מאמר שיטה

כמו תא גזע

DOI:

10.3791/53474

⸱

2 בפברואר 2016

1Institut Curie, 2UMR 3387, CNRS, 3PSL Research University, 4Université Paris-Sud

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת התוכניות הגנטיות העומדות בבסיס ההתפתחות העצבית היא מטרה חשובה של ביולוגיה התפתחותית ותאי גזע. בבלסטולה הדו-חיים, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים. ניתן לבודד תאים אלה, ולתכנת אותם ליצור רקמות שונות באמצעות מניפולציה של ביטוי גנים או אינדוקציה על ידי מורפוגנים. בכתב יד זה מתוארים פרוטוקולים לשימוש באקספלנטים של Xenopus laevis blastocoel explants כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור רכישת גורל, התנהגויות נדידת תאים ותכונות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים. ניתן לגדל את האקספלנטים של גג הבלסטוקואל במדיום מוגדר ללא סרום ולהשתיל אותם בעוברים מארחים. השתלה זו בעובר מאפשרת לחקור את מחויבות השושלת ארוכת הטווח, התכונות האינדוקטיביות והתנהגות התאים המושתלים in vivo. ניתן לנצל בדיקות אלה כדי לחקור מנגנונים מולקולריים, תהליכים תאיים ורשתות ויסות גנים העומדים בבסיס ההתפתחות העצבית. בהקשר של רפואה רגנרטיבית, בדיקות אלו מספקות אמצעי ליצירת סוגי תאים שמקורם בעצבים במבחנה שניתן להשתמש בהם בבדיקת תרופות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים של בעלי החוליות עולה מהצלחת העצבית כשכבת אחידה של תאי neuroepithelial. הבנה כיצד תוכניות התפתחותיות מושרות, מקודדות, והוקמו במהלך אזורית של הצלחת העצבית היא, כיום, מטרה עיקרית בביולוגיה התפתחותית. בהשוואה למערכות אחרות, עובר Xenopus ניסוי נוח הוא מודל של בחירה לניתוח שלבים מוקדמים של התפתחות עצבית 1,2. זה קל להשיג מספר גדול של עוברים, ופיתוח חיצוני נותן גישה לצעדים הראשונים של neurulation 3. כלים רבים זמינים כדי לתפעל באופן ניסיוני Xenopus laevis (laevis X.) התפתחות עוברית. מיקרו הזרקה של mRNAs או morpholinos (MO), כוללים שיטות פעולה מושרה, יחד עם כלים ביוכימיים ותרופתיים, מאפשר מבוקר רווח של פונקציה (GOF) ואובדן התפקוד (LOF) ושינוי ספציפי של מסלולי איתות 4,5. בלההאאקטודרם גג stocoel, הממוקם סביב קוטב החיה של blastula, או עובר gastrula בשלב מוקדם מאוד, ומכונה "בעלי החיים קאפ '(AC), הוא מקור לתאי pluripotent שניתן לתכנת על ידי מניפולציה של ביטוי גנים לפני explants הכנה. בכתב יד זה הם פרוטוקולים מפורטים לשימוש X. explants laevis AC לבדוק במבחנה ובמנגנונים מולקולריים vivo ותהליכים תאיים התפתחות עצבית בסיסית.

טכניקה מוצגת, המאפשרת תצפית יפה של דפוסי ביטוי גנים בצינור עצבי ראשן צפרדעים, צעד ראשוני בזיהוי רמזי נחישות גורל. בעוד התצפית של רקמות רכוב שטוחות נפוצה במחקר של עובר חומוס 6, זה לא תואר כראוי בצפרדעים. מניפולציה של ביטוי גנים על ידי הזרקת mRNA או MO סינטטיים ללסטומרים של 2 או 4 עובר שלב תא מאפשרת תכנות של ACexplants 4. לדוגמא עיכוב של מסלול חלבון העצם המוךפו"גנטי (BMP) על ידי ביטוי של אנטי-BMP גורם הבחור!, נותן זהות עצבית לתאי AC 3. הפרוטוקול מפורט לביצוע חשיפה מבוקר זמן ומקומי של explants AC לרמזים חיצוניים באמצעות מגע ישיר עם חרוז שרף אניוני. לבסוף טכניקה מתוארת לבדיקת תכונות ההתפתחותי של אבות עצביים in vivo על ידי השתלה של explants המעורב הוכן מהתאים נפרדים מתוכנת ניתקו וקשורים-מחדש.

עובר הצפרדע הוא מודל רב עוצמה כדי לחקור את ההתפתחות עצבית חוליות מוקדמות. שילוב מניפולציה של ביטוי גנים לexplant תרבויות במבחנה מספק מידע חשוב בחקר האזורי neuroepithelium, התפשטות, והמורפוגנזה 7-12. תכנות של explants AC מותר פיתוח של לב פונקציונלי vivo לשעבר 13,14. השימוששל explant השתלת 15 הובילו לזיהוי של בורר תעתיק המינימלי התרמה תכנית בידול הרכס העצבי 16. Limitans Zona intrathalamica (ZLI) הוא מרכז איתות שמפריש סוניק קיפוד (ששש) כדי לשלוט על הצמיחה ואזורית של המוח הקדמי הזנב. כאשר נחשפו ברציפות שלשש, תאי neuroepithelial coexpressing גני שלושה שעתוק גורם - כמו-barH homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) וIroquois-3 (irx3) - רכישת שני מאפיינים של תא ZLI: הסמכות ל להביע את ששש, ואת היכולת להפריד מתאי צלחת עצביים קדמי. כמערכת מודל, האינדוקציה של גורל ZLI לתאי neuroepithelial יוצג 8.

פרוטוקולים אלה מכוונים למתן וכלים פשוטים, זולים, יעילים לביולוגים התפתחותיים וחוקרים אחרים לחקור את MEC הבסיסיhanisms של התנהגויות תא עצביות מרכזיות. פרוטוקולים אלה הם מגוונים מאוד ומאפשרים החקירה של מגוון גדול של רמזי נחישות עצביים חיצוניים ופנימיים. זה מאפשר לטווח ארוך בניתוח vivo של מחויבות עצביות שושלת, אינטראקציות אינדוקטיביים והתנהגויות תא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים לעמוד ברגולציה לאומית ואירופית על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות ועם עקרונות שנקבעו בעולם של החלפה, הפחתה ועידון.

1. שטוח הרכבה של Xenopus laevis Tube ראשנים קדמי העצבי לאחר Whole-Mount הכלאה באתר

  1. להשיג X. laevis עוברים על פי נהלים קבועים 4 וגילם עד שהם מגיעים neurula שלב 26 ומעלה (לפי טבלה התפתחותית Nieuwkoop ופאבר 17.
  2. X. תקן laevis ראשנים על ידי דוגריהם בפתרון של paraformaldehyde 4% (PFA). הרוק ולסובב את העוברים בבקבוקון זכוכית 2 מיליליטר, 1 עד 1.5 שעות ב RT לשלב 26 לביים 38 עוברים, שעת 2 ​​ב RT עבור עוברים בשלבים מאוחר יותר.
    זהירות: PFA הוא רעיל על ידי מגע ומסרטן חשוד. צריך לטפל זה מתחת למכסת מנוע.
    הערה: X. אחת הגוזלים laevis הואבדרך כלל קבוע בבקבוקון זכוכית 2 מיליליטר אבל בקבוקון זכוכית גדול יותר ניתן להשתמש.
  3. לשטוף את העוברים באותו הבקבוקון באמצעות 1x PBS עם 0.1% Tween (PBT), 3 דקות ב RT, פעמיים.
    הערה: אם תציינו אחר PBS המשמש הוא עם או בלי סידן ומגנזיום.
  4. מייבש את העוברים במתנול 100% (MeOH) לפחות 12 שעות בRT באותו הבקבוקון. לשנות את MeOH 100% לפחות פעמיים מתחת למכסת המנוע באמצעות micropipette פלסטיק.
    הערה: MeOH הופך מעט צהוב כשומנים מומסים בזה. זהירות MeOH היא רעילה על ידי שאיפה וצריכה לטפל מתחת למכסת מנוע.
  5. רעננות העוברים משתמשים באותו הבקבוקון דרך סדרה מדורגת של אמבטיות MeOH: 75% MeOH ב PBS, MeOH 50% ב- PBS, 25% MeOH ב PBS, PBS פעמיים, כל דקות האמבטיה 5-10 ב RT. פתרונות MeOH משתנים מתחת למכסת המנוע באמצעות micropipette פלסטיק.
  6. בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את העובר להיות גזור ב60 מ"מ צלחת פטרי המלא לראש עם PBT. שימוש בטיפול שני מלקחיים עדיניםלהסיר באופן מלא את העיניים על ידי החדרת מלקחיים עדינים אחד בין העיניים והצינור העצבי, ברמה של הגבעול האופטי. לנתק את העיניים מהצינור העצבי. להציג בזהירות את המלקחיים מתחת להאאקטודרם שמעל בצינור העצבי. עם טיפול, לקלף את האאקטודרם מתחיל מאחורי הראש וזורקים אותו.
  7. בצע ISH כפול או בודד באמצעות digoxigenin שכותרתו או בדיקות שכותרתו והעמסת כמו בעבר תיארו 18,19.
  8. לאחר ISH להעביר את העוברים בצלחת פטרי חדש 60 מ"מ המלא עד למעלה עם PBT בעזרת פיפטה פלסטיק.
  9. בעזרת מלקחיים בסדר לנתק בזהירות את הצינור העצבי משאר העובר. בשלב זה, בצינור העצבי הקדמי מפריד מהצינור העצבי האחורי. לנתק בזהירות חלקים הנותרים של האאקטודרם שמעל הצינור העצבי, notochord שמצורף להלן בצינור העצבי, שלפוחית ​​otic וחלקים הנותרים של המזודרם באופן רופף. ודא שהצינור העצבי הוא נטול כל נספחיםבשלב זה.
    הערה: כדי למנוע נזק לצינור העצבי לבצע כל העברה העצבית צינור / עובר עם טפטפת העברת פלסטיק או micropipette במידת צורך עם חתך קצה בסופו. הקוטר של סוף הקצה מותאם לגודל של הצינור העצבי.
  10. העבר את הצינור העצבי גזור (ראה שלב פתק 1.9) בצינור 1.5 מיליליטר מלא גליצרול 50% בדילול מלא PBS. חכה עד שהצינורות העצביים נפלו לתחתית פתרון גליצרול, בדרך כלל O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
  11. הסר את הפתרון של 50% גליצרול / PBS באמצעות micropipette P1000 ולהוסיף באותו צינור 1.5 מיליליטר פתרון של גליצרול / PBS 90% באמצעות micropipette P1000. חכה עד שהצינורות העצביים ליפול לתחתית 90% גליצרול / פתרון PBS, בדרך כלל O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: לאחסון לטווח ארוך, להשתמש 90% גליצרול / PBS בתוספת אנטיביוטיקה כדי למנוע התפתחות חיידקים.
  12. העברת הצינורות העצביים על צלחת זכוכית, או שקופיות מיקרוסקופ עם טפטפת העברת פלסטיק.
  13. דיסכת הצינורות העצביים לאורך הגב וקווי אמצע הגחון באמצעות מחטי טונגסטן. במהלך שלב שהצינורות העצביים נשמרים בגליצרול% 90 / PBS.
  14. הר שני הצדדים של הצינור העצבי בגליצרול / PBS 90% באמצעות טבעות חיזוק מכוסות coverslip זכוכית.
  15. תקן coverslips עם לכה ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.

2. בעלי החיים קאפ Explants אינדוקציה באמצעות חרוזים אניון Exchange שרף

  1. העברת חרוזים שרף אניוני 100 μl לתוך צינור 2 מיליליטר באמצעות micropipette P1000. שטוף את החרוזים לפחות חמש פעמים ברציפות עם מים מזוקקים סטריליים. לאפשר לחרוזים משקעים בחלק התחתון של הצינור ולהחליף את המים מזוקקים סטריליים באמצעות micropipette P1000. אל תיגעו בחרוזים.
  2. בואו חרוזים לספוג O / N בצינור 2 מיליליטר מלא במים מזוקקים סטריליים עם סרום שור אלבומין (BSA) (10 מ"ג / מיליליטר) ב 4 ° C.
  3. שתי שעות לפני איסוף המזגנים, חצי מקום של חרוזים ל1.5 מיליליטר חדשצינור באמצעות micropipette P1000. החלף את המים מזוקקים סטריליים עם 500 μl של המדיום המכיל את המולקולה להיבדק לפוטנציאל אינדוקטיביים, או ידוע לגרום גורל ספציפי. שמור את החצי השני של חרוזים, כפי שהם ישמשו כביקורת שלילית.
  4. דגירה חרוזים על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות.
  5. לבצע את כל השלבים הבאים מתחת לסטראו ולבצע את כל העברת AC עם micropipette.
  6. העבר את עוברי gastrula מוקדם מאוד blastula או לPBS עם סידן ומגנזיום השלים עם BSA 0.2% בעזרת פיפטה העברה פלסטיק.
    הערה: עוברים מתפתחים בשלבי blastula הישג C וgastrula ° 12 בשעה 20 עד 24.
  7. הסר קרום vitelline של העובר באמצעות מלקחיים כפי שתואר קודם לכן 20. תקן את העובר עם מלקחיים. לצבוט את קרום vitelline עם הצד של מלקחיים האחרים. מחזיק את הקרום, לקלף אותו לאט את העובר. לבצע הליך זה על האוורורצד tral (צמחי) של העובר. אין לגרום נזק לצד בעלי החיים של העובר.
  8. לבודד מזגנים קטנים כפי שתואר קודם לכן 21. מוט בעלי החיים הוא חלק פיגמנט של העובר. מלקחיים עדינים באמצעות לגזור ריבוע קטן של רקמה מקוטב בעלי החיים. רקמת AC מכילה רק תאי ectodermal. ודא שהרקמה היא בעובי אחיד. אם לא, להסיר את AC מהניתוח.
  9. מניחים כל AC בצלחות multiwell Terasaki ב0.5x השתנו מלוח (MBS) של בארת '4. מניחים את AC להיטב עם הצד של בעלי החיים פיגמנט למטה, במגע עם התחתית העגולה של הבאר.
    הערה: טפטפות ציפוי עם פתרון BSA 0.1% מונעת ההידבקות של חתיכות קטנות של רקמת דבק לפלסטיק.
  10. הנח חרוז אחד בכל כובע באמצעות P20 micropipette. במידת הצורך, להשתמש במלקחיים למקום בזהירות את חרוז במרכז הכובע.
    הערה: כאשר ספוג במדיום מותנה, חרוזים צבעוניים בורוד. בחר רוב שיתוףחרוזים lored.
  11. לדגור על RT (18 עד 22 מעלות צלזיוס) במשך 6 שעות בלי לזוז צלחת multiwell Terasaki. חרוז מקלות AC בפחות מ -2 שעות.
  12. מניחים את צלחת multiwell Terasaki על גבי ניירות ספוגים במים. מכסה את הצלחת עם מיכל פלסטיק.
    הערה: זה 'תא לחות' מונעת אידוי מוקדם של הבארות.
  13. תרבות המזגנים ב0.5x MBS או 3/4 NAM (ראו שלב 4.1) בתא לחות 15-20 מעלות צלזיוס עד עוברי האחים הגיעו לשלב הנכון כדי לבדוק את ההשפעה של הגורם שלך.
  14. לתקן את המזגנים לשעה 1 במוכן טרי PFA 4%. מייבש את המזגנים בMeOH 100% כפי שתואר (שלב 1.4) בעבר.

תא דיסוציאציה 3. בעלי החיים קאפ וצירוף-מחדש לפני השתלה בXenopus laevis Neurula

  1. צלחות פטרי מעיל (60 מ"מ) או 12 צלחות בארות עם agarose 3% במים סטריליים או בPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף מספיק כדי לכסות את agarose בottom של צלחת פטרי או כן. טרום חם הצלחות ב RT (C ° 18-22). לחלופין, לאחסן צלחות לכמה ימים על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע התייבשות.
  2. הכן-סידן חופשי המלוח של Holtfreter (60 מ"מ NaCl, 0.7 מ"מ KCl, 4.6 מ"מ HEPES, BSA 0.1% (A-7888 Sigma pH 7.6)) והמלוח של Holtfreter (60 מ"מ NaCl, 0.7 מ"מ KCl, 0.9 מ"מ CaCl 2, 4.6 מ"מ HEPES, pH 0.1% BSA 7.6) 5. הערה: הפתרון של CaCl 2 לא יכולה להיות autoclaved.
  3. מלא היטב לראש עם מי מלח של סידן ללא Holtfreter מצופה agarose.
  4. הכן blastula או עוברי gastrula מוקדם מאוד לבודד המזגנים שלהם כפי שתואר לעיל (שלבים 2.5-2.7).
  5. לבודד לפחות 15 או עד 30, מזגנים קטנים 21. מלקחיים עדינים באמצעות לגזור ריבוע קטן של רקמה מקוטב בעלי החיים. רקמת AC מכילה רק תאי ectodermal ולכן עובי אחיד. אם לא, להסיר את AC מהניתוח.
    הערה: מוט בעלי החיים הוא אמבריחלק פיגמנט של o.
  6. העבר את המזגנים לagarose מצופה מילא היטב לראש עם מי מלח של Holtfreter ללא סידן. מניחים את המזגנים עם צד פיגמנט כלפי מעלה.
    הערה: תהליך הניתוק מתחיל במהירות במלוחה של Holtfreter ללא סידן.
  7. המתן מספר דקות לתאים להתחיל dissociating. שים לב זה באמצעות פירוק של הרקמות. בעזרת מלקחיים בסדר, להפריד את שכבת פיגמנט משאר AC וזורקים אותם עם P20 micropipette. תהליך ניתוק תא שלם מציין הפרדה של תאים מזה.
    הערה: אחד או שתי שכבות פיגמנט ניתן להשאיר בתוך explant מצטבר מחדש כדי לסייע להדמיה במהלך השתלה.
  8. מרכז את התאים באמצעות תנועות סיבוביות של הצלחת. באמצעות micropipette P1000 להסיר בזהירות רבה כבינוני ככל האפשר. היזהר שלא לגעת בתאים.
  9. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת מלח של Holtfreter עם סידן ול. העבר את המזגנים ניתקולתוך צינור 1.5 מיליליטר.
    הערה: 2 מיליליטר צינורות לא ניתן להשתמש בשל התחתית העגולה שלהם.
  10. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה, 5 דקות במהירות מקסימלית של 2,000 סל"ד צנטריפוגה ספסל (500 XG). מוציא בזהירות את supernatant עם micropipette P1000.
  11. הוסף לתאים ניתקו 20 μl של תמיסת מלח של Holtfreter עם סידן (60 מ"מ NaCl, 0.7 מ"מ KCl, 0.9 מ"מ CaCl 2, 4.6 מ"מ HEPES, BSA 0.1% (7888-Sigma pH 7.6) 5.
  12. שמור המזגנים ניתקו, 3 עד 6 שעות על RT (18-22 ° C).
    הערה: זה זמן דרוש לתאים מחדש המצרפי. מחדש הצבירה גלויה כמו התאים בצורת כדור קטן בחלק התחתון של הצינור.
  13. לנתק את explant בזהירות מהחלק התחתון של הצינור על ידי הוספת 1 מיליליטר של 0.5x MBS או של 1 מיליליטר של 3/4 NAM (ראה שלב 4.1). העבר את explant בצלחת מצופה האו"ם בעזרת פיפטה העברה פלסטיק.
  14. שלב explants באמצעות האחים שליטתם. לאנטיביוטיקה שימוש תרבות לטווח ארוך: kanamyCIN (50 מיקרוגרם / מיליליטר), אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וgentamycine (50 מיקרוגרם / מיליליטר).

4. הארכת בעלי החיים Caps Explants בצלחת עצבית של X. העובר laevis

  1. הכן 3/4 NAM (110 מ"מ NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ Ca (NO 3) 2, 1 מ"מ MgSO 4, 0.1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ NaHCO 3, 0.2X PBS, 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin). אל תשמרו ליותר משבוע 1 לנתיחה ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. NAM המבוגר יכול לשמש להכנת מאכלים לנתיחה מצופה agarose (להלן).
  2. צלחות פטרי מעיל (60 מ"מ) עם agarose 3% ב3/4 NAM לתוכו חורים קטנים שנעשו תוך שימוש בתבנית סיליקון, או הכיסוי של מחבט טניס שולחן.
    הערה: agarose מכסה את החלק התחתון של צלחת פטרי. השאר קצת מרחב כדי שצלחת פטרי למלא עם 3/4 NAM. לחלופין לעשות מנות נתיחה עם פלסטלינה שאינו ייבוש. בתוך החימר, לסחוט את העוברים מעט במהלך הליך הנתיחה. לחפור חורים קטנים בagarose באמצעות מלקחיים מעוגלים זה "צלחת לנתיחה 'עוזר להחזיק את העוברים במהלך הליך הנתיחה.
  3. לאסוף כלים לנתיחה: טפטפות העברת פלסטיק, "סכין גבה" (שנעשה עם שיער גבה המשובץ בפרפין בקצה של זכוכית פיפטה פסטר) 22, שני מלקחיים לנתיחה קנס, micropipette P1000 וטיפים, stereosmicroscope עם הגדלה 8-40X, מקור אור בהיר עם מדריכי סיבים אופטיים. שמור את כל הכלים לנתח נקיים; לאחר כל ניסוי, לשטוף אותם פעמיים עם מים מזוקקים, פעם אחת עם 100% אתנול ולתת יבש. אחסן הרחק מאבק ואם יש צורך החיטוי הכלים לנתח מתכת.
  4. בוא X. מצטבר מחדש ACS (פרוטוקול 3), ואחיהם ניתקו ו עוברי laevis לפתח עד שהם מגיעים שלב 13 (neurula) בהתאם לטבלה התפתחותית Nieuwkoop ופאבר 17. להשתלה בתוך שלב הצלחת העצבי 13 לביים 15 עוברים משמשים.
  5. לבצע את כלהשלבים הבאים בסטראו.
  6. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, להעביר את העוברים לתוך PBS עם סידן ומגנזיום השלים עם BSA 0.2%. הסר קרום vitelline של העובר כפי שתואר קודם לכן 20. תקן את העובר עם מלקחיים. לצבוט את קרום vitelline עם הצד של מלקחיים האחרים. מחזיק את הקרום בחוזקה, לאט לקלף אותו מהעובר.
    הערה: האם הליך זה בצד הגחון (הצמחי) של העובר. אין לגרום נזק לעוברי צלחת עצבית. אם עובר ניזוק במהלך שלב הסרת קרום vitelline, להעביר את העוברים לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ המכילה 3/4 NAM בעזרת פיפטה העברה פלסטיק ולחכות 15 דקות, זמן מספיק ללהתרחש תהליך הריפוי.
  7. מלא את הצלחת לנתיחה לראש עם NAM 3/4 הטרי.
  8. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, להעביר את העוברים ללא קרום vitelline שלהם לתוך הצלחת לנתיחה. מניחים את העוברים צד גב להבארות. במהלך תהליך ההעברה אינו מאפשר את העובר להיכנס במגע עם ממשק האוויר הנוזלי מאז X. laevis הוא lysed על ידי מתח פנים.
  9. העבר את explant AC להיות מורכבים לתוך הצלחת לנתיחה בעזרת פיפטה העברה פלסטיק או micropipette P1000. ברגע שפיפטה היא בתוך הנוזל, מאפשר explants לשקוע לאט למטה על ידי כוח הכבידה, או לדחוף בעדינות רבה.
  10. שמור את העוברים עם מלקחיים מעוגלים. עם סכין הגבה לעשות חתך לתוך הצלחת העצבית שבו אתה מתכוון להשתיל פיסה של explant שלך.
    הערה: בשלב 14 הכיפוף הקדמי של הצלחת העצבית יכול להיות שימוש כנקודת ציון, הוא מסמן את הטריטוריה diencephalon (איור 4).
  11. לגזור חתיכה קטנה של neuroepithelium, באמצעות מלקחיים מעוגלים וסכין גבה. חותכים חתיכה קטנה של explant עם סכין הגבה.
    הערה: פיסת explant צריכה להיות בערך באותו גודל וצורה כמו אזור ablated neuroepithelium.
  12. מניחים את פיסת explant לתוך חתך neuroepithelium באמצעות סכין הגבה ומלקחיים בסדר. ודא שexplant מהירות מייחס לעובר.
  13. לחלופין במקום חתיכת הזכוכית coverslip על העובר והגימור לשמור את השתל במקום. כדי לעשות זאת, לחתוך coverslip זכוכית עדין לחתיכות קטנות מאוד באמצעות מלקחיים גסים. ודא שהגודל הוא כ 1.5 מ"מ 2. לטבול את החתיכות לתוך צלחת פטרי המכילה 3/4 מלקחיים באמצעות NAM או PBS. בחר חתיכת זכוכית גדולה יותר מהעובר כדי למנוע פגיעה בו. העובר יהיה קצת שטוח.
  14. חכה לפחות 30 דקות בלי לזוז, או רק להזיז את הצלחת לנתח בעדינות. בואו העובר להתאושש במשך 30 דקות לשעה 2 ולהסיר בעדינות את coverslip במידת צורך. פיפטה בזהירות את העוברים המורכבים לתוך צלחת נקייה מלאה ב3/4 NAM, באמצעות פיפטה העברה הפלסטיק.
    הערה: עוברים מורכבים נוטים לפתח חיידקים או זיהום פטריות. לג לטווח ארוךulture להשתמש באנטיביוטיקה: kanamycin (50 מיקרוגרם / מיליליטר), אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וgentamycine (50 מיקרוגרם / מיליליטר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתבסס על שיקולים מורפולוגיים במינים שונים, מניפולציות עובריות, ואת דפוס הביטוי של גני רגולציה, מודל רעיוני גורס כי הצלחת העצבית מחולקת למגזרים רוחביים ואורך המגדירים רשת התפתחותית יצירת שדות histogenic מובחנים. בצלחת העצבית, primordia של המוח הקדמי, המוח התיכון, למוח האחורי וחוט השדרה כל כבר הוקם לאורך ציר Antero-אחורי (AP) במהלך gastrulation (שנסקר ב23-25). במהלך neurulation, ניתן לאתר שדות histogenic כתחומים מוגבלים במרחב של ביטוי גני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות עצבית היא בניצוחו של גומלין מורכב בין תוכניות סלולריות התפתחותיים ואותות מהרקמות הסובבות (נבדקו ב3,31,32). כאן אנו מתארים קבוצה של פרוטוקולים שניתן להשתמש בX. laevis עובר לחקור חיצוני וגורמים פנימיים מעורבים בקביעת גורל עצבית והמורפוגנזה עצבית במבחנת in vivo. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש ככזה על X. עוברי tropicalis, לעומת זאת X. עוברי tropicalis ארבע פעמים קטנות יותר אז X. laevis עובר. שני המל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מודה להוגו ז'ורבר-ג'סלין, מריון ואסף ואן הלן מונסורו-בורק על עזרתם ועצתם, ולמתקן בעלי החיים של מכון קירי. המחבר מודה לפול ג'ונסון על עבודת העריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS UMR8197, INSERM U1024) ועל ידי מענקים מ"האגודה למחקר על הסרטן" (ARC 4972 ו-ARC 5115; FRC DOC20120605233 ו-LABEX Memolife) וקרן פייר ז'יל דה ז'אן (FPGG0039).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פרפורמלדהידVWR  20909.290
חרוזי שרף חילופי אניוניםBiorad140- 1231
אלבומין סרום בקר SIGMAA-7888לתרבית של כמוסה מן החי pH 7.6
Gentamycine GIBCO15751-045 אנטיביוטי
סרום בקר אלבומיןSIGMAA7906  להכנת חרוזים
רעילים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
  2. Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
  3. Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
  4. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  5. Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
  6. Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
  7. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
  8. Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
  9. Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
  10. Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
  11. Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
  12. Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
  13. Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
  14. Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
  15. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
  16. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
  17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  18. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
  22. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
  23. Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
  24. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  25. Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
  26. Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
  27. Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
  28. Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
  29. Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
  30. Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
  31. Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
  32. Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
  33. Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
  34. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
  35. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
  36. Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
  37. Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
  38. Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27(2013).
  39. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
  40. Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In VitroIn Vivo

מאמרים קשורים