מאמר שיטה

בודה כותנה התקנים אנליטית

DOI:

10.3791/53480

⸱

30 באוגוסט 2016

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Department of Ophthalmology, Taichung Veterans General Hospital, 3Department of Engineering and System Science, National Tsing Hua University, 4Institute of Biomedical Engineering, National Tsing Hua University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור גישות ייצור פשוטות לצרכי בדיקה מרובים, יצרנו מערכת תעלות סופגת נוזלים העשויה מחומר כותנה. מכשיר זה שימש להקמת פלטפורמת זיהוי מרובה, ולפתרון בעיות זיהום המשפיעות בדרך כלל על מכשירים ביו-רפואיים מבוססי זרימה רוחבית, לבדיקת שתן קלינית של ניטריט, חלבון כולל ואורובילינוגן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכשיר אנליטי חזק, בעלות נמוכה צריך להיות ידידותי למשתמש, מהיר, ובמחיר סביר. מכשירים כאלה צריכים להיות מסוגלים גם לפעול עם דגימות נדירות ולספק מידע עבור טיפול ומעקב. הנה, אנחנו מדגימים את הפיתוח של בדיקת שתן מבוסס כותנה (כלומר, ניטריט, חלבון כולל, מבחני אורובילינוגן) מכשיר אנליטי המעסיק פורמט זרימה המבוססת לרוחב, והוא זול, מפוברק בקלות, מהיר, וניתן להשתמש בו כדי לנהל בדיקות מרובות ללא דאגות זיהום צולב. כותנה מורכבת של סיבי תאי עם מאפייני קליטה טבעיים שניתן למנף לניתוח מבוסס זרימה. תהליך הייצור פשוט אך אלגנטים של מכשיר אנליטי הכותנה המבוססת שלנו מתואר במחקר זה. ההסדר של כרית מבנה ולבדוק כותנה מנצל את הידרופוביות כוח הקליטה של ​​כל חומר. בגלל מאפיינים פיזיים אלה, התוצאות colorimetric יכול לדבוק בעקשנות במבחןכָּרִית. מכשיר זה מאפשר לרופאים לקבל מידע קליני במועד ומראה פוטנציאל גדול ככלי להתערבות מוקדמת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות הצבע של טיפול (POC) מכשירים לאבחון כי הם סבירים, חזקים, ובקלות בשימוש הכרחי לשיפור 1,2 הבריאות העולמי. בפרט, מכשירים מורכבים מצעים תאיים (למשל, נייר, חוט, וכותנה) לספק פלטפורמות אנליטית מבטיחות לניתוח בעלות נמוכה בגלל ההמצאות בכל המקום שלהם, affordability, קל שימוש, חוסן, ואת היכולת לספק תוצאות מהירות 3-7.

הנה, אנחנו חושפים את הפיתוח של מכשיר אנליטי מבוסס כותנה המשתמש בפורמט זרימה המבוססת לרוחב בדיקת שתן. מכשיר אנליטי כותנה מבוססת זה מספק גישת זיהוי חלופית עם יתרונות מרכזיים: א) ייצור עם מאמץ אנושי מינימאלי; ii) בעלות נמוכה; iii) את היכולת לשמש לעריכה מרובה, מבחנים שונים בלי דאגות בין זיהום; . iv) עצמאות התקן, כלומר, את היכולת להריץ ללא ציוד נוסף ו / או חשמל; ו, נמהירות) (מבחני colorimetric ניתן להשלים בתוך 10 דקות).

המבנה מכשיר אנליטיים כותנה מבוססת זה יכול להיות מחולק לארבעה חלקים: i) כותנה כי הוא הידרופובי טבעי על שכבת הידרופובי החיצונית שלה; ii) כותנה כי הוא פנימי הידרופילי ומשמש כערוץ תחבורה עבור פתילה נוזלית; iii) סרט למינציה שקושר ודוחס הכותנה בשימוש אך מכילה קדח חורים עבור המיקום של רפידות תגובה / בדיקה; ו, ד) רפידות מבחן כרומטוגרפיה נייר, אשר מצופה / מוטבע עם ריאגנטים תגובתי, ממוקם על פני השטח החיצוני של כותנה (במיוחד, במרחב קדח מתוך הסרט למינציה) כאזורי תגובה עבור מבחני colorimetric (כלומר, ניטריט, החלבון הכולל, pH, מבחני אורובילינוגן) ולהציג תוצאות.

המנגנון שבבסיס של הבדיקה הוא כדלקמן. המכשיר אנליטיים מבוסס הכותנה הוא בקיע עם קווים חודרים חצי דרך המחלקהשעות של חומר הכותנה ליצור ערוץ זרימה המאפשר נוזל מדגם להגיע הרפידות תגובתי בשימוש. קצה הקליטה של מכשיר אנליטי הוא שקוע לתוך מדגם היעד, ואז הפתרון הוא רשע לאורך ערוץ fluidic מסוף קליטת רפידות הבדיקה (איור 1). בגלל עוצמת הקליטה של ​​כרית המבחן היא גדולה יותר מזה של כותנה, פתרונות נספגו על ידי רפידות הבדיקה כלולות בתקיפות בתוך נייר כרית בדיקה כדי שאין הזרמה מחדש בחזרה לתוך תעלת fluidic, ותוצאות colorimetric ובהמשך מתקבעות על חומר משטח בדיקה. בסוף התגובה, תוצאות colorimetric נרשמות באמצעות סורק שולחני, ונותחו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זהירות: תרגול היגיינה מעבדה תקין נדרש. כפפות ואמצעי זהירות אוניברסלית נדרשות בעת השימוש במכשיר POC זה. זיהום של תוצאות או זיהום עלול להתרחש אם נהלי עיקור נאותים אינם מתבצעים כראוי.

1. הכינו מבחן ברצועת התקנים

  1. קבע את הידרופוביות של השכבה החיצונית של כותנת הטיהור ידי מדידת זווית מגע 8 (איור 3).
  2. לפברק את המכשיר אנליטיים מבוססי כותנה ידי חיתוך כותנה טיהור לתוך 5.5 ס"מ x 1 ס"מ חתיכות עם חותך נייר (איור 2 א).
  3. לקדוח חורים (מ = 0.5 ס"מ) בסדין רמת הסרט למינציה בשלשות; המרחק בין שני חורים הבאים הוא 1 ס"מ.
    הערה: רבים כמו 36 מקלוני בדיקה בודדים עם בשלושה תחומים הבדיקה כל יכול להתבצע באמצעות סדין רגיל של הסרט למינציה (5.5 ס"מ X 2 ס"מ) (איור 2 ב).
  4. סנדוויץ כותנת הטיהור (characterized ידי הידרופוביות חיצוניים hydrophilicity פנים) בין שתי חתיכות של סרט למינציה, כלומר, את סדין קדח החור של סרט למינציה בצד אחד, ואת גיליון undrilled של סרט למינציה (ללא חורים) בצד השני. הנח את המכלול לתוך מכשיר למינציה לארוז את המכשיר. זה משפר את החוזק המכאני של המכשיר, ומספק שכבה חיצונית, אטום.
    הערה: בקטרים ​​של חורים יתכווץ מ -0.5 ס"מ ל ~ 0.47 ס"מ לאחר למינציה. כמה פערים קלים יישארו בין כותנת הטיהור וקולנוע למינציה מסביב כל חור. פערים קלים אלה להקל על המיקום של חוגי כרית בדיקה שנעשו לשלב בא.
  5. השתמש זוג מספריים לחתוך מכשירים מקלון הבדיקה 5.5 ס"מ x 1 ס"מ בודדים מהאסיפה, כלומר, את הסדין למינציה קדח / צמר גפן / גיליון למינציה undrilled "כריך" (איור 2 ג). הפוך 48 מכשירים בסך הכל ליצור עקומות סטנדרטיות כמתואר בהמשך (18 התקניםעבור assay ניטריט, 15 התקנים עבור assay BSA, ו -15 מכשירים עבור assay אורובילינוגן).
  6. בעזרת סכין או תער חד לחתוך חריץ (כערוץ fluidic קטן) מהמרכז בכל אזור בדיקה (לא מכוסה על ידי סרט למינציה), נתקל ואת דרך שכבת הידרופובי של אזור בדיקה לשכבה הידרופילי של המכשיר האורך, להיות זהיר לחתוך באמצע העומק של המכשיר הדחוק (איור 2 ד).
  7. החל רפידות מבחן נייר (מ = 0.5 ס"מ) על ידי הזזה אותם לתוך הפערים על ההיקף של כל חור למינציה (איור 2E).

2. כן לתקני פתרונות מחוון עבור בדיקה שתן

  1. הכן 10.0 מ"מ מניות פתרון ניטריט ידי המסת סודיום ניטריט 69.0 מ"ג ב 100 מ"ל מים deionized (DI). לדלל את הפתרון המניות ניטריט במים DI כדי ליצור סדרה של פתרונות סטנדרטיים ריכוז ניטריט (2,500, 1,250, 625, 312, 156, ו -78 מיקרומטר) (איור4A).
  2. הכן 60 מיקרומטר שור אלבומין (BSA) פתרון המניות על ידי המסת BSA 415 מ"ג ב 100 מ"ל פתרון PBS (10 M חיץ פוספט, 0.0027 M אשלגן כלורי ו 0.137 M נתרן כלורי; pH 7.0). לדלל את פתרון מניות BSA במי DI כדי ליצור סדרה של פתרונות סטנדרטיים ריכוז BSA (30, 15, 7.5, 3.75, ו 1.875 מיקרומטר) (איור 4 ב).
  3. כן 25 גר '/ ל פתרון אורובילינוגן מניות על ידי המסת אורובילינוגן 2.5 גרם במי DI 100 מיליליטר. לדלל פתרון מניות אורובילינוגן במים DI כדי ליצור סדרה של פתרונות סטנדרטיים ריכוז אורובילינוגן (7.8, 15.6, 31.2, 62.5, ו -125 מ"ג / L) (איור 4 ג).
  4. הכן תמיסת אינדיקטור ניטריט המכיל sulfanilamide 50 מ"מ, 330 מ"מ חומצת לימון, ו -10 מ"מ N- (1-naphthyl) dihydrochloride ethylenediamine.
  5. הכן תמיסת אינדיקטור BSA המכיל 250 מ"מ פתרון חיץ ציטראט (pH 1.8) פתרון 3.3 מ"מ של tetrabromophenol כחול באתנול 95%.
  6. כן תמיסת אינדיקטור אורובילינוגן המכילה benzaldehyde 0.1 M 4-dimethylamine.

3. להכין רפידות מחוון

  1. חותך שלוש רפידות או דיסקים עגולים בצורה (מ = 0.5 סנטימטרים) מנייר כרומטוגרפיה ולהכניס כל אחד מהם (האחד לכל assay על הרצועה תלת assay) על כל התקן רצועת בדיקה כדי ליצור עקומת סטנדרט פתרון (סעיף 4).
  2. בכל חורי הסרט תלת למינציה של האסיפה, להתבונן רווח קטן בין סרט למינציה ולוח מבחן הכותנה בקצוות מאוד של החור לחתוך. הערה, החור בסרט למינציה הוא מעט קטן בקוטר מאשר כרית מבחן נייר.
    הערה: יחד, תכונות אלו מאפשרות כרית מבחן נייר כדי להיות מיושמת נגד חלק צמר גפן בדיקה של המכשיר כך שהקצוות של פליטת כרית מבחן נייר לתוך הפער הרזה ציין, כלומר, תחת הקצוות של חור סרט למינציה. זה מחזיק את רפידות מבחן נייר במקום.
  3. הכן את הניטריט אסאפרשת y של ההתקן.
    1. מעיל כרית assay ניטריט עם 4 μl של תמיסת אינדיקטור ניטריט (מוכן בשלב 2.4) ולאפשר לו להתייבש לחלוטין בטמפרטורת הסביבה.
  4. מכין את מנת Assay החלבון סה"כ של מכשיר האיתור.
    1. מעיל כרית assay החלבון הכולל עם 4 μl של תמיסת אינדיקטור BSA (מוכן בשלב 2.5) ולאפשר לו להתייבש לחלוטין בטמפרטורת הסביבה.
  5. מכין את מנת Assay Uroblinogen של מכשיר האיתור.
    1. מעיל כרית assay uroblinogen עם 4 μl של אינדיקטור uroblinogen (מוכן בשלב 2.6) ולאפשר לו להתייבש לחלוטין בטמפרטורת הסביבה.

4. צור עקומות סטנדרטיות עבור מכשיר אנליטי מבוסס כותנה

  1. עבור כל תקן המוכן, טובל את קצה הקליטה של ​​מכשיר מוכן (מראש עם אינדיקטורים assay (ראה סעיף 3.4)) לתוך הפתרון הסטנדרטי עבור 10 שניות (הנפח הקליט ~200 - 300 μl) (איור 2F).
  2. מניח את המכשיר מבוסס הכותנה בסביבת סביבה במשך 10 דקות כדי להשלים תגובות colorimetric (איור 2F). חזור על כל ניסוי בשלושה עותקים.
  3. סרוק את המכשיר כדי לנתח את שינוי colorimetric המתרחש בכל משטח בדיקה (2G איור). מקום וכתוצאה רפידות מבחן על כוס סורק שולחני ורפידות מבחן סריקה במצב RGB עם 600 dpi של רזולוציית התמונה. שמור כל תמונה בפורמט jpeg.
  4. לנתח את התמונה סרוקה על תוכנת ניתוח מחשב באמצעות תמונה כדי לקבוע עוצמות צבע בהתאמה (איור 2H).
    1. הורד תוכנה ImageJ ב http://imagej.nih.gov/ij/. פתח את קבצי התמונה הסרוקה. בחר תמונה של פקודות התפריט, ובחר "סוג" להמיר תמונות RGB ל- 8 סיביות בגווני אפור.
    2. השתמש באפשרות "הסגלגל" בסרגל הכלים כדי לבחור את האזור אנליטיים כרית הבדיקה. בחר "נתח" ב comm התפריטידיים, ובחר "מדוד" לנתח את עוצמת הצבע. שיא מתכוון תוצאות אינטנסיביות.
  5. להקים את העקומות הסטנדרטיות של ניטריט, חלבון כולל, מבחני אורובילינוגן (איור 2I).
    1. ציינו ריכוזים שונים של ניטריט סטנדרטי, חלבון כולל, ופתרונות אורובילינוגן ו בקורלציה תוצאות עוצמות ממוצע על מערכת קואורדינטות דו ממדים באמצעות תוכנת stastical.
    2. התאימו את עקומת סטנדרט עבור assay ניטריט ידי מודל ריבועית ואת עקומות סטנדרטיות עבור מבחני חלבון אורובילינוגן הכולל על ידי מודלים של רגרסיה ליניארית.

5. לקבוע ריכוזים מדגמים לא ידועים באמצעות ערכים עקומים סטנדרט הוקמו

  1. כדי לקבוע ניטריט, חלבון כולל, וריכוזי אורובילינוגן בפתרונות ידועים, להשתמש במכשיר כמתואר למדידת ריכוזי פתרון סטנדרטיים ותוצאות עוצמות נמדד תחליף ניטריט, חלבון כולל, ואת urobiמבחני linogen לתוך המשוואות של המודלים שנבנו בשלב 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו דגים בהצלחה בפיתוח של מכשירים אנליטיים מבוסס כותנה באמצעות כותנת ניקוי זמינה מסחרי מאופיינות הידרופילי (חלק פנימי) ו הידרופובי (חלק חיצוני) נכסים (איור 1 א). איור 3 מציגים את תוצאות מדידת זווית מגע. הממשק הידרופובי של כותנה החיצונית היה 127.35 ° ± 4.73 °. מנקודת מבט ידידותי למשתמש, מבחני colorimetric מועסק כאן יכול להיבחן ישירות על ידי בעין בלתי מזוינת, ובהמשך לכמת באמצעות עוצמת הצבע מנתח (איור 2F).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צעדים קריטיים בפרוטוקול זה נכלל בקביעת השילוב המתאים של חומר כותנה (עם משתני הידרופוביות / hydrophilicity) ולסנן נייר (נייר סינון כרומטוגרפיה או נייר סינון כמוני). עיצוב המכשיר מתוכנן היטב והוצא להורג הופך את הביצועים הטובים ביותר מייחס עבור מבחני colorimetric. מתוצאות assay colorimetric שלנו, המכשיר אנליטיים מבוססי כותנה המוצגת כאן מדגים פוטנציאל גדול כפלטפורמה לגילוי המחלה נפוצה.

רוב מוצרי זרימת בסיס לרוחב נוכח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים. S.C.L., C.M.K., F.G.T. ו-C.M.C. הם ממציאים של פטנט (פטנט מס': US 8691162 B1) בבעלות האוניברסיטה הלאומית צינג הואה על בסיס העבודה המדווחת בכתב יד זה. ל-S.C.L., C.M.K., F.G.T ו-C.M.C. יש פטנטים ממתינים בטייוואן ובסין בהתבסס על העבודה המדווחת בכתב יד זה. מ.י.ח מצהיר שאין ניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי משרד של טייוואן המדע והטכנולוגיה (MOST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)), ו Taichung ותיקי החולים הכללי (TCVGH-1056904C (MYH)).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלבומין סרום בקרSigma-Aldrich, ארה"מס' 9048468 99%
ניטריט סיגמא-אולדריץ', ארה"במס' 7632000≥ 99%
urobilinogen סנטה קרוז ביו, מס' ארה"ב SC-296690
ציטראטסיגמא-אולדריץ' ארה"במס' 6132043≥ 99%
טטרברומופנול כחולסיגמא-אולדריץ' ארה"מס' 4430255 99%
סולפנילאמידסיגמא-אולדריץ' ארה"במס' 63741≥ 99%
חומצת לימון סיגמא-אולדריץ' ארה"מס' 77929≥ 99.5%
  N-(1-נפתיל) אתילנדיאמין דיהידרוכלורידסיגמא-אולדריץ' ארהמס' 1465254≥ 98%
4-(דימתילאמין)בנזלדהידAlfaAesar, ארהמס' A11712≥ 98%
מתיל אדום מלחנתרן סיגמא, ארה"מס' 114502≥ 95%
סיגמה כחולה ברומותיל, ארה"מס' 114413≥ 95%
Shiseido Cleansing CottonShiseido, יפןמס' 79014
נייר כרומטוגרפיהGE Healthcare Whatman, Springfield Mill, בריטניהמס' 30306132
סרט למינציהלמצע פלסטיקA4216 מ"מ x 303 מ"מ
סורקmicrotek scanmaker  חותך נייר i2400
חותך נייר חייםמס' 306
למינציהAURORA 
LM4231H סרט למינציהUNI LAMI 4א
ב ב ב "ב "ב ב ב , MAS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
  2. Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
  3. Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
  4. Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105(2011).
  5. Lin, S., et al. Cotton-based Diagnostic Devices. Scientific reports. 4, 6976-6976 (2013).
  6. Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
  7. Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
  8. Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
  9. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
  10. Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
  11. Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R. Understanding Urinalysis. medscape. 7 (3), 269-279 (2012).
  12. Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
  13. Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
  14. Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
  15. Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ImageJ

מאמרים קשורים