הרמת מסך טור זרימה: אופטימיזציה של יעילות ורגישות

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפעלה ואופטימיזציה של עמודת טכנולוגיית הזרימה הפעילה (AFT) במצב זרימת וילון (CF) לביצועי הפרדה משופרים.

תקציר

טכנולוגיית זרימה פעילה (AFT) היא סוג של טכנולוגיית עמודות המגדילה את ביצועי ההפרדה של עמודת HPLC באמצעות שימוש באביזרי קצה מרובי יציאות שנבנו במיוחד למטרה מיוחדת. עמודי זרימת מסך (CF) שייכים לחבילת העמודים AFT, במיוחד עמודת ה-CF מתוכננת כך שהדגימה מוזרקת לאזור המרכזי הרדיאלי של המיטה וזרימת מסך של שלב נייד סביב הזרקת המומס מונעת את הפיזור הרדיאלי של הדגימה לקיר. העמודה מתפקדת כעמודה 'קוטר אינסופי'. מטרת התכנון היא להתגבר על ההטרוגניות הרדיאלית של מיטת העמודים, ובמקביל למקסם את עומס הדגימה לאזור המרכזי הרדיאלי של מיטת העמודים, המשמש להגברת רגישות הזיהוי. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את המערכת ואת עמודת ה-CF שהוגדרה ואת תהליך הכוונון עבור עמודה 'וירטואלית' בקוטר אינסופי אופטימלי.

מבוא

בשנים האחרונות הטכנולוגיה טור כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) התקדמה מאוד; יכל שיא גדלו במידה ניכרת בעיקר הודות השימוש גדל של חלקיקים קטנים יותר חלקיקי פגז ליבה היעילים יותר. מאז הפרדות הן בדרך כלל יעילות יותר, זרימה על אפקט שהובילה לעלייה ברגישות מאז פסגות הן עכשיו חדות ומכאן גבוהות ^1-8.

אף על פי כן, ההטרוגניות מיטת רדיאלי הוא עדיין גורם המגביל את הביצועים של כל העמודות, אבל זה לא סיפור חדש מאז משתמשי כרומטוגרפיה לדעת זה במשך שנים רבות. מיטות טור הם הטרוגניים בשני בכיוון הרדיאלי ^9-12, ולאורך בעמודה ציר ^10,12-15. The-אפקט הקיר במיוחד הוא תורם חשוב אובדן ^7,16-18 ביצועי הפרדה. Shalliker ואת ריצ'י ⁷ נבדקו לאחרונה היבטים של ההטרוגניות מיטת עמודה ומכאן זה לא צריך להיות discusseד כאן עוד. למרות די לומר, כי וריאצית צפיפות אריזת מיטת עמודה והשפעות הקיר להוביל לעיוות של התקע המומס, כך להקות elute דרך עמודת תקעים דומות מולאו מרק חלקית קערות במקום דיסקים מוצקים שטוח דק ⁷ כי הם בדרך כלל מתואר בטקסטים הוראה בסיסית. כאשר ניסויים נערכו כך הגירה המומסת דרך המיטה יכולה להיות מדמיין את הפרופילים תקעו בתוך הטור היו בחלקם חלולים בסעיף העוקב של הלהקה הוא במידה רבה מרכיב הקיר של התקע המדגם. התוצאה הסופית היא שזה לוקח הרבה יותר צלחות להפריד אלה 'חלקית חלולים' תקעים מ יידרש אם הדיסקים היו מוצקים ושטוח ^12,14,17. כדי להתגבר על להקת הרחבת נושאים הקשורים תופעות קיר ואת וריאצית צפיפות אריזה רדיאלי, צורה חדשה של טכנולוגית טור המכונית Active Flow Technology (AFT) תוכננה ^7,19. מטרת העיצוב הזה הייתהכדי להסיר אפקטי קיר באמצעות ההפרדה הפיסית של משחררי ממס יחד באזור הקיר, ומאותו שלב נייד משחרר באזור המרכז הרדיאלי של העמודה ^19. ישנם שני סוגים עיקריים של עמודות AFT; מקוטע זרימה במקביל (PSF) עמודות ושפל מסך (CF) עמודות ^7. מאז פרוטוקול זה מיועד לשימוש ואופטימיזציה של עמודות CF, עמודות PSF לא יידונו נוספת.

הרמת מסך זרימה (CF)

תזרים הרמת מסך (CF) פורמטים טור לנצל סוף-אביזרי AFT בשני מפרצון ולשקע של הטור. סוף-אבזרי AFT מורכבים frit טבעתי הממוקם בתוך הולם multiport. Frit מורכב משלושה חלקים: חלק המרכזי רדיאלי נקבובי כי מיושר עם הנמל המרכזי של הסוף ההולם, חלק חיצוני נקבובי כי מיושר עם היציאה ההיקפית (ים) של הסוף ההולם וטבעת בלתי חדירה כי מפריד בין שני חלקים נקבוביים למנוע כל צלב-flow בין אזור המרכז החיצוני הרדיאלי של frit ^19. איור 1 מדגים את העיצוב של frit AFT ואיור 2 מתאר את פורמט טור CF. במצב זה של מבצע (CF) המדגם מוזרק לתוך הנמל המרכזי הרדיאלי של כניסת הולם, תוך בשלב נייד נוסף הוא הציג דרך היציאה ההיקפית של הכניסה 'הווילון' נדידת המומסים דרך באזור המרכז הרדיאלי של טור. לפיכך המדגם נכנס למיטה באזור המרכז רדיאלי של הטור עם האזור החיצוני של הטור שיש שלב נייד רק עבר את זה. מחקרים הראו כי יחס ספיקה של כ 40:60 (מרכזי: יציאה היקפית) עבור כניסת הסוף ההולמת של טור 4.6 מ"מ הקוטר פנימי (ID) הוא ^6,7,16 אופטימלי. שקע AFT של טור CF מאפשר התאמת הזרימה המרכזית ואת הפריפריה אל החלק היחסי שלהם יכול להיות מגוון כמעט לכל רטי רצויo באמצעות ניהול לחץ. אופטימיזציה של טור CF יכולה לשפר באופן משמעותי שונים היבטים פונקציונליים של טכנולוגית הטור, כגון יעילות הפרדה או רגישות זיהוי. באופן זה 'חסר-הקירות', 'בקוטר אינסופי "או" וירטואלי "טור מוקמת ^6,10,18,20. מטרת עמודות CF היא לנהל את ההגירה של המדגם פעיל דרך העמודה כדי למנוע המדגם מלהגיע לאזור הקיר. לפיכך, הריכוז המומס עם יציאה אל הגלאי מוגדל, מגביר את הרגישות של כ 2.5 פעמים יותר מאשר הפורמט הקונבנציונלי הטור בעת שימוש אולטרה סגולה (UV) זיהוי ^16, ואפילו יותר כאשר באמצעות זיהוי ספקטרלי המוני ^6.

עמודות CF מתאימות בצורה אידיאלית עבור דגימות ריכוז נמוכות, מאז גילוי רגישות מוגברת. יתר על כן, הם אידיאליים כאשר מצמידים לזרום גלאי מוגבל שיעור, כמו ספקטרומטר מסה (MS) ^6. האות Aטור FT במתכונת id 4.6 מ"מ, למשל יכול להיות מכוון כדי לספק את אותו נפח של ממס לגלאי כגיס בפורמט 2.1 מ"מ id רגיל כאשר פעל באותו מהירויות ליניארי, על ידי התאמת יציאה לזרם מרכזי ל -21%. כמו כן בעמודת AFT יכול גם להיות מכוונת כדי לספק אותו עומס נפח גלאי כגיס id 3.0 מ"מ, על ידי התאמת יציאה לזרם מרכזי ל -43%. למעשה בכל פורמט טור 'וירטואלי' יכול להיות מיוצר כדי להתאים את הדרישה אנליטיים ^6,18,22. שימוש מקצה אבזרים אלה תוכננו במיוחד על המפרצון ולשקע מבטיח כי טור חסר-הקירות נכון היא הוקמה.

ישנן שתי דרכים להגדיר את מערכת המסירה ממסה ליציאות המרכזיות ואת הפריפריה של הכניסה:. מערכת זרימת פיצול ⁶ ושני ^6,7 מערכת משאבת איור 3 ממחישים כל של עליות להגדיר מערכת אלה CF.

מערכת פיצול זרימה

אנימערכת מפוצלת זרימה נה (איור 3 א) את זרימת משאבת מוביל ההזרקה היא מזרק מראש פיצול באמצעות T-piece נפח אפס מת, שבו זרם זרם אחד השלב נייד מחובר ההזרקה, אשר מחוברת אז אל הנמל המרכזי של סוף-הולם מפרצון של הטור. נחל הזרם השני של שלב נייד על ידי-עובר מזרק והוא מחובר ליציאת הפריפריה על המפרצון של הטור. במהלך קריעת הזרימה, אחוז זרם התזרים מותאם 40:60 (מרכז: היקפי) לפני הקווים המחוברים בטור, כלומר, מן המזרק ל'מרכז לשאוב כדי היקפי.

מערכת המשאבה השנייה

עמודת CF דורשת שני זרמי זרימה ההולמת סוף כניסת הטור. בהתאם לסוג של autosampler / מזרק של מכשיר HPLC, מפוצל הזרימה להגדיר אינו אפשרי, ולכן CF אז יכול להיות מושג באמצעות 2 משאבות (איור 3 ב ²¹⁾. משאבת מוקצה ומחוברת גם הנמל המרכזי או ציוד היקפי ואת קצב הזרימה מוגדר לייצג 40% של זרימה עבור נמל מרכזי ו -60% עבור יציאה היקפית. לדוגמא, אם קצב הזרימה הכולל הוא 1.0 מיליליטר דקות ^-1, את קצב זרימת משאבה המרכזי מוגדר 0.4 מיליליטר דקות ^-1 ואת המשאבה ההיקפית מוגדרת 0.6 מיליליטר דקות ^-1.

הבחירה של איזה מצב של המבצע היא תלויה במידה רבה על מכשור HPLC ומצב chromatographic של המבצע. לדוגמה בחלק autosamplers שינוי בלחץ בין מדגם עמדת עומס המדגם להזריק מיקום עשוי להתרחש שיבוש ביחס פיצול הזרימה וכך במקרה זה משאבה כפול להגדיר יהיה מומלץ עבור ביצועי CF אופטימליים. לא משנה את מערכת המסירה הממסה להגדיר שנבחרה עבור כניסת טור CF, אופטימיזציה לשקע CF נשארה זהה. הנמל המרכזי לשקע של הטור CF מצורף גלאי אולטרא סגול-גלוי (UV-Vis) עם smalפן נפח אפשרי של צינורות כדי למזער את ההשפעות של נפח מת שלאחר העמודה. מאז, עמודות CF לחקות בטורים צרים נישאים, נפח מת בין לשקע העמודה ואת הגלאים יש השלכות שלילי על הביצועים הפרדה בעמודת CF. זה קריטי כדי להבטיח את הכמות הקטנה ביותר של נפח של צינורות בין הנמל המרכזי ואת גלאי UV-Vis כדי למזער את ההשפעות של נפח מת כגון הרחבת להקה, אובדן יעיל ורגיש. לפיכך, השימוש של צינורות נישאים צרים (0.1 מ"מ id) מומלץ לאפשר התאמות לחץ בקלות מבלי להוסיף נפח מת הולם. Tubing מצורף גם ליציאה ההיקפית וביים לבזבז. עם היציאה של טור CF, יחס הפילוח יכול להיות מותאם לכל יחס שמתאים לצורך האנליסט. כאשר CF id 4.6 מ"מ משמש, למשל, היא לעתים קרובות נוח להגדיר יחס כמו גם 43:57 או 21:79 (מרכז: היקפי) לחקות טור id 'וירטואלי' 3.0 מ"מ או 2.1 מ"מ טור id,בכבוד. ככה ביצועי ההפרדה הוא ספסל מסומן בקלות. יחס הפילוח נמדד במשקל בסך של זרימת יציאה מהמגלה המחובר ליציאה המרכזית וזרימת יציאה לנמל הפריפריה על פני תקופת זמן. תזרים האחוז דרך כל יציאה אז יכול להיות נחוש היחסים יכולים להיות מותאם על ידי שינוי האורך של צינור מחובר או באמצעות צינורות בעל קוטר פנימי שונה (id).

פרוטוקול וידאו זה מפרט את נהלי התפעול ואופטימיזציה של טור CF לביצועי chromatographic משופר.

פרוטוקול

זהירות: עיין גיליונות נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל החומרים ריאגנטים לפני השימוש (כלומר, MSDS עבור מתנול). להבטיח את השימוש של כל נהלי הבטיחות המתאימים בעת טיפול ממסים בעל ביצועים גבוהים eluent הנוזל כרומטוגרפיה (HPLC). ודא שימוש נאות של בקרות הנדסה של HPLC, מכשור איזון גלאי אנליטיים, ולהבטיח את השימוש בציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, ונעליים סגורות).

הערה: פרוטוקול זה מכיל הוראות כיצד להשתמש טור CF על מערכת HPLC מצמידה עם גלאי UV-Vis. הפרוטוקול נכתב בהנחה לקורא יש ידע בסיסי וניסיון כרומטוגרפיה.

התקנת 1. HPLC Instrument

הערה: סעיף זה ניתן לשנות כדי להתאים לצרכי האנליסטים, כלומר, בחירה של ממסים, גל גלאי וספיקה כימתאימים המדגם של עניין.

1. הכן את מכשיר HPLC עם מי ultrapure 100% (למשל, מי מילי- Q) עבור הקו A ו- מתנול 100% עבור הקו B כשלב הנייד ולטהר משאבות על פי דרישת יצרן.
2. הגדר את גלאי UV-Vis 254 ננומטר.
3. בחר כיוון מצב פיצול זרימה מראש הזרקת ההגדרה או הגדרת זרימת משאבה כפולה. עבור מצב זרימת הפיצול המשך לשלב 2, עבור מצב המשאבה הכפול והמשך לשלב 3.

הגדרת מערכת פיצול זרימת 2.

1. ניתק את קו המשאבה מן שסתום המזרק של סמפלר האוטומטי.
2. צרף חולצת חתיכת לקו המשאבה.
3. צרף חתיכת 15 סנטימטר של צינורות מזהים 0.13 מ"מ כל יציאה של חלקי T.
4. חבר צינור אחד מן מקשת T כדי מזרק שסתום של סמפלר האוטומטי.
5. הגדר את המשאבה 1.0 מ"ל דקות ^-1.
6. לפני חיבור קווי משאבה אל המפרצון של טור CF, לכוון את יחס הפילוח של הזרימה עד 40%: 6 0% (קו מרכז: קו היקפי) כדלקמן בשלב 2.7.
7. כוונון של יחס כניסת CF על מערכת זרימת פיצול
   1. למדוד את המסה של שני כלי אוסף ריק באמצעות איזון אנליטיים תווית כלי איסוף מרכזי אחד ואת היקפיים אחר אחד (אחד עבור הקו מן סמפלר האוטומטי למרכז נמל ואחד עבור הקו מנמל T-piece אל פריפריה) .
   2. עבור 1.0 דקות, לאסוף את השלב נייד יציאת מקו מאגף המזרק (בנקודה שתתחבר לעמודה) לתוך כלי האיסוף, שמסתו נמדדה 2.7.1.
   3. לשקול מחדש את כלי האוסף בסולם אנליטיים לקבוע את המסה של שלב נייד שנאסף.
   4. חזור על שלבי 2.7.2 עד 2.7.3 עבור eluent יציאת הקו מ T-החתיכה כי הוא להיות מחובר ליציאת הפריפריה.
   5. לקבוע את אחוז זרימה (מ"ל דקות ^-1) הנובעת מכל קו זרימה פי המשוואות הבאות:
      1 "src =" / files / ftp_upload / 53,471 / 53471eq1.jpg "/>
   6. התאם את יחס תזרים 40%: 60% (± 2%) (שורה מתוך מזרק לנמל המרכזי: קו מ- T-piece לנמל היקפי). אם הקו מן המזרק לאחוז זרימת נמל המרכזית הוא מעל 40%, להגדיל את הירידה בלחץ על ידי הפחתת הקוטר הפנימי של הצינורות, או הגדלת אורכו. אם שורה מתוך מזרק אחוז זרימת הנמל המרכזי הוא מתחת ל -40%, להגדיל קוטר פנימי של הצינור או להקטין את אורך של הצינור.
   7. לאחר יחסי הזרימה מכוונים להפוך את המשאבה לזרום.
   8. חבר את הקו מן המזרק לנמל המרכזי של כניסת הטור והקו מן מקשת T לנמל הפריפריה של כניסת הטור.
   9. לאט להגביר את קצב הזרימה 1.0 מ"ל דקות ^-1 בבית ב 'קו 100%
   10. לאזן את העמודה (4.6 מ"מ id x 100 מ"מ אורך) בכך שהוא מאפשר100% מתנול (קו B) שלב הנייד לזרום דרך העמודה ב 1.0 מ"ל דקות ^-1 למשך 10 דקות. הפעם ישתנה על פי המידות של עמודות אחרות המשתמש רשאי להעסיק.
   11. עבור כוונון של משקע CF עבור אל שלב 4. "כוונון של זרימת לשקע CF '.

3. הגדרת מערכת המשאבה הכפולה

1. חבר את משאבת מערכת HPLC כדי ההזרקה ולאחר מכן חבר את הקו מן המזרק לנמל הכניסה המרכזי של הטור.
2. חבר את המשאבה הנוספת ישירות ליציאת היקפי כניסת הטור. שים לב משאבת השני זה על ידי-עובר ההזרקה.
3. כבש את קצב הזרימה של המשאבה מערכת המחובר ליציאת מרכזי 0.4 מ"ל דקות ^-1 (נציג של 40% של flowrate סך של 1.0 מ"ל min ^-1) ב -100 מתנול% (קו B).
4. במקביל כמו שלב 3.3, כבש את קצב הזרימה של המשאבה ההיקפית 0.6 מיליליטר דקות ^-1 (נציג של 60% של flowrate הכולל של1.0 מ"ל דקות ^-1) ב -100 מתנול% (קו B).
5. לאזן את העמודה (4.6 מ"מ id x 100 מ"מ אורך) בכך שהוא מאפשר מתנול 100% (קו B) שלב הנייד לזרום דרך העמודה ב 1.0 מ"ל דקות ^-1 למשך 10 דקות. הפעם ישתנה על פי המידות של עמודות אחרות המשתמש רשאי להעסיק.
6. עבור כוונון של משקע CF עבור אל שלב 4. "כוונון של זרימת לשקע CF '.

כוונון 4. של CF Outlet זרימה

1. חברו את יציאת מרכזי גלאי UV-Vis באמצעות פיסת 15 ס"מ של צינורות מזהה 0.13 מ"מ.
2. חבר פיסת 15 סנטימטר של צינורות מזהים 0.13 מ"מ פתח היציאה ההיקפית של טור CF.
3. לשקול את המסה של שני כלי אוסף ריק על איזון אנליטיים תווית אחת מרכזית כלי ואת היקפיים אחרים.
4. עבור 1.0 דקות, לאסוף את השלב נייד יציאה ממגלה UV-Vis (לזרם המרכזי) לתוך תווית כלי איסוף המרכזית, שמסתו נמדדה 4.2.
5. לשקול מחדש את כלי האוסף המכיל את eluent שנאסף על הסקאלה אנליטיים לקבוע את המסה של שלב נייד שנאסף.
6. חזור על שלבי 4.4 כדי 4.5 eluent יציאת הקו מנמל לשקע הפריפריה.
7. לקבוע את אחוז זרימה נובע מכל קו זרימה פי המשוואות הבאות:
   
8. התאם את יחס תזרים ל -21%: 79% (± 2%) (זרימת לשקע המרכזי מפני UV-Vis: זרימת לשקע היקפי מקו). אם אחוז לזרם המרכזי מ- UV-Vis הוא מעל 21%, להגדיל את הירידה בלחץ על ידי הפחתת הקוטר הפנימי של הצינור המחובר אל היציאה של גלאי UV-Vis, או הגדלת אורכו. אם אחוז לזרם המרכזי מ- UV-Vis הוא מתחת 21%, להגדיל הקוטר הפנימי של צינור המחובר אל היציאה של גלאי UV-Vis, או להקטין את אורך של הצינור. בכל פעם באורך של צינורות שונתה, חזורצעדים 4.3 ל -4.7 ילדים.
   הערה: עמודת CF במצב id 'ווירטואלי' 2.1 מ"מ היא מוכנה לניתוח.

תוצאות

עמודות AFT פותחו בעזרת עיצוב frit מיוחד (איור 1) ב-אבזרי קצה טור multiport להתגבר על ההטרוגניות מיטת העמודה ולשפר את ביצועי הפרדה. מחקר בין-מעבדה על הביצועים הפרדה עמודות כרומטוגרפיה CF (איור 2) בוצע עם מערכת משאבה כפולה להגדיר (איור 3 ב) כמפורט בסעיף 3 של פרוטוקול זה ^23. תערובת מבחן שלושה רכיב נותחה תחת באמצעות id 'הווירטואלי' 2.1 מ"מ שבו 21% של הזרם המרכזי לשקע של טור CF נוהלו אל הגלאי...

דיון

מחקר זה כלל בניתוח ומעבדת היתר של עמודות כרומטוגרפיה CF לבדוק את הביצועים אנליטי במונחים של יעילות ורגישה. העמודה CF הוקם עם מערכת שאיבה כפולה כמפורט בסעיף '3. מערכת משאבה כפולה להגדיר 'כדי להשיג יחס תזרים של 40:60 (מרכז: היקפי) על כניסת טור CF. 40:60 (מרכז: היקפי) יחס התזרים הושג על ידי קביעת קצב הזרימה של כל משאבת לערך מייצג 40% ו -60% של קצב הזרימה הכולל, בהתאמה. שקע טור CF היה מכוון טור "וירטואלי" עם id של 2.1 מ"מ על ידי ביצוע ההליך המתואר בסעיף "4....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכשיר
משאבה			נדרשת אם יש להשתמש במערכת CF של 2 משאבות.
זרימת וילון עמוד HPLC	תרמו פישר מדעי	לא מוגדר	בקרוב להיות ממוסחר
מתנול	כל מותג		HPLC כיתה
PEEK צינורות כל	מותג		אורכים שונים ותעודת זהות
חותך צינור הצצה	כל מותג
איזון סולם אנליטי	כל מותג
עצור שעון	כל מותג
כלי איסוף Eluent	כל בקבוקוני	דגימה של מותג 1-2 מ"ל יכולים לשמש ככלי איסוף