Method Article

ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D

DOI:

10.3791/53486

⸱

December 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שתי שיטות משלימות המשתמשות באינדיקטור מחזור התא של הפלואורסצנציה (FUCCI) וניתוח תמונה או ציטומטריית זרימה כדי לזהות ולבודד תאים באזורי העצירה הפנימיים של G1 ובאזורים החיצוניים המתפשטים של ספרואידים תלת מימדיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספרואידים תלת מימדיים (תלת מימדיים) של גידול משמשים בחקר הסרטן כמודל מדויק יותר של מיקרו-סביבת הגידול in vivo, בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית (2D) מסורתית. המודל הספרואיד מסוגל לחקות את ההשפעות של אינטראקציה בין תא לתא, היפוקסיה ומחסור בחומרים מזינים וחדירת תרופות. אחד המאפיינים של מודל זה הוא התפתחות של ליבה נמקית, המוקפת בטבעת של תאי G1 שנעצרו, עם תאים מתרבים על השכבות החיצוניות של הספרואיד. מעניין בתחום הסרטן הוא כיצד אזורים שונים של הספרואיד מגיבים לטיפולים תרופתיים כמו גם למניפולציה גנטית או סביבתית. אנו מתארים כאן את השימוש במערכת אינדיקטור מחזור התא הפלואורסצנטי (FUCCI) יחד עם ציטומטריה וניתוח תמונה באמצעות תוכנה מסחרית כדי לאפיין את מצב מחזור התא של תאים ביחס למיקומם בתוך ספרואידים של מלנומה. שיטות אלו עשויות לשמש למעקב אחר שינויים במצב מחזור התא, ביטוי גנים/חלבונים או כדאיות התא בתת-אזורים שונים של ספרואידים של גידול לאורך זמן ובתנאים שונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

spheroids תאיים 3D כבר ידוע כמודל גידול במשך עשרות שנים, אולם זה רק לאחרונה כי הם באים בשימוש נפוץ יותר כמודל במבחנה עבור רבים סרטן מוצק. הם משמשים יותר ויותר במסכי גילוי תרופות תפוקה גבוהה כביניים בין מורכב, יקר ובמודלי vivo זמן רב ופשוט, מודל monolayer 2D העלות הנמוך 1-6. מחקרים בתרבות 2D לעתים קרובות אינם יכולים להיות משוכפל in vivo. מודלים אליפטית של סוגים רבים של הסרטן יכולים לחקות את מאפייני הצמיחה, רגישות לסמים, חדירת תרופה, אינטראקציות תא-תא, זמינות מוגבלת של חמצן וחומרים מזינים ופיתוח של נמק שראה in vivo בגידולים מוצקים 6-11. Spheroids לפתח ליבת נמקים, אזור שקט או G1 נעצר מקיף את הליבה, ותאים מתרבים בפריפריה של אליפטית 7. הפיתוח של אזורים אלהעשוי להשתנות בהתאם לצפיפות התא, שיעור ריבוי והגודל של 12 אליפטית. זה כבר שיערו כי ההטרוגניות הסלולרית ראתה בתת-אזורים השונים אלה עשויה לתרום לטיפול בסרטן ההתנגדות 13,14. לכן היכולת לנתח תאים באזורים אלה בנפרד היא קריטית לתגובות סמים גידול הבנה.

מחוון מחזור תא ubiquitination הקרינה המערכת (FUCCI) מבוססת על אדום (Kusabira אורנג '- KO) וירוק (Azami הירוקה - AG) תיוג ניאון של Cdt1 וgeminin, אשר מפורקים בשלבים שונים של מחזור התא 15. כך גרעין תא מופיע אדום בG1, צהוב בתחילת S וירוק ב/ G2 / M שלב S. אנו מתארים כאן שתי שיטות משלימות הן באמצעות FUCCI לזהות מחזור התא, יחד עם השימוש בתוכנות הדמיה או זרימת דיפוזיה צבע cytometry assay כדי לקבוע אם תאים מתגוררים במרכז G1 נעצר או proliferatin החיצוניטבעת G, והמרחק של תאים בודדים מקצה אליפטית. שיטות אלו פותחו בפרסום הקודם שלנו, שבו הראו כי תאים מלנומה באזורי חוסר חמצן במרכז אליפטית או / ובנוכחות של טיפולים ממוקדים יכול להישאר במעצר G1 לפרקי זמן ארוכים, ויכול מחדש הזן את מחזור התא כאשר תנאים נוחים יותר להתעורר 7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. FUCCI התמרה ותרבית תאים

  1. התמרה FUCCI
    1. צור שורות תאי יציבות להביע FUCCI בונה mKO2-hCdt1 (30-120) וMAG-hGem (1-100) 15 באמצעות שיתוף התמרה lentivirus כפי שתואר בעבר 7.
      הערה: מערכת FUCCI זמינה כעת מסחרי.
    2. צור תת-שיבוטים עם הקרינה בהירה על ידי מיון תא בודד. תאים מיין אחת חיובי עבור שתי AG וKO (צהוב) על ידי תאים מופעלים הקרינה מיון לתוך צלחת 96-היטב כפי שתוארו קודם לכן 7,16.
  2. תרבית תאים מלנומה
    1. תאים מלנומה אנושי תרבות C8161 כפי שתוארו קודם לכן 7,17.

2. גיבוש 3D ספרואיד (כפי שתואר קודם לכן 3,9)

  1. הכנת צלחת agarose
    1. לפזר agarose 1.5% (או אגר אצילי) בפתרון של האנק מלח מאוזן (HBSS) או buffere פוספט 100 מיליליטרמלוח ד (PBS) על ידי רתחה במיקרוגל במשך 3-5 דקות עם מתערבל. ודא agarose נמס לגמרי.
    2. מייד לוותר על פתרון agarose לכל גם 100 μl לצלחת תרבית רקמת 96-גם-תחתית שטוחה בעזרת פיפטה רבת-ערוצית.
      הערה: Agarose עשוי לחזק בטיפים לאחר תקופה קצרה של זמן, כדי להתגבר על בעיה זו טיפים יש לשנות בין לוחות אם עושה צלחת יותר מאחד agarose.
    3. השאר צלחת 96-היטב על משטח שטוח להקשיח agarose במשך שעה לפחות 1.
  2. הכנת תא ושכבה על גבי agarose
    1. לגדל תאים לconfluency כ -80% בבקבוק T75. לשטוף עם 10 מיליליטר של HBSS.
    2. לנתק את התאים באמצעות 1.5 מיליליטר של 0.05% טריפסין / חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) וגלול ב 10 מיליליטר של מדיום רגיל.
    3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer 18 או שיטת ספירה אוטומטית אחרת.
    4. Resuspend תאים לריכוז סופי של 25,000 תאים / מיליליטר בנורמהבינוני אל.
    5. כיסוי בארות agarose עם 200 μl של ההשעיה התא למספר סופי של 5,000 תאים לכל טוב.
    6. צלחות חזור לתרבית תאי החממה (5% CO 2 ו -37 ג) כדי ליצור spheroids על כ 3 ימים.
      הערה: הזמן שלוקח כדי ליצור אליפטית משתנה בין שורות תאים שונות. שורות תאים מסוימים לא יוצרות spheroids שימוש בשיטה זו בכל.
    7. מורפולוגיה אליפטית תמונה עם מיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרת 4X וסינון לעומת שלב. שורת תאים שיוצרת הצלחה spheroids יפיק אגרגטים קומפקטיים, בערך כדוריים תא, ולא צריך להיות רק אחד אליפטית בכל טוב.
      הערה: אופציונאלי: ברגע שspheroids יצר, הם יכולים להיות מושתלים לקולגן או מטריצה ​​אחרת לניתוח נוסף של צמיחה ופלישה 3,7,17. כדי להסיר spheroids מקולגן, טיפול עם 500 μl של 2 מ"ג / מיליליטר collagenase על 37 מעלות צלזיוס עד קולגן הוא מומס מספיק לspherOIDs לבוא בחינם לתקשורת (כ -30 דקות). להסיר בעדינות spheroids בעזרת פיפטה 1 מיליליטר.
    8. עבור חתך / הדמיה spheroids התיקון (או מבודד מקולגן או גדל במשך 3-5 ימים בagarose) ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין (זהירות: יש להשתמש בפורמלין במנדף) לפחות 2 שעות בטמפרטורת חדר (RT) , או הלילה (O / N) ב 4 מעלות צלזיוס. Spheroids עשוי להיות מאוחסן בHBSS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.

3. ספרואיד חתך vibratome

  1. לפזר 5 גרם של נקודת התכה הנמוכה agarose בשל HBSS 100 מיליליטר בבקבוק זכוכית 500 מיליליטר במיקרוגל. השתמש בהגדרת חום בינונית עם מסתחרר. זהירות: שמור את המכסה רופפת כשרותחים הפתרון כך שניתן לשחרר את הלחץ. השתמש בכפפות חסינות חומות מגן כדי להגן על ידיים מכוויות בעת הטיפול בבקבוק הזכוכית החמה.
  2. חכה עד agarose מתקרר מעט - כך את הבקבוק ניתן נגע בלי לשרוף את הידיים.
  3. יוצקים approximately 2 מיליליטר של agarose לתחתית כוס דלפק קולטר או תבנית פלסטיק דומה. מייד לשאוב אליפטית קבועה (ראה סעיף 2.2.8) בעזרת פיפטה 1 מיליליטר בנפח הקטן ביותר של נוזל אפשרי. להוסיף אליפטית לagarose. כמה spheroids (עד 10) ניתן להוסיף לכל כוס.
  4. מכסה את spheroids עם 2 מיליליטר יותר של agarose. לעשות את זה מהר, כדי למנוע את התקשות agarose לפני השכבה השנייה הוא הוסיפה.
  5. אפשר agarose להקשיח ב RT בחושך במשך לפחות 3 שעות. בכוסות שלב זה עשויה להיות מאוחסן לזמן קצר על 4 מעלות צלזיוס עם 2-3 מיליליטר של HBSS מעולף על מנת למנוע התייבשות.
  6. הסר agarose מהכוס. חתוך את agarose המכיל את spheroids כך שיתאים אל גוש מתכת vibratome, וspheroids קרוב לחלק העליון של agarose. ניתן לראות spheroids כאובייקטים לבנים קטנים בתוך agarose. סופר דבק agarose לבלוק.
  7. מלא את vibratome עם מים מזוקקים והר הבלוק בvibratome. הגדר אתvibratome לחתוך 100 מיקרומטר סעיפים באמצעות מהירות נמוכה (הגדרה 2) ורטט גבוה (הגדרה 8). הגדר את זווית להב חיתוך עד 16 מעלות. הפעל vibratome ב, להדליק את אור vibratome ולחתוך חלקים מהחלק העליון של agarose עד 100 מיקרומטר סעיפי אליפטית נחתכים. הנח סעיפי אליפטית לחתוך לHBSS בצלחת 24 גם.
  8. בחר סעיפי אמצע לניתוח תמונה. חלקי הר בשקופיות על ידי העברה השטוחה סעיף לשקופית באמצעות פינצטה. מלא חבית מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום; להוסיף קו דק של שומן ואקום מסביב לקצוות של הסעיף כדי למנוע תקשורת ההרכבה מהריצה את הקצוות של השקופית ולעזור לאטום את הסעיף תחת coverslip. מכסה את החלק עם הרכבה בינונית וcoverslip. לאטום קצוות של coverslip עם לק. חנות מחליקה על 4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה.

תמונת Confocal 4. רכישה

  1. קח תמונת Z-פרוסת סעיף אליפטית FUCCI אמצע באמצעות 10Xאו אובייקטיבי 20X כפי שתואר בעבר 7. ודא שאין חפיפה או crosstalk מתרחש בין כתום 2 color Kusabira וAzami הירוק. אם משווה ניתוח תמונה בין חלקי אליפטית מרובים, לשמור על כוח הלייזר והגדרות אחרות באותו בין דגימות.

Assay דיפוזיה Hoechst צבע 5. לזרימת מיון

  1. העבר את spheroids החי (3-5 ימים לאחר זריעת agarose) לצינור 15 מיליליטר. בואו הכבידה spheroids ליישב לתחתית של התחתית. כמה spheroids עלול להיות מוכתם לכל צינור. יש צורך בכ 20 spheroids כדי לקבל מספרים סלולריים מספיקים לcytometry זרימה.
  2. הסר בינוני עודף ולהוסיף 1 מיליליטר של 10 מיקרומטר Hoechst מדוללים במדיום רגיל. דגירה spheroids על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעה. השתמש מצליף עדין לresuspend spheroids פעם או פעמיים במהלך דגירה.
    הערה: זמן הדגירה יכול להיות מגוון לשנות כמה רחוק צבע Hoechst חודר לתוך spheroids. זה ישתנה בהתאם לגודל אליפטית, צפיפות וקו סלולארי. עבור חלק גדול spheroids / צפוף ייתכנו חדירת צבע מרבי שהיא פחות מ -100%.
  3. שטוף את spheroids בעדינות עם 5 מיליליטר של HBSS באמצעות שיקוע כובד.
    1. אופציונאלי: עבור הדמיה של חדירת צבע: תקן spheroids עם 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין לפחות שעה 2 ב RT או O / N ב 4 ° C. הכן חלקי vibratome, הר בשקופיות ותמונה על confocal כפי שתואר בשלבים 3 ו -4 לעיל.
  4. כדי להכין תאים לcytometry זרימה, trypsinize spheroids עם 1 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 30 דקות עם מצליף כל 10 דקות כדי לשבור את spheroids בנפרד.
    הערה: Spheroids קשה להיכנס להשעית תא בודדת, תנאים עשויים צריכים להיות מותאמים. כדאיות של C8161 הישן spheroids 4 יום לאחר תהליך זה היא כ -95%.
  5. תאי כתם עם חיות קרובה אינפרא אדום / כתם מת על פי פרוטוקול היצרנים. לשטוף עם HBSS לאחר מכן לתקן עם 1מיליליטר של 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין לכ 30 דקות. תאים עשויים להיות מאוחסנים בHBSS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני ניתוח תזרים.

6. ניתוח תזרים Cytometry של Hoechst Spheroids FUCCI יטראז

  1. תאים להבטיח לא בכבדות יחד על ידי עובר אותם דרך מסננת תא. Resuspend Hoechst המוכתם spheroids FUCCI בשטיפת קרח קר FACS (PBS עם 5% עגל סרום עוברי) בריכוז של 1-5 x 10 6 תאים / מיליליטר. העבר את 200 μl של מדגם 5 מיליליטר עגול צינורות תחתון.
  2. הכן את דגימות בקרת צבע אחד הבאה כמתואר ב6.1: תאים מלנומה מוכתם האו"ם; תאים מלנומה חסיד מוכתמים עם מיקרומטר Hoechst 10 עבור שעה 1; Azami הירוק מביע רק תאים מלנומה; וKusabira אורנג להביע רק תאים מלנומה.
    הערה: בקרות צבע יחידה עשויות להיות קבועות בפורמלין ומאוחסנות בFACS לשטוף עם 0.1% נתרן יזיד ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבועות או אפילו חודשים.
  3. השעיות תא בודדות לרוץ oזרימת na cytometry מנתח עם לייזרים מתאימים וצבע אחד / בקרה בלא כתם כמו בעבר תיארה 7,16.
  4. השתמש בתוכנת cytometry מסחרית כגון FlowJo לנתח הפנימי לעומת תאי אליפטית חיצוניים כדלקמן:
    1. להסיר פסולת על ידי gating על אוכלוסיית התאים העיקרית באור קדימה פזורים (FSC) לעומת אור צד פזורים (SSC).
    2. הסר כפילויות על ידי gating על תאים בודדים באמצעות FSC (אזור) לעומת FSC (גובה)
    3. שער לתאי חיים על ידי gating על האוכלוסייה החי / המתה הנמוכה.
    4. הגדר Hoechst תאים גבוהים, מגודר המבוסס על האיתות החיובית מהתאים חסיד מוכתמים בHoechst, כמו תאים "חיצוניים".
    5. להגדיר תאים נמוכים או שליליים Hoechst, מגודר המבוסס על האות מהשליטה מוכתמת האו"ם, כמו תאים "פנימיים".
    6. לאחר gating לאוכלוסיות הפנימיות וחיצוניות, תאים עשויים להיות מגודר נוסף לאדום FUCCI (G1), (S המוקדם) הצהוב, ירוק (S / G2 / M) או (G1 המוקדם) השלילי.
      הערה: Compensation באמצעות פקדי צבע אחד עשוי להידרש להגדיר כראוי האוכלוסיות אדומות, צהובות, ירוקות ושליליות FUCCI.
  5. ברגע שassay כבר מותאם וחדירת Hoechst תוקף באמצעות מיקרוסקופיה confocal, לרוץ תאים ללא תיקון על סדרן תא זרימה כפי שתואר לעיל 7,16 לניתוח נוסף של תת-אוכלוסיות תאים חיים.

ניתוח 7. תמונה של סעיפים FUCCI ספרואיד

  1. למשל תוכנה פתוחה. Volocity, לבחור את התצורה רק Quantitation.
  2. יצירת ספרייה חדשה. לייבא את קובץ תמונת confocal אליפטית FUCCI לתוך התוכנה על ידי גרירת קובץ נתונים הגולמי מconfocal לספרייה. לחלופין, השתמש בפקודת File> Import.
  3. עבור לכרטיסיית המדידות לבנות פרוטוקול ניתוח תמונה. הפרוטוקול נבנה על ידי גרירה ושחרור את הפקודות המתאימות בסדר הנכון כדלקמן בחלון הפרוטוקול.
  4. מצא objרישומם בערוץ הירוק: גרור את הפקודה למצוא החפצים (שנמצאה ב'מציאת ') לתוך חלון הפרוטוקול, בחר את הערוץ הנכון באובייקטים למצוא protocol.Add הפקודה פתוחה (שנמצאה ב'עיבוד'), ואז אובייקטים נוגעים ללב נפרד הפקודה (נמצאה ב'עיבוד '- זה יהיה להפריד תאים). תכלול אובייקטים לפי גודל <50 מיקרומטר (נמצא ב'סינון '- זו לא תכלול אובייקטים בלתי תאיים קטנים).
    הערה: משתנה כמו למצוא חפצי סף, מספר החזרות פתוחות, בגודל של אובייקטים להיות מופרד והגודל של אובייקטים שלא לכלול חייב להיות מותאם באופן ידני עד מסכות האובייקט להתאים את התמונה.
  5. מצא את האובייקטים במסלול האדום: חזור למצוא חפצים כאמור לעיל למסלול האדום. פרוטוקולים ירוקים ואדומים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בנפרד.
    הערה: בשל גרעינים להיות בG2, גרעינים ירוקים הם לעתים קרובות מעט גדולים יותר.
  6. לאשר אובייקטים מצאו מדויקים: לאשר אדום ואובייקטים ירוקים להתאיםגרעינים אדומים וירוקים בתמונה על-ידי כיבוי ועל הערוצים הירוקים ואדום (באמצעות להסתיר או להציג פקודת הערוץ) תוך הצגת המסכות האדומות וירוקות שנמצאו על ידי הפרוטוקול. אפשרויות משוב (מדידות> אפשרויות משוב) ניתן להשתמש כדי לשנות את המראה של מסכות האובייקט.
  7. מצא את האובייקטים צהובים (תאי שלב S המוקדם): כדי למצוא תאים צהובים, להוסיף מצטלבים אדום עם התאים ירוקים פקודה (נמצא ב'שילוב '). תכלול אובייקטים לפי גודל (<50 מיקרומטר, שנמצאו ב'סינון ') שלא לכלול את כל אובייקטים בלתי תאיים קטנים.
  8. מצא את האובייקטים באופן בלעדי אדומים (תאי שלב G1): כדי למצוא גרעינים באופן בלעדי אדומים, להפחית את התאים הצהובים מהתאים האדומים (שנמצאו ב'שילוב '). תכלול אובייקטים לפי גודל <50 מיקרומטר, (נמצא ב'סינון ') כדי להסיר כל חפצים בלתי תאיים קטנים שנוצרו.
  9. מצא את האובייקטים באופן בלעדי ירוקים (תאי שלב S / G2 / M): חזור למסלול הירוק למצוא באופן בלעדי ירוק.
    לאטה: אם יש עדיין אובייקטים בלתי תאיים שנותרו, פקודת אוכלוסיית מסנן ניתן להוסיף לפרוטוקולים בלעדיים הירוקים או האדומים בלעדיים (שנמצאו ב'סינון ') כדי לשמור רק אובייקטים עם גורם צורה גדול יותר מאשר 0.25. הפעולה זו תסיר את האובייקטים שאינם מעגליים.
  10. מצא את המתווה אליפטית: מצא את המתווה אליפטית באמצעות למצוא חפצי הפקודה (נמצאה ב'מציאת ') עם המסלול הירוק או אדום (לפיה יש יותר תאים מסביב לקצה של אליפטית). סף נמוך בהרבה (שנמצא בלמצוא חפצים משתנה) יצטרך להשתמש בהם כדי למצוא את המתווה אליפטית בהשוואה לתאים בודדים.
    1. השתמש בפקודה קרובה להצטרף לאובייקטים (שנמצאו ב'עיבוד '), ולאחר מכן למלא חורים בחפצים (שנמצאו ב'עיבוד'), ולאחר מכן להשתמש במסנן עדין (שנמצא ב'סינון ') להסיר רעש מאובייקטים. לבסוף, להוציא חפצים לפי גודל כדי להסיר אובייקטים קטנים <30,000 מיקרומטר (תלוי בגודל אליפטית).
      הערה: פרוטוקול זה צריך להיות מותאם באופן ידני עד המתווה אליפטית היא מדויקת. ניתן להשתמש גם בתמונה brightfield - אולם זה הוא בדרך כלל פחות מדויק עם סעיף אליפטית, ופקודת היפוך (שנמצאה ב'שילוב ') צריך להיות בשימוש.
  11. למדוד מרחקים של גרעינים למתווית אליפטית: מרחקים מדוד (שנמצאו ב'בדבר ') מהאוכלוסיות הצהובות, באופן בלעדי ירוקות ואדומות באופן בלעדי מcentroid התא לקצה אליפטית outline.To לדמיין את המרחקים המינימליים, שאמורה להיות מ תא לקצה אליפטית הקרוב, להפעיל מרחקי מופע בכרטיסיית מערכות יחסים באפשרויות משוב (מדידות> אפשרויות משוב> יחסים).
  12. שמור את הפרוטוקול. פרוטוקול זה עשוי להיות מחדש מיושם לתמונות אחרות באמצעות המדידות> שחזור פקודת הפרוטוקול.
  13. ליצור פריט מדידות (מדידות> הפוך פריט מדידה). הנתונים ניתן לנתח באמצעות הניתוחפונקציות.
    1. עבור לכרטיסיית הניתוח בפריט המדידות. לכו לתפריט ניתוח (ניתוח> ניתוח) ולנתח את המרחק המינימאלי מcentroid התא (האדום, ירוק או צהוב) עד לקצה אליפטית, סיכם על ידי ספירה ומאורגנת על ידי אוכלוסייה.
    2. לספור את מספר התאים הנמצאים במרחק מסוים מהקצה ליצור מסנן (ניתוח> סינון). המסנן למרחק מינימאלי באיור 2 מבוסס על חדירת Hoechst (למשל מרחק מינימאלי הוא פחות מ -80 נותן אוכלוסייה "החיצונית"). לחלופין, יצוא נתונים גולמיים לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן מספר שיטות של ייצור spheroids גידול, פרוטוקול זה משתמש בשיטת הגידול שאינו חסיד, שבו תאים בתרבית על אגר או 3,7,9 agarose. איור 1 מציג דוגמא של מלנומה אליפטית C8161 לאחר 3 ימים על אגר. spheroids C8161 יוצר spheroids בגודל רגיל בקוטר של 500-600 מיקרומטר (ממוצע = 565, SD = 19, n = 3) לאחר 3 ימים. שורות תאים מלנומה אחרות שיהוו spheroids כוללות: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (spheroids נוצר עם קו תא זה הוא לא סדיר ופחות צפוף 19).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח תמונה חצי-אוטומטי זיהה את אזור G1 נעצר הפנימי אליפטית, ומתרבה שכבות חיצוניות. שיטה זו עשויה לשמש בspheroids החי באמצעות סעיף אופטי, או בסעיפים אליפטית קבועים, לזהות שינויים בלא רק מחזור התא אבל ביטוי סמן (באמצעות immunofluorescence), מוות של תאים, או מורפולוגיה של תאים באזורים השונים הללו. תא תנועתיות בתוך אזורי אליפטית שונים יכולות להיות גם לכמת - אם הדמיה לחיות confocal הזמן לשגות יחד עם צעד ניתוח תמונת מעקב תא הוא הוסיפה. קריטי לניתוח תמונה הוא שתמונות confocal פרוסת Z- א...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרקין אלמר תרם לעלויות הפרסום.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לגב' דנה שארפ ולגב' שינה דייגנו על הסיוע הטכני. אנו מודים לד"ר אטסושי מיאווקי, RIKEN, וואקו-סיטי, יפן, על אספקת מבני FUCCI, לד"ר מינהרד הרלין ולגב' פטרישיה ברפורד, מכון וויסטאר, פילדלפיה, על אספקת קווי תאים, למתקן ההדמיה וציטומטריית הזרימה במכון Centenary על תמיכה טכנית יוצאת דופן. אנו מודים למר כריס ג'ונסון ולד"ר אנדרו בארלו על התמיכה הטכנית בתוכנת Volocity. N.K.H. הוא עמית קמרון במכון לחקר מלנומה וסרטן העור, אוסטרליה. K.A.B. הוא עמית במכון הסרטן בניו סאות' ויילס (13/ECF/1-39). וו.ו. הוא עמית במכון הסרטן בניו סאות' ויילס (11/CDF/3-39). עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הפרויקט RG 09-08 ו-RG 13-06 (מועצת הסרטן של ניו סאות' ויילס), 570778 ו-1051996 (תוכנית מחקר סרטן משותפת מונעת עדיפות/סרטן אוסטרליה/קרן ריפוי סרטן אוסטרליה), 08/RFG/1-27 (מכון הסרטן ניו סאות' ויילס), ו-APP1003637 ו-APP1084893 (המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
אגרוז נקודת התכה נמוכהLife Technologies16520-050לחיתוך
אגר אצילי SigmaA5431להכנת ספרואידים
אגרוז לספרואידיםFisher ScientificBP1356-100להכנת ספרואידים
0.05% טריפסין/EDTALife Technologies25300-054
HBSSLife Technologies14175-103
10% פורמליןSigmaHT5014-1CSאזהרה: מזיק, קורוזיבי. השתמש בציוד מגן אישי, עשה   לא אדי נשימה (פתוחים בארון אדים).
חי/מת ליד IRLife TechnologiesL10119
vibratomeTechnical Products International, Inc
coulture cupThermo-Fisher ScientificSIE936עובש לחיתוך ספרואידים
המוציטומטרSigmaZ359629
צלחת תרבית רקמות 96 בארותInvitroFAL353072
קולגנאזסיגמאC5138 
מיקרוסקופ קונפוקליLeicaTCS SP5
מנתח ציטומטר זרימהבקטון דיקינסוןLSRטכנולוגיית
וולוסיטיPerkinElmerתוכנת הדמיה
flowjoTree StarFlow תוכנת ציטומטריה
שומן ואקוםסיגמאZ273554
הרכבהמדיה וקטור מעבדותH1000
FUCCI (מבנים מסחריים)Life TechnologiesP36238טרנספקציה חולפת בלבד
מסננת תאים 70 & #956; mIn VitroFAL352350
שפופרות 5 מ"ל תחתונות עגולות (סטריליות)In VitroFAL352003
שפופרות 5 מ"ל תחתונות עגולות (לא סטריליות)In VitroFAL352008

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
  3. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
  4. Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
  5. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
  8. Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
  9. Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
  10. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
  11. Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
  12. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  13. Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
  14. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
  15. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  17. Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
  18. Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
  19. Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
  20. Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22(2011).
  21. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
  22. Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
  23. Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73(2013).
  24. LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
  25. Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
  26. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  27. Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Melanoma SpheroidsCell Cycle AnalysisFlow CytometryFUCCI SystemConfocal ImagingImage AnalysisCell Position TrackingSpheroid SectioningNecrotic CoreProliferating Cells

Related Articles