23-25. מסקרן, מחקרים מיקרוסקופיים אלקטרונים ¹⁷ הראו כי תאי EGL עם מורפולוגיה שגשוג לשמור על קשר pial, מקשר התנהגות תא עם יכולת שגשוג באופן המזכיר את האבות הבסיסיים של קליפת המוח היונקים ^26. הדבר בא לידי ביטוי בריבוד האמור של EGL לשלוש בתת-השכבות שמוגדרים על ידי סביבה תאית שונה ובו יש לי מבשרי גרגיר ביטוי גנים שונים חתימות ^18.

התפשטות של אבות בoEGL מתרחשת בהתפלגות נורמלית של גדלי שיבוט כזה שכאשר אבותיהם בנפרד כותרת גנטית בסוף ההתפתחות עוברית בעכבר, הם להצמיח ממוצע חציון של 250-500 גר 'postmitoticנוירונים ranule ^27,28. הפצת הנשק תלויה באיתות שהשש mitogenic מבסיס תאי פורקינג ^'29-32. היכולת להגיב שלשש הוכחה להיות תלוי לחלוטין על ביטוי אוטונומי תא של גורם שעתוק Atoh1, הן במבחנה ³³ וin vivo ^34,35. כמו כן, יציאת מחזור התא והתמיינות הוכחה להיות תלוי בביטוי של גורם השעתוק במורד הזרם NeuroD1 ^36, שעשוי מדכאים ישירים של Atoh1 ^37.

למרות התקדמות זו, וקידום רב בפענוח הבסיס הביולוגי של תא יציאת מחזור תא ^38-42, המנגנון הבסיסי המולקולרי (ים) שעומד בבסיס ההחלטה ליציאה ממחזור התא ולעבור מאב לנוירון הבחנה, ו הגירה הנלווית postmitotic משיקה בEGL הפנימי, כמו גם את המתג מאוחר יותרלהגירה רדיאלי, יישאר חלקי הבין. זה הוא בגלל חוסר היכולת להשתלט הניסיונית של EGL במידה רבה: זה מאוחר פיתוח, וקשה למקד גנטי שכן רב מאותו המקור עצבי המולקולות חיוניות גם קודם לכן בחייו של מבשרי גרגיר בשפת rhombic. כדי להתגבר על בעיה זו, מחברים רבים פיתחו in vivo וelectroporation vivo לשעבר כשיטת למקד המוח הקטן שלאחר הלידה במכרסמים ^43-48. הנה, אנחנו חלוצים שימוש electroporation vivo לשעבר בחומוס ללמוד EGL, המייצג את היתרונות משמעותיים במונחים של עלות ונוחות. השיטה של electroporation והתרבות הפרוסה vivo לשעבר של רקמת המוח הקטן אפרוח שלנו משתמשת ברקמה גזור מיום עוברי 14 אפרוחים בשיא התפשטות EGL. שיטה זו מאפשרת מיקוד גנטי של EGL עצמאי של שפת rhombic ויהיה להגדיר את הבמה לנתיחה גנטית של המעבר מגרגיראב לנוירון גרגיר postmitotic במוח הקטן.

פרוטוקול

הערה: כל הניסויים בוצעו עם בהתאם לקינגס קולג 'לונדון, בריטניה והנחיות הטיפול בבעלי החיים של משרד הפנים הבריטיים.

1. Dissection של E14 מוח קטן

1. דגירה ביצי תרנגולת המופרת חום ב 38 מעלות צלזיוס ליום עוברי 14.
2. המספריים ביצה באמצעות לערוף עוברים אפרוח באוב ולהסיר את הראש לצלחת פטרי המכילה קרח הקר PBS (איור 1 א).
3. בעזרת מלקחיים סטנדרטיים, לעשות חתכים מאחורי כל עין לאורך כל הדרך הרקמות, הסרת העיניים ולסת עליונה. לעשות חתך שני לאורך כל דרך לוע הסרת הלסת התחתונה (איור 1).
4. בעזרת מלקחיים סטנדרטיים, להסיר את כל העור מפני שטח של גולגולת על ידי קילוף אותו (איור 1 ג) ולהסיר עצמות קדמיות והקודקודית, חושף מוח.
5. מהיבט הגחון, להסיר סחוס בלוע וmesenchyme עזר.
6. מהיבט גב, זהירly להסיר גב mesenchyme לטיפול לוקח למוח האחורי שלא לפגוע פיא, ומוח הנפרד שלם (איור 1D).
7. לעשות חתך לאורך כל הדרך רקמת המוח התיכון ובין המוח האחורי ומוח אחורי הנפרד כולל המוח הקטן (איור 1E).
8. על ידי ביצוע חתכים לאורך כל דרך הרקמה בשני צמתים לרוחב של המוח הקטן וצלחת עלאר של המוח האחורי, להסיר כל המוח הקטן, תוך הקפדה על השמירה על שלמות פיא ברחבי נתיחה (איור 1F). הסר את מקלעת דמית העין ויוצרים (איור 1G).
9. הזז את המוח הקטן גזור לתוך קר כקרח HBSS.

2. פורסים תרבות של E14 מוח קטן

1. העבר את כל המוח הקטן לפלטפורמה סטרילי של רקמות ופר בעזרת מרית או פיפטה פסטר 3 מיליליטר עם הקצה לחתוך להרחיב את הצמצם. הסר נוזל עודף באמצעות פיפטה.
2. חותך כל המוח הקטן כל בtהוא נדרש התמצאות בעובי 300 מיקרומטר באמצעות מסוק הרקמות משובצים מהירויות חיתוך ב 50% מהמקסימום. שלמות רקמה נשמרה בקלות בסעיף sagittal; עם זאת, נטייה היא גם שיקול חשוב לניתוח תא (תא דנדריטים פורקינג הם sagittally מיושרים, ואילו אקסונים תא גרגיר לרוץ רוחבי, ניצב למישור של הדנדריטים תא פורקינג ').
3. בעזרת פיפטה פסטר 3 מיליליטר, לכסות את המוח הקטן הפרוס בקרח HBSS הקר.
4. העבר את הפרוסות בHBSS לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה HBSS הטרי קר כקרח בעזרת פיפטה פסטר 3 מיליליטר עם קצה לחתוך.
5. תחת מיקרוסקופ לנתח מואר עם מקור אור סיבים אופטי, להבטיח הפרדת פרוסות בודדות באמצעות מלקחיים שען. לזהות פרוסות להיות electroporated, המבוסס על שלמות הרקמות שלהם ומיקום Medio-צדדי.
   הערה: כל נתיחה מהעובר דרך לחתוך דגירה במדיום התרבות לוקחת upo בהתאם סביב 10-20 דקותניסיון n. לבצע ניתוחים אחד בכל פעם, כדי להבטיח cerebella שמבלה זמן מינימאלי בין עריפת הראש והתרבות לשעבר vivo.

3. Electroporation של פרוסות

1. לבנות תא electroporation ידי תיקון האנודה של electroporator לבסיס של צלחת פטרי 60 מ"מ עם סרט בידוד. להוסיף כ 1 מיליליטר של HBSS כדי לכסות את האלקטרודה.
2. מניחים להוסיף 0.4 מיקרומטר תרבות על גבי האלקטרודה המכוסה בHBSS. לאפשר את הכנס התרבות לנוח על האלקטרודה לוודא תמיד יש קשר בין ההוספה ואלקטרודה.
   הערה: בהתקנה זו, להכניס התרבות עם פרוסות ינוחו על פני השטח של הפתרון, שמירה על המעגל אבל מאפשר מיקוד המרחבי של הקתודה.
3. פרוסות העברה מזוהות (עד חמש לכל הכנס תרבות) על הוספת התרבות באמצעות פיפטה פסטר 3 מיליליטר עם הקצה לחתוך. נפרד ומאפשר להתיישב על הוספת התרבות בsagittאוריינטצית אל.
4. בעזרת פיפטה, להסיר HBSS העודף, כך שפרוסות כבר לא טובלים בפתרון.
5. באמצעות קצה P10 פיפטה, DNA פיפטה (בריכוז של 1 מיקרוגרם / μl) מדולל עם 20% ירוקים מהר על פני השטח של אזור מיקוד של הפרוסה. 20% ירוקים מהיר מבטיחים פתרון ה- DNA צמיג ומונעים להחריד פיזור רחב של DNA. להוסיף כ 5 DNA μl פתרון ירוק מהיר / לכל פרוסה (איור 2).
6. מניחים את הקתודה מעל רצוי רקמות ממוקדות וelectroporate עם 3 x 10 V, 10 פעימות משך msec. יש להימנע ממגע ישיר של הקתודה עם הרקמה. במקום זאת, לנצל את מתח של נוזל משטח לשמור מוליכות (מקום הקתודה הקרובה לרקמה ככל האפשר מבלי לגעת ברקמה).
7. חזור על משלוח DNA וelectroporation לאזורים מרובים של EGL על כל פרוסה המוח הקטן בודדת כרצויה.
8. עם השלמת electroporation, inse תרבות העברהRT 30 מ"מ צלחת פטרי.
9. לכל תרבות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום התרבות המחומם מראש (Basal נשר בינוני, 0.5% (w / v) D - (+) - גלוקוז, 1% תוספת B27, 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) מתחת להוספת התרבות כך שהוספת התרבות היא במגע עם מדיום, אבל פרוסות לא טובלת בזה.
10. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס / 6% CO ₂ עד 3 ימים. להחליף את כל מדיום התרבות כל שעות 24 עם מדיום מראש חימם טרי.
11. בעקבות התרבות, לתקן פרוסות בתרבות מוסיפה לשעה 1 בparaformaldehyde 4% (או O / N ב 4 ° C) בצלחת 30 מ"מ טרי ללא תקשורת ותרבות.

4. הדמיה של המוח הקטן Slices

1. בעקבות קיבעון, לשטוף פרוסות 3 פעמים במשך 5 דקות בPBS.
2. באמצעות סכין גילוח, לנתח כל פרוסה המוח הקטן electroporated ותרבותי מלהכניס התרבות על ידי חיתוך סביב פרוסה והסרת פרוסה והאזור של הכנס הוא דבקו. לַעֲשׂוֹתלא תנסה להסיר פרוסה מהמשטח להכניס התרבות.
3. פרוסות הר בכ 1 מיליליטר של מדיום הרכבה המכיל DAPI (אם רוצה) תחת טיפול לוקח coverslip לא להכניס בועות, ותמונה באמצעות מיקרוסקופיה confocal לייזר סריקה.
   הערה: יכולים להיות מגוונים פרמטרים הדמיה על פי המבנים electroporated, ולפי שיקול דעתו של המשתמש הבודד.

תוצאות

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג באמצעות electroporation פרוסה ותרבות של המוח הקטן מחומוס יום 14 עוברי. הנתיחה של המוח הקטן מודגמת באיור 1 ותא electroporation הקים מוצג באיור 2. אנחנו מראים שזה אפשרי לelectroporate והצלחת פרוסות המוח הקטן תרבות, אשר שומרות על המבנה שלהם ומורפולוגיות סלולריות במבחנה (איור 3 א). electroporation הממוקד לfolia פרט מושגת בקלות (איור 3).

דיון

הפרוטוקול דיווח כאן מתאר שיטה לנתח, electroporating וculturing פרוסות של המוח הקטן יום 14 עוברי מהחומוס. פרוטוקול זה מאפשר מיקוד של electroporation לאזורים קטנים מוקד של EGL, כוללים מיקוד מבודד של אונות המוח הקטן בודדות. הוא מאפשר ניתוח והדמיה גנטיים ברזולוציה גבוהה ונוחות, ובמחיר נמוך בהשוואה לטכניקות הוקמו במכרסמים ^43-47. ניתוח כזה הוא אינו אפשרי כיום בvivo עקב תקופה הממושכת התפתחותית הזמן, המחסור באפשרויות מיקוד גנטי EGL ספציפי בעכבר, והאחידות של מנגנונים מו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קוצץ רקמות מקלווין	Mickle Laboratory Engineering Ltd		חתך ב-300 μ M לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
נשר בינוני בסיסי (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-גלוטמין	Sigma	G7513
פניצילין/סטרפטומיצין	Sigma	P4333
0.4 μ m תרבית הכנסה	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	השתמש בפולסים של 3 x 10 וולט, 10 מילי-שניות לאלקטרופורציה.