מאמר שיטה

Air-שנדגמו ניתוח סינון עבור אנדוטוקסינים ותוכן DNA

9.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53444

⸱

7 במרץ 2016

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

במאמר זה

סיכום

שני ניתוחים משלימים של חלקיקים ביולוגיים אטמוספריים ממסננים שנדגמו באוויר מתוארים כאן: מיצוי וזיהוי של אנדוטוקסין ושל DNA.

תקציר

מחקר אירוסול חיצוני כלל משתמש חומר חלקיקי נדגמים מסננים. הליך זה מאפשר אפיונים שונים של חלקיקים שנאספו להתבצע במקביל. מטרת השיטה המוצגת כאן היא להשיג ניתוח מדויק והאמין ביותר של תוכן רעלן הפנימי ו- DNA של ביו-אירוסולים מופקים מסננים. הפקת מולקולות אורגניות משקל מולקולרי גבוה, כגון lipopolysaccharides, ממסנני שנדגמו כרוך רועד המדגם בתווך על בסיס מים pyrogen חינם. הניתוח שלאחר מכן מבוסס על תגובה האנזימטית כי ניתן לאתר באמצעות מדידת turbidimetric. כתוצאת התוכן האורגני הגבוה על מסנני שנדגמו, החילוץ של דנ"א הדגימות מתבצע באמצעות ערכת חילוץ DNA מסחרית אשר תוכננה במקור עבור קרקעות שונות כדי לשפר את תשואת DNA. איתור וכימות של מינים ספציפיים של חיידקים באמצעות Reacti שרשרת פולימראז כמותייםעל (q-PCR) ניתוח מתואר ולעומת משיטות אחרות.

מבוא

דגימת אוויר על מסננים הוא כלי בסיסי במחקר אירוסולים אטמוספריים. 1 המסננים שנדגמו הם נקודת המוצא כימית שונה, פיזי, ומאפיינים ביולוגיים של חלקיקי הסביבה שנאספו. 2-11 היתרון של גישה זו הוא כי ניתוחים שונים יכולים להיות ביצע off-line על מדגם זהה. ליקוט נתונים מכל הניתוחים השונים מאפשר לחוקר לקבל הבנה טובה של המאפיינים של חלקיקים שנאספו ועזרים בפתרון שאלות מורכבות בתחום מדעי האטמוספרה. 12,13 לדוגמה, ימיית יבשת אוויר-דגימות שנלקחו במהלך אותה תקופת ניתן להשוות ביחס רעילות החלקיקים שנדגמו והרכב ביולוגי. 14 לצורך המחקר, lipopolysaccharides (LPS), רכיבים על קירות תא החיידק גרם שליליים, הידוע גם בשם אנדוטוקסינים, חולצו מן מסננים שנדגמו על-shore ב אתר יבש, וכן הוערך באמצעותLimulus lysate amebocyte (LAL) הבדיקה. במקביל, ערכה הגנומי של תוכן החיידקים (חיידקים הכולל, גרמו שלילית, כחוליות) בוצעו על המדגם הזהה באמצעות תגובת שרשרת פולימרז כמוני (q-PCR). מבחן LAL מבוסס על מדידות של עכירות נוצרו בעקבות התוספת של תמצית מימית של amebocytes מן סרטן הפרסה, פוליפמוס Limulus, כדי בתמיסה מימית המכילה את אנדוטוקסינים. ריכוז רעלן הפנימי הגבוה ב המדגם, העכירות מהר מפתחת. 15 ניתוח q-PCR מבוסס על אותות קרינה נפלטים כמו קטע DNA ספציפי מוגבר. 16 על ידי ניטור בזמן אמת של האות בשלב המעריכים של PCR ניתן לכמת תגובת כיול עם עקומת סטנדרט, כמות ה- DNA הראשונית. השילוב של שני אלה מנתח יחד עם אחרים, כמפורט במקומות אחרים, 14 יכול לספק הערכה טובה של רמות של רעלן פנימי ואתכמות חיידקי המקור בדגימות.

מטרת השיטה המוצגת כאן היא להשיג ניתוח מדויק והאמין ביותר של תוכן רעלן הפנימי ו- DNA של ביו-אירוסולים מופקים מסננים. בעוד שיטות הדגימו את המאפיינים הכימיים הפיסיים אנאורגניים אירוסולים ידועות, ולאחרונה, שיטות פותחו כדי לחקור מרכיב החומר האורגני שלה, 17 חלו מחקר דל על המרכיב הביולוגי של אירוסולים. 18 רציונל הזרם שיטה היא לתת מענה לפער זה על ידי ההצגה בפירוט שיטה חזקה לחילוץ, ניתוח וזיהוי החלק הביולוגי של אירוסולים מוטסים. 14

השיטה המפורטת כאן צפויה למצוא שימוש רחב התפשט בפרויקטים מחקריים אירוסול מקורה ביולוגיים החיצוניים המעורבים ניתוח מסנן. 20-24

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: רשימה מפורטת של כל החומרים וכלי להשתמש בפרוטוקול זה מוצגת בסעיף החומרים.

1. דגימות אוויר על מסננים

  1. הכנת מסננים
    1. לדגימה בנפח גבוה, להשתמש 20.3 x 25.4 ס"מ 2 מסננים. בחר את סוג מסוים של מסנן המתאים ביותר לצרכים מחקריים, כמו גם את הגודל חתוכים מסנן, אם זה אפשרי. 1 כאן, מסננים מיקרופייבר קוורץ שימוש.
    2. מסננים טרום לאפות מיועד דגימת תרכובת אורגנית וביולוגית להשמיד שאריות אורגניות. טרום לאפות את המסננים, לעטוף אותם בנפרד בנייר אלומיניום ולאפות אותם בתנור מעבדה ב 450 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 5.
    3. אחסן את מסנני אפוי ב -20 ° C עד הדגימה.
  2. טיפול Instrument אוויר דגימה
    1. אבק שיורית נקי מהראש של סמפלר בנפח הגבוהה. נגב את החלקים עם מגבוני נייר נקיים ולאפשר להם befo האוויר יבשמחדש וחיבור מחדש אותם סמפלר.
    2. לחטא את מכלול הסינון עם אתנול, ולעבוד עם כפפות וחלוק מעבדה בכל עת.
    3. מקום מסנן מראש אפוי בתוך מכלול הסינון נקי, והמשך בהתאם למדריך סמפלר בנפח גבוה.
    4. סמן את התאריך בכל תנאי מזג האוויר יוצא דופן, אם (סערה למשל גשם, אבק) החלים על לעטוף אלומיניום, ולשמור אותו במקום נקי עד להשלמת הדגימה.
    5. אסוף את המסנן שנדגמו ומקפלים אותו לשניים, כאשר הצד שנדגמו מול פנימה.
    6. עוטפים את המסנן רדיד ולאחסן אלומיניום המקורי ב -20 ° C עד הניתוח.
      הערה: אם הפרש בזמן בין דיגום ואנליזה הוא יותר מ 2 חודשים, לאחסן המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, כדי למנוע השפלה של החומר האורגני וביולוגיים.

2. ניתוח אנדוטוקסינים

הערה: לחטא את משטח העבודה עם אתנול 70%ד עבודה עם צינורות pyrogen ללא, טיפים ריאגנטים בלבד. אם זכוכית משמשת, טרום חימום ב 250 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, או 200 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות נדרש. 25 יש להכין את כל ריאגנטים בתוך ארון בטיחות ביולוגי בכיתה שנייה ולעבוד עם כפפות וחלוקים מעבדה בכל העת.

  1. הכנת מגיב
    1. פעל על פי פרוטוקול של יצרן ערכת LAL רעננותם את lysate זמן קצר לפני השימוש. 26 קש בעדינות על הבקבוקון כדי לסלק LAL הנותר על קירות הבקבוק. הרם את הפקק בעדינות לשבור את הוואקום. באמצעות מזרק המחטניים, להוסיף 5 מ"ל מים חינם pyrogen (PFW) כדי בקבוקון רעננותם כל תוכן lysate ומערבבים בעדינות כדי למנוע היווצרות קצף.
    2. חותם את הבקבוקון עם סרט פרפין פלסטיק כשאינו בשימוש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד ימים. אחסן כל lysate הנותרים ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.
      הערה: מגיב זה אפשר להקפיא רק פעם אחת.
    3. רעננותם רעלן פנימי תקן הבקרה (CSE), אשר מכיל 0.5 μ; ז א coli, בהתאם פרוטוקול של היצרן. 27 לקבוע את כמות מים מוגדרת יתווספו בקבוקון CSE מאתר האינטרנט של היצרן 28 על ידי הזנת מספר הרבה על ערכת היכן שצוין באתר. הריכוז הסופי של E. coli בבקבוקון, נמדדת ביחידות רעלן פנימי (EU; שם 10 האיחוד האירופי = 1 ננוגרם). לייבל בקבוקון זה Ed0.
    4. חותם את בקבוקון CSE עם סרט פרפין פלסטיק כשאינו בשימוש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
  2. עקומת סטנדרט והכנה ממוסמרת-מסנן
    1. בארון בטיחות ביולוגי בכיתה שנייה, להכין 22 צינורות pyrogen ללא 2 מיליליטר צנטריפוגות המכילים כמויות ירידה של CSE (צינורות ED1-Ed11) או לא CSE (הצינור הריק המכיל PFW בלבד) כדי לייצר סדרת דילול רעלן פנימי כפולות, כפי שמוצג בטבלה 1.
    2. בארון ביולוגי עם זרימה מעגלית, לחתוך 22 חתיכות עגולות של נקי, מסנן מראש אפוי באמצעות חיטוי 1.1 דקור הפקק 2 ס"מ קוטר.
    3. מניח את הזוגות לסנן לתוך בצלחות פטרי סטרילית.
    4. ספייק 50 μl מכל חבר סדרת דילול רעלן הפנימי ED2-Ed11 ו מהצינור הריק על זוג המסננים מקביל.
    5. השאר את צלחות פטרי המכילות את המסננים הממוסמרים הפתוחים מתחת למכסת המנוע לייבוש למשך 30 דקות.
    6. מניחים כל פיסת מסנן בצינור מ"ל 2 pyrogen חינם.
צינור ריכוז רעלן פנימי סופי (EU מ"ל -1) נפח רעלן פנימי רגיל (מ"ל) נפח המים חינם pyrogen (מ"ל) נפח כולל (מיליליטר)
Ed0 2,500 פתרון מניות * 5
ED1 1,000 80 (מ Ed0) 120 200
ED2 100 20 (מ ED1) 180 200
Ed3 50 10 (מ ED1) 190 200
Ed4 25 5 (מתוך ED1) 195 200
Ed5 12.5 2.5 (מ ED1) 197.5 200
Ed6 6.25 1.25 (מ ED1) 198.75 200
Ed7 3.125 6.25 (מ ED2) 193.75 200
Ed8 1.563 6.25 (מ Ed3) 193.75 200
Ed9 .781 6.25 (מ Ed4) 193.75 200
Ed10 .391 6.25 (מ Ed5) 193.75 200
Ed11 .195 6.25 (מ Ed6) 193.75 200
רֵיק 0 0 200 200
* הכן את פתרון המניות על פי הוראות היצרן.
">

טבלת 1:. עקומת סטנדרט אנדוטוקסינים ריכוז אנדוטוקסינים, נפח של רעלן פנימי סטנדרטי של מי pyrogen ללא להתווסף, ואת הנפח הכולל מתקבל מפורט עבור כל צינור דילול בעקום הכיול.

  1. הפקת אנדוטוקסינים מן ניסיוני ומסננים ממוסמרים
    1. בארון ביולוגי עם זרימה מעגלית, לחתוך את מסנני המדגם (מ שלב 1.2) לחתיכות מעגליות באמצעות מקדח פקק קוטר 1.12 סנטימטרים לחטא, ומניח אותם, יחד עם מסנני תקן הממוסמרים (מ שלב 2.2), ב pyrogen ללא 2 צינורות מ"ל (כלומר, דוגמיות).
    2. הוסף 1 מ"ל PFW אל צינורות ולנער אותם במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות שייקר מעבדה.
    3. צנטריפוגה דוגמיות microcentrifuge בבית 375 XG במשך 10 דקות. 29
    4. ה העברהsupernatant דואר, אשר מכיל את אנדוטוקסינים, לתוך צינור pyrogen ללא 2 מ"ל חדש.
  2. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) מבחן
    1. קבע את ריכוז רעלן הפנימי בדגימות על ידי ביצוע בדיקת LAL בתוך microplate 96-היטב pyrogen ללא עם תחתית שטוחה ומכסה.
    2. לתכנן את מערך צלחת מראש, כפי שמוצג באיור 1. כלול עקומת סטנדרט מוכן ישירות פתרונות סטנדרטיים רעלן פנימי ED2-Ed11 (ובכך מכסה את טווח הריכוז של 100-0.195 מ"ל האיחוד האירופי / (ראה סעיף 2.2)) בכל צלחת פועל . עקומת התקן צריכה לכבוש בארות 1-10 מתוך שורות A ו- B של הצלחת. מניח בצד בארות 11-12 בשורות אלה עבור דגימות ריקות (ובסך הכל ארבעה חסרים).
    3. הפעל את קורא microplate ולתכנת אותו לתגובה הקינטית המעורבת דגירה של microplate ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת בכל 5 דקות, ואחריו מדידות ספיגות ב 405 ננומטר. חזור 18 פעמים עבור 1.5 שעות.
    4. קבע את efficienCY שבה אנדוטוקסינים המחולצים המסננים המדגם (כלומר., הדגימות המתקבלות המסננים הסטנדרטיים הממוסמרים) באמצעות חלוקת סכום רעלן הפנימי מחושב לפי הסכום המקורי זנקו.
    5. הפעל את assay על ידי צבת 50 μl של פתרונות רעלן הפנימיים הסטנדרטיים (משלב 2.4.2), או של תמצית המסנן הממוסמרת ואת החסר שלה (מתוך סעיף 2.3), או של דגימות הניסוי ואת החסר שלה (גם מ -2.3 סעיף), לפי הצלחת מערך שתוכננה (איור 1) וסגור את המכסה.
    6. זה טוב, להוסיף במהירות 50 μl של פתרון LAL, בעדינות לנער את הצלחת אופקית בזמן שהוא מונח על השולחן לפני הרמת אותו לתוך הקורא.
    7. מניח את הצלחת לקורא הצלחת ולהתחיל בטווח הניסיוני.

figure-protocol-1
איור 1:. הצליח מערך אנדוטוקסינים לשעברבשפע של מערך ניתוח רעלן פנימי בתוך microplate 96-היטב.

3. ניתוח הגנום

הערה: מיצוי DNA, לחטא את משטח העבודה עם אתנול 70% ולעבוד עם צינורות סטרילית, טיפים ריאגנטים בלבד. באשר לניתוח DNA q-PCR, לחטא את משטח העבודה עם-decontaminant DNA השטח. יש להכין את כל ריאגנטים בתוך ארון בטיחות ביולוגית בכיתה השנייה ולעבוד עם כפפות וחלוק מעבדה בכל עת.

  1. הכנת Primers דנ"א הבדיקות
    1. לפני מיצוי DNA, או כדי להגדיר, זמינה מסחרי של פריימרים וכן בדיקה (אם שיטת הבדיקה הידרוליזה מוחלת), או לעצב סט חדש של פריימרים וכן בדיקה באמצעות פריימר בעיצוב בכלים חישוביים. 30
    2. רעננותם פריימרים פי פרוטוקול של היצרן או באמצעות 10 מ"מ טריס-0.1 חומצה מ"מ Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (חיץ TE) או מים PCR כיתה.
      הערה: מומלץ לפזר את פריימר PCR הראשוני stOck במאגר TE עם EDTA נמוך (0.1%) כפי שהוא מונע השפלה פריימר כאשר כל הזמן לזמנים ארוכים יותר. השתמש במים PCR כיתה עבור דילולים לאחר להפחית כמויות EDTA שעשוי לעכב PCR תגובות.
    3. הכן aliquots של 50 μl או 100 μl של פריימר בדיקה 0.5 סטרילי צינורות מ"ל ולאחסן ב -20 ° C עד הניתוח.
  2. הערכת ריכוז תאים סטנדרטית לפני DNA הפקה
    1. בתוך צינור צנטריפוגות בגודל מתאים, להכין פתרון תאים סטנדרטיים של מינים של חיידקים עניין (שפופרת Od0, לוח 2 א). מערבבים את ההשעיה על ידי תא pipetting אותה למעלה ולמטה בצינור 7-10 פעמים בעזרת פיפטה עם משעמם קטן.
    2. אם התאים נצבעים (למשל נבגי פטריות מסוימים), לא לבצע הליך מכתים. אם מכתים תא נדרש, לדלל את השעית תא צבע מתאים לגילוי מיקרוסקופי של התאים בעלי עניין. 31
    3. נקה את התלוש לכסות ו hemocytometer עם אתנול. להרטיב ו להטביע את תלוש לכסות על hemocytometer.
    4. טען על 8 μl של השעיה התא לשני תאי hemocytometer על ידי נגיעה בקצה בקפידה של להחליק את המכסה עם קצה פיפטה ומילוי החדר על ידי פעולה נימי. אל מעל / מתחת למלא את התא.
    5. קבע את מספר התאים על ידי הצגה אותם תחת מיקרוסקופ בהגדלת 400X (40X ב אובייקטיבי 10X ב עיני). תשעה ריבועים מדידת 1 x 1 מ"מ 2 ו מסודרים ברשת 3 x 3 צריכים להיראות. פוקוס מיקרוסקופ על אחד מארבעת הריבועים בפינה של הרשת (בהגדלה גבוהה יכולה לשמש). כיכר 1 x 1 מ"מ 2 צריכה להכיל 16 ריבועים קטנים יותר.
    6. לספור את כל התאים בכיכרות הפינתיות 1 x 1 מ"מ 2, כמו גם בכיכר באמצע הרשת 3 x 3. אם יש יותר מדי או מעט מדי תאים לספור, לחזור על התהליך, או להתרכז או דילול השעית התא המקורי כנדרש (1550 תאים צריכים כיסוי אזור בידודם 1 מ"מ 2).
    7. חשבתי את הריכוז של התאים (תאי מיליליטר -1) השעית התא הסטנדרטית Od0 מתא ספירה בממוצע על פני חמשת הריבועים נספרו כדלקמן: תא ספירת מיליליטר -1 = ספירת תאי ממוצע מרובע -1 דילול פקטור 10 4.
  3. הערכת יעילות הפקת DNA
    1. הכן תשעה סטרילי 0.5 מ"ל צינורות לפי טבלה 2 א.
    2. לדלל את הפתרון תאים סטנדרטיים (Od0) המכיל כ -10 7 תאים מ"ל -1 בנפח כולל של 20 μl (Od1).
    3. להוסיף 18 μl מים nuclease חינם PCR כיתה סטרילי (NFW) לצינורות Od2-Od8 ו -20 μl אל הצינור ריק, Od9.
    4. העברת 2 μl של פתרון התא מפני Od1 לתוך Od2. פיפטה בעדינות לתערובת ולהעביר 2 μl מהצינור Od2 כדי Od3. המשך דילול התאים באותו אופן לאורך הצינורות עד וכולל צינור Od8 כדי obtain דילול סדרתי של 10 7 -10 0 תאים מ"ל -1.
    5. בארון ביולוגי עם זרימה מעגלית, לחתוך 18 חתיכות עגולות של נקי, מסנן מראש אפוי, באמצעות מקדח פקק קוטר 1.12 סנטימטרי חיטוי. מניח את המסננים בזוגות לתוך צלחות פטרי סטרילית.
    6. ספייק 10 μl מ הדילולים Od1 כדי Od8 ומן Od9 הצינור הריק על כל המסננים לזווג, כך שיש זוג מסנן אחד המתאים לכל אחד ריכוז תאים סטנדרטי.
    7. השאירו את צלחות פטרי פתוחה מתחת למכסה המנוע ולתת להם להתייבש למשך 30 דקות.
    8. מניחים כל פיסת מסנן בתוך שפופרת מ"ל סטרילי הברגה 2 ולחלץ את ה- DNA על פי הנוהל המפורט בסעיף 3.4.
  4. הפקת DNA מן ניסיוני ומסננים ממוסמרים
    הערה: הפקת DNA המסננת, להשתמש ערכות מסחריות שנועדו להפקת DNA מאדמת פי הפרוטוקול של היצרן בשינויים הבאים.
    1. עבור כל filמדגם ter (Od1-Od8), להכין תערובת של חרוזי זכוכית חומצה שטף בצינור 0.5 מ"ל סטרילי. השתמש 0.1 G חרוזים בעל קוטר של 425-600 מיקרומטר ו -0.3 G חרוזים בעל קוטר של ≤106 מיקרומטר.
    2. בארון ביולוגי עם זרימה מעגלית, לחתוך שלוש חתיכות עגולות ממקומות שנבחרו באופן אקראי על כל דגימה מסננת באמצעות מקדח פקק קוטר 1.12 סנטימטרי חיטוי, ומניח אותם ההברגה 2 צינורות מיליליטר.
    3. מוסיפים את תערובת חרוז זכוכית של חצוצרות.
    4. מוסיפים את החיץ תא-תמס מסופק עם ערכת חילוץ על צינור אחד בקבינט ביולוגי, עם כמות בפרוטוקול של היצרן.
    5. כן דלי הקרח ולשבש את התאים באופן מכאני באמצעות מקצף חרוז.
    6. מקציפים את החרוזים דקות 1 ולאחר מכן למקם אותם על הקרח דקות 1. חזור על חמש פעמים.
    7. להמשיך עם הפרוטוקול של ספק הערכה מהשלב שלאחר תמוגה.
    8. לאחר elution עם חיץ elution מסופק (מכיל 10 מ"מ טריס בuffer) או NFW, טען מדגם eluted דרך הטור שוב כדי לשפר את תשואת DNA.
      הערה: אם לא נותחו באותו יום כמו מיצוי DNA, דגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד הניתוח.
הכנת A- של סדרת תא דילול רגילה
צינור ריכוז תא סופי (תא מיליליטר -1) נפח תא רגיל (מ"ל) נפח Nuclease מים חינם (מ"ל) סך נפח (מ"ל)
Od0 לקבוע עם Hemocytometer קאמרית לספור
Od1 יש eluted כדי בטווח של 10 מ"ל 7 תאים -1 20
Od2 10 -1 Od1 2 של Od1 18 20
Od3 10 -2 Od1 2 של Od2 18 20
od4 10 -3 Od1 2 של Od3 18 20
Od5 10 -4 Od1 2 של od4 18 20
Od6 10 -5 Od1 2 של Od5 18 20
Od7 10 -6 Od1 2 של Od6 18 20
Od8 10 -7 Od1 2 של Od7 18 20
רֵיק 0 0 20 20
הכנת B- דנ"א רגיל Curve
צינור ריכוז ה- DNA הסופי (מ"ג מ"ל -1) נפח DNA רגיל (מ"ל) נפח Nuclease מים חינם (מ"ל) סך נפח (מ"ל)
לקבוע עם NanoDrop
DD1 יש eluted כדי בטווח של 10 מ"ל 1 מ"ג -1 20
Dd2 10 -1 DD1 2 של DD1 18 20
DD3 10 -2 DD1 2 של Dd2 18 20
Dd4 10 -3 DD1 2 של DD3 18 20
Dd5 10 -4 DD1 2 של Dd4 18 20
Dd6 10 -5 DD1 2 של Dd5 18 20
Dd7 10 -6 DD1 2 של Dd6 18 20
Dd8 10 -7 DD1 2 של Dd7 18 20
רֵיק 0 0 20 20
1 "style =" height: 21px; "> Dd0

טבלה 2:. עקומת סטנדרט DNA סדרת דילול תא מיקרואורגניזם רגילה (א) מפורטת עבור נפח התא הסטנדרטי, נפח NFW, ואת הנפח הכולל בצינור אחד דילול. הכנת עקומת סטנדרט DNA (B), מפורטת עבור נפח DNA הסטנדרטי, נפח NFW, ואת הנפח הכולל בצינור אחד דילול.

  1. הכנת עקומת סטנדרט DNA
    1. תמצית ה- DNA ישירות ממדגם התקן של מיקרואורגניזם עניין (Dd0) באותו אופן כפי שתואר עבור המסננים הניסיונות בשלב 3.4.
    2. השתמש ספקטרופוטומטר לקבוע את ריכוז ה- DNA של דגימת DNA הסטנדרטית (Dd0) ב 260 ננומטר.
    3. הכן תשעה 0.5 מ"ל צינורות סטרילית שממנו ניתן להכין עקומת סטנדרט DNA, כפי שמוצג בטבלה 2B.
    4. במידת הצורך, לדלל את פתרון ה- DNA תקן Dd0 כדי בטווח ריכוז של 1-10 מיקרוגרם מ"ל -1 בצינור הראשון (DD1) בהיקף כולל של 20 μl.
    5. להוסיף 18 μl של NFW לצינורות Dd2-Dd8 ו -20 μl אל הצינור ריק.
    6. העברת 2 μl של פתרון ה- DNA רגיל מן DD1 לתוך Dd2. Pipet בעדינות לתערובת ולאחר מכן להעביר 2 μl מן Dd2 כדי DD3. המשך דילול DNA באותו אופן לאורך צינורות להשיג דילול סדרתי של 10 0 -10 -7 צינורות Dd2-Dd8 יחד עם containi צינור ריקng רק NFW.
      הערה: אם לא נותחו באותו יום של חילוץ, דגימות חנות ב -20 ° C עד הניתוח.
  2. ניתוח כמותי-PCR
    1. הפעילו את מכשיר Q-PCR מראש כדי להתחמם.
    2. בתוך קובץ תוכנית חדשה, הכנס את הפרטים של Q-PCR לרוץ את תוכנת ההפעלה-מכשיר כמפורט בטבלה 3.
      הערה: מכשירים שונים יש עיתוי אופטימלי שונה בכל שלב במחזור תרמית. כניסה זו צוינה במדריך של המכשיר.
    3. לחטא את משטח העבודה עם-decontaminant DNA משטח ולעבוד רק עם צינורות סטרילית, טיפים, ריאגנטים.
    4. כן דלי הקרח ליד ספסל העבודה. חנות לערבב תקי-פולימראז על הקרח.
    5. חשב את המספר הכולל של בארות התגובה כי יהיה עסוק בצלחת. לָדוּן לְכַף זְכוּת תיאורטי תגובות נוספות (5%) ולהכפיל את המספר המוגדל של תגובות על פי היקף לכל תגובה לחישוב reactio הכולל נפח n.
    6. הכן את הברכה מעורבת תגובה, החל NFW, תחל בדיקה, ולבסוף לערבב פולימראז תקי. ראה לדוגמה עבור חישובי נפח לבריכה מעורבת בטבלה 4.
    7. אחסן את תערובת התגובה בחושך על הקרח עד לשימוש.
    8. מקום 1 μl של ה- DNA רגיל, דגימת DNA, או NFW (כביקורת שלילית) בתוך בארות microplate q-PCR ב triplicates.
    9. ודא כי הצלחת נמצאת בעל צלחת כדי למנוע ממנה לגעת קלות משטח העבודה כדי לשמור על ניקיונו.
    10. הוסף 9 μl של הבריכה מעורבת (לוח 4) לתוך כל תגובה גם.
    11. מכסים את הצלחת עם סרט דבק אופטי ולאטום אותו בחוזקה מכל הצדדים.
    12. ספין למטה צלחת בצנטריפוגה עם דליי צלחת דקות 1 XG ב 1000 לפני הצבתו בתוך מכשיר q-PCR.
    13. מניחים את הצלחת לתוך המכשיר ולהפעיל את תוכנית ריצה.
פָּרָמֶטֶר פרטים תגובות
שיטת זיהוי חללית הידרוליזה כמוני
תנאי רכיבה תרמית
הפעלת denaturation ואנזים ראשוני 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
denaturation 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות לחזור 45 פעמים
חישול וסיומת 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות
מערך פלייט
עקומת סטנדרט DD1 - Dd8 3 חזרות לכל דילול 1-8 בארות בבית 3 השורות העליונות
השליטה הלא התבנית (NTC) Nuclease מים חינם (NFW) 3 חזרות ב -9 היטב בחלק העליון3 שורות.
דגימות נותחו DNA מופק מסננים 3 חזרות לדגימה על הבארות הנותרות.
סט פריימר לכל היטב
נפח דגימה 10 מ"ל
ge = "1">

טבלה 3:. פרטים עבור תוכנת ההפעלה q-PCR פרטים של פרמטרים ניתוח לרשמם על קובץ התוכנית q-PCR.

מֵגִיב נפח לכל תגובה (מ"ל) מספר התגובות פרשת שגיאה (5%) תמהיל סך נפח (מ"ל)
לערבב פולימראז תקי 5 50 52.5 262.5
פריימר F (10 מ"מ) 0.5 50 52.5 26.25
פריימר R (10 מ"מ) 0.5 50 52.5 26.25
Nuclease מים חינם 3 50 52.5 157.5
DNA - 1 מיליליטר יתווסף ישירות לתוך בארות היעד ב -96 הצלחת.

הין-page = "1" FO: keep-עם-previous.within-page = "תמיד"> לוח 4:. כמוני-PCR תגובה מערבבת חישוב נפח לכל תגובה, מספר התגובות, הפרשת שגיאה, ואת הנפח הכולל מחושב להתווסף לתוך תערובת התגובה לכל מגיב מפורט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זה נפוץ ללמוד אירוסולים באטמוספירה באמצעות "off-line" מנתח של מסננים שנדגמו (ראה איור 2). 32 בדיקות כימיות של שנדגמו משנה כוללים אורגני (חלבון למשל, מולקולות פחמימנים, סכרידים) ואי-אורגניים (מתכות למשל, מלחים) תוכן . ניתוחים ביולוגיים לכלול תוכן מיקרואורגניזם קיימא ושאינו קיימא, זיהוי מינים באמצעות גישת DNA או מיקרוסקופיה, כמו גם כימותים מבוססים-DNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבודה זו מתארת ​​שיטות חילוץ וזיהוי לכימות הוא אנדוטוקסינים ובהווה DNA בדגימות אירוסול שנאספו על מסננים. השיטות דורשות שגרות מדויקות וניתן לבצעו בקלות כל עוד בניסויים דבק כמה נקודות חיוניות וחשיבות דנו כאן.

עבור שלב זיהוי רעלן הפנימי, לציין כי פתרון lysate די צמיג נוטה לייצר בועות על pipetting. קשה להסיר לך בועות, והם להביא לשינויי ערכי microplate הקוראים. לכן, חשוב למקם את המדגם ראשון בצלחת ורק לאחר שווידאת שכל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לד"ר יואב ברק מהפקולטה לכימיה במכון ויצמן למדע על התמיכה והייעוץ. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק #913/12), ועל ידי קרן מינרווה במימון המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ומחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<דגימת מסנן חזקה>
HiVol 3000 - דוגם אוויר בנפח גבוהקוורץ Ecotech
Whatman1851-865203 מ"מ x 254 מ"מ
ELF - תנורי תא מעבדהקרבוליטELF 11series
רדיד אלומיניוםאופל
< strong>שםCompanyCatalog Number>Comments
Endotoxin
EthanolSigma Aldrich16368 ריאגנט מעבדה, 96%
ארון בטיחות ביולוגי מסוג Airstream Class II AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell -TAssociates of Cape Cod, Inc.T0051
בקרת תקן אנדוטוקסיןעמיתים של קייפ קוד, בע"מE0005-1Escherichia coli  O113:H10, 0.5 ומיקרו; g/בקבוקון 1 חבילה
LAL Reagent WaterAssociates של קייפ קוד, בע"ממזרק סטרילי W0051
10 מ"ל עם Luer-Lok TipBecton-Dickinson & Co.
מחט מזרק BD PrecisionglideBecton-Dickinson & Co.305129סטרילי 
סרט איטום Parafilm-MParafilmP7543Sigma מספר קטלוגי
MicrotubesAxigenMCT-200-C2 מ"ל, ללא פירוגן
קוטר 1.12 ס"מ Cork BorerBoekel Scientific1601 BD Series - פלדהחלק מסט מקדחי שעם המכיל מקדחים בקטרים שונים. 
מיניפלסט צלחת פטרי 50 מ"מעין שמר72050-01אספטית
ג'יני 2 תעשיות מדעיות, בע"מSI-0297
מיקרוצנטריפוגה 5415 DEppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI עם מכסהNunc167008בארות תחתונות שטוחות (עם מכסה (עטוף בנפרד)), סטרילי, ללא פירוגן
Synergy HT Multi-Detection Microplate ReaderBiotek7091000
שם<חזק>חברהCatalog NumberComments
DNA
DNA רחוקסיגמא אולדריץ'7010
DNA סטנדרטי של המינים המיקרוביאליים המענייניםATCC או אוסףהזן המיקרוביאלי המתאים למיצוי DNA או ה-DNA
המופקNeubauerמשופר Marienfeld640030Hemocytometer
TE buffer, Low EDTALife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (pH 8.0)  0.1 מ"מ EDTA 
מים בדרגת PCR נטולי נוקלאז' Sigma Aldrich3315959001
פריימרים PCRSigma Aldrichמכוון למינים המיקרוביאליים המעניינים
בדיקות עם תווית כפולהSigma Aldrichמכוון למינים המיקרוביאליים המעניינים
צינורות מכסה בורגAxigenST-200-SS2 ml 
ערכת מיצוי DNA של PowerSoil Mo Bio Laboratories12888-100
חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה 425-600 ומיקרו; mSigma AldrichG8772-100G
חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה < 106 ומיקרו; mSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Solution C1Mo Bio Laboratories12888-100-1מאגר ליזה של תאים, ערכת אדמה Power Magic
Touch דלי קרחBel-Art18848-4001
Mini-Beadbeater-16BioSpec607EUR
StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמתיישומי Biosystems4376600
מהיר SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4370048
MicroAmp מהיר אופטי 96 בארות צלחת תגובה עם ברקוד, 0.1 מ"לApplied Biosystems4346906
MicroAmp ללא התזות 96 בארותבסיס יישומי Biosystems4312063
סרטדבק אופטי מיקרואמפאפלייד ביוסיסטמס4311971
צנטריפוגה 5810 REppendorf5811 000.010רוטור A-4-62 עם כפות MTP 
מסנני מיקרופייבר 309605 מערבולת תרביות אחר או

מקורות

  1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
  3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).
  9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
  10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
  26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
  27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
  28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
  29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
  32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
  33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
  40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAPCR

מאמרים קשורים