שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

סיכום

מתוארת שיטה לגירוי פעילות חשמלית של תרביות תאים במבחנה עם אור נראה, המבוססת על שימוש בפולימרים אורגניים מוליכים למחצה.

תקציר

ממשקים היברידיים בין מוליכים למחצה אורגניים ורקמות חיות מייצגים כלי חדש ליישומי in-vitro ו-in-vivo. בפרט, פולימרים מצומדים מציגים מספר תכונות אופטימליות כמצעים למערכות ביולוגיות, כגון תאימות ביולוגית טובה, תכונות מכניות מצוינות, טכנולוגיית עיבוד זולה וקלה, ואפשרות לתצהיר על מצעים קלים, דקים וגמישים. חומרים אלה שימשו לממשקים תאיים כמו בדיקות עצביות, טרנזיסטורים לעירור ורישום של פעילות עצבית, חיישנים ביולוגיים ומפעילים לשחרור תרופות. ניסויים אחרונים הדגימו גם את האפשרות להשתמש בפולימרים מצומדים לאפנון אופטי של הפעילות החשמלית של תאים. דווח על מספר מקרי מחקר במבחנה, כולל רשתות עצביות ראשוניות, אסטרוציטים ותאי קו משניים. יתר על כן, הוכח כי העברת אותות בתיווך פולימרים אורגניים מחזירה את הרגישות לאור ברשתית מנוונת, מה שמרמז על כך שמכשירים אלה עשויים לשמש לתותבת רשתית מלאכותית בעתיד. בסך הכל, פולימרים מצומדים רגישים לאור מייצגים גישה חדשה לאפנון אופטי של פעילות תאית.

בעבודה זו מתוארים כל השלבים הנדרשים לייצור ממשק ביו-פולימר לעירור אופטי של תאים חיים. תפקידו של הממשק הפעיל הוא להמיר את גירוי האור לאפנון של פוטנציאל קרום התא. כמקרה מחקר, שימושי למחקרים במבחנה, סרט דק מפוליתיופן משמש כשכבה הפונקציונלית וסופגת האור, ותאי כליה עוברית אנושית (HEK-293) משמשים כמרכיב הביולוגי של הממשק. ניתנות דוגמאות מעשיות לשליטה מוצלחת בפוטנציאל קרום התא בעת גירוי עם פולסי אור במשכים שונים. בפרט, הוכח כי ניתן להשיג השפעות דה-פולריזציה והיפרפולריזציה על קרום התא בהתאם למשך גירוי האור. הפרוטוקול המדווח הוא בעל תוקף כללי וניתן להרחיב אותו ישירות לתכשירים ביולוגיים אחרים.

מבוא

האפשרות לתפעל את הפעילות הסלולר עם רזולוציה מרחב ובזמן מדויקת מייצגת אסטרטגיה מרכזית במחקר נירולוגית מדעי ובטיפול בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. ¹ שיטות מסורתיות מבוססות על גירוי חשמלי של תאים באמצעות אלקטרודות הממוקמים בקרבה או במגע עם המערכת ממוקדת, ² אשר יכול להיות שונות של מורכבות (תא בודד, רשת סלולרית, פרוסות מוח, ב- vivo רקמות מוח). במאות השנים האחרונות, השימוש בתיקון מהדק, מתכת ואלקטרודות משולבות מצע סיפק תמונה מפורטת של הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של נוירונים בודדים ושל מנגנוני התפקוד של רשתות עצביות. עם זאת, גירוי חשמלי סובל ממגבלות חשובות. הראשון קשורה לרזולוציה מרחבית ירודה בדרך כלל עקב ממדיו הפיזיים של אלקטרודות והגיאומטריה הקבועה שלהם, שלא ניתן להתאים בקלותלמערכות מאורגנות מורכבות כמו רקמות ביולוגיות. כמו כן, בעיות הקשורות לעכבת אלקטרודות ודיבורים צולבים בין מערכות גירוי והקלטה עלולות להידרדר יחס אות לרעש הסופי של המדידות. ³ מצד השני, השימוש באור לגירוי עשוי לעזור להתגבר על מגבלות רבות של גישת החשמל. קודם כל, היא מציעה מרחבי חסרי תקדים (<1 מיקרומטר) ורזולוציה של זמן (אלפיות שנייה <1), מה שמאפשר למקד סוגי תאים ספציפיים או אפילו תאים תת-תא. בנוסף זה מאוד לא פולשנית שכן הוא נמנע מכל מגע פיזי עם הרקמה של עניין ומתיר גירוי מהקלטה. יתר על כן, שתי עוצמת אור באורך גל ויכולים להיות מוסדר דווקא וניתן ליישם פרוטוקולי גירוי כך מגוונים. ^3,4

עם זאת, הרוב המכריע של תאים של בעלי חיים אינו מציג שום רגישות ספציפית לאור. כמה אסטרטגיות לstimulatio אופטיn יש לי כך הוצע, או ניצול מתווכים מולקולריים רגיש לאור סמוך או בתוך התאים, או באמצעות מכשיר photoactive להציב חיצוני, קרוב לתא. הקטגוריה לשעבר מתייחסת למנגנונים אנדוגניים כמו הגירוי באמצעות אור נראה או אינפרא אדום (IR), כמו גם השימוש בשני תרכובות photoisomerizable / photocleavable או הביטוי הגנטי של מפעילים רגישים מולקולריים (optogenetics). הכיתה האחרונה כוללת טכניקות לגירוי אקסוגני שהושג עם השימוש של ננו / מיקרו-חלקיקים אורגניים או מצעי סיליקון photoconductive. ⁵ עם זאת, יש את כל המערכות הללו צדדים וחסרונות בהירים. בפרט, קליטת אנדוגני של תאים בטווח הנראה לעין היא חלשה ולא אמינה, והדור הנלווה של מיני חמצן מגיבים עלולה להזיק לתא. באופן כללי, IR משמש לגרימת חימום תרמי מקומי עקב ספיגת מים, אבל מקדם ההכחדה של מים הוא קטן, ולכן דורש stאור אינפרא אדום רונג (מעשרות עד מאות W / ² מ"מ) שקשה לספק באמצעות אופטיקה מיקרוסקופ הרגילה ועלולים להוות חששות בטיחות עבור יישומים ב- vivo. מצד השני, יש לי תרכובות כליאת צילום החלפה מוגבלת פעולה בזמן ולעתים קרובות דורשות אור UV שקשה לספק בשל חדירת רקמה מוגבלת. בנוסף הם סובלים מבעיות דיפוזיה של התרכובות מופעלות על photolysis מחוץ לאזור המואר. לבסוף, כלים optogenetic אפשרו למדענים לכוון תת-אוכלוסייה סלולרית ספציפית ותת-תאים והם מתפתחים במהירות כאחת הטכנולוגיות המרכזיות במחקר נירולוגית מדעי. עם זאת, החדרת מקטע DNA אקסוגני באמצעות וקטור ויראלי מעלה סוגיות בטיחות חשובות, במיוחד לאור האימוץ בחולים אנושיים. ^5,6 מסיבות אלה, מחקר על חומרים ומכשירים חדשים מסוגלים מניפולציה אופטית תא הוא נושא חם מאוד.

לאחרונה, רומןהגישה מבוססת על השימוש בפולימרים מצומדות רגיש לאור, יוכלו transduce גירוי אופטי ביעילות לאפנון של פעילות החשמלית של תאים, הוצעה. גירוי התא על ידי פולימר Photoexcitation (CSPP) טכניקה מנצלת תכונות רבות המאפשרים מפתח האופייני של מוליכים למחצה אורגניים: הם מהותי רגישים לאור בטווח הנראה לעין; ⁷ הם ביולוגית, רכים וconformable והגמישות המכנית שלהם מאפשרת ממשק אינטימי עם רקמה גם במבחנה וב- vivo ^8-10. חוץ מזה, הם יכולים להיות פונקציונליות בקלות טובה יותר להסתגל לממשק עם תאי חיים, ולאפשר לעירור ספציפי, חיטוט וחישת יכולות. ^11,12 יתר על כן, הם תומכים אלקטרוניים, כמו גם תחבורה יונית, שהופך אותם אידיאליים לשילוב ביולוגיה מודעת אלקטרוניקה. ^13,14 מעניין, הם יכולים לעבוד במצב פוטו, למנוע את הצורך ליישם F הטיה חיצוניאו גירוי אופטי תא יעיל. ¹⁵

האמינות של טכניקת CSPP כבר הוכיחה בעבר בכמה מערכות, כוללים נוירונים עיקריים, ^15,16 האסטרוציטים, ¹⁷ קווים משניים תא ¹⁸ ורקמות רשתית explanted. ¹⁶ בעבודה זו, בכל הצעדים הדרושים כדי להמציא ביו-פולימר רגיש לאור ממשק ¹⁹ לגירוי אופטי של מערכות ב- מבחנה מתואר בפירוט. כמקרה מבחן, תערובת פוטו אורגנית טיפוסית של האזור-רגיל פולי (3-hexylthiophene) (RR-P3HT), מתפקד כתורם אלקטרונים, ואסתר פניל-C61-butyric-חומצה-מתיל (PCBM), הפועל כ מקבל אלקטרונים הוא מועסק. כמערכת הביולוגית, תאי כליה העוברית אנושי (HEK-293) משמשים. דוגמא לפרוטוקול photostimulation עם ההקלטה היחסית של פעילות תאים באמצעות מדידות אלקטרו מסופקת.

הפלטפורמה תיארהעם זאת תוקף כללי, וניתן להאריכה בקלות לשימוש בפולימרים מצומדות אחרים (על ידי התאמת תהליך פתרון ההכנה ופרמטרי התצהיר כראוי), תאים מסוגים שונים (על ידי שינוי כראוי פרוטוקול תרבית תאים, ציפוי הליך ושעה רצוי לזריעת תאים והתפשטות) ופרוטוקולים שונים גירוי (אורך גל אור, תדירות ומשך זמן גירויים, צפיפות photoexcitation).

פרוטוקול

1. הכנת מצעי photoactive

1. הכן P3HT: פתרון PCBM (1: 1 w / w) בchlorobenzene בריכוז P3HT של 20 גרם / ליטר. מערבבים את הפתרון עם בוחש מגנטי לפחות 4 שעות ב 60 ° C. שקול נפח של 150 μl של פתרון לכל מצע להיות מוכן.
2. שקופיות נקיות מצופה איטו זכוכית _(ים R = 10 Ω / מ"ר, 18x18 מ"מ ^2, 170 מיקרומטר העובי) עם אמבטיות רצופות של מים ללא יונים, אצטון וisopropanol בsonicator (10 דקות לכל שלב). יבש coverslips עם אקדח חנקן. שים את הדגימות בשואב פלזמה ב 100 כוח W במשך 10 דקות.
3. להפקיד סרט דק של השכבה הפעילה במצעים ניקו באמצעות ספין ציפוי.
   1. עם טיפ יהלום, לחתוך שקופיות זכוכית מיקרוסקופ, (עובי ≈ 1 מ"מ) לאותו ממדי רוחב של מצעים מצופים איטו. הסר את P3HT: פתרון PCBM מהפלטה החשמלית ולתת לו להתקרר לטמפרטורת סביבה.
   2. להגדיר שני-stתכנית eps ספין coater: i) 30 שניות ב 800 סל"ד; ii) 30 שניות ב1,600 סל"ד. מניחים את השקף על צ'אק של הספין-coater ולהתחיל הוואקום כדי לתקן את זה. לשים טיפה של אצטון בשקופית ולאחר מכן המצע ניקה, עם הצד מצופה איטו יפנה כלפי מעלה. התחל את סיבוב הספין coater להיפטר מעודף אצטון.
   3. שים 150 μl של P3HT: פתרון PCBM על מצעים ולהתחיל שוב את הספין-coater (משתמש באותו הפרוטוקול מתואר ב1.3.2).
   4. לאחר הספין-coater סיים, להסיר את המדגם ולנתק את המצע המצופה משקופיות הזכוכית בזהירות. נקה את החלק האחורי של המצע עם ספוגית חדר נקי הטבולה באצטון.
      הערה: מצעי photoactive יכולים להיות מאוחסנים במשך כמה ימים בקופסא חשוכה עד שימוש. לתקופות ארוכות יותר, לשמור אותם בתא כפפות עם גז אינרטי.

2. הכנת פתרונות תרבית תאים בינוניים ואלקטרופיזיולוגיה

1. הכן את המדיום מלא צמיחה (CGM) לHEK-293 תאים: השתנה Dulbecco בינוני של הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) לא לחמם מומת, 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. לעקר בינוני עם מערכת סינון 0.2 מיקרומטר וחנות על 4 מעלות צלזיוס.
2. הכן את הפתרון תאי במי ultrapure (ריכוזים במ"מ): 135 NaCl, 5.4 KCl, 5 HEPES, 10 גלוקוז, 1.8 CaCl _2, 1 MgCl _2. התאם ל- pH 7.4 עם NaOH. לעקר את הפתרון עם מערכת סינון 0.2 מיקרומטר וחנות על 4 מעלות צלזיוס.
3. הכן את הפתרון תאיים במי ultrapure (ריכוזים במ"מ): 12 KCl, 125 K-Gluconate, 1 MgCl _2, 0.1 CaCl _2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na _2. שים לב שה- ATP-Na ₂ הוא רגיש לחום ולהוסיף אותו אחרון. התאם ל- pH 7.4 עם NaOH. לעקר את הפתרון עם מערכת 0.2 מיקרומטר סינון, aliquot ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C.

3. HEK-293 תאי ציפויעל מצעים הפעילים

1. מניחים את מצע photoactive בכוס זכוכית מכוסה באלומיניום או בצלחת פטרי סגורה ולשים בתנור על 120 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לעיקור. מרגע זה ואילך, לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים. שים את הדגימות במנדף סטרילי ולתת להם להתקרר.
2. מעיל מצע photoactive עם שכבת הדבקה כדי להפחית את הידרופוביות פני השטח ולקדם הידבקות תא.
   1. מניחים את מצעים הפעילים בצלחת פטרי P35 או צלחת multiwell 6. בהתחשב בהידרופוביות של שכבת הפולימר מצומדות, לעשות polydimethylsiloxane (PDMS) גם כדי לתקן את המדגם ולהגביל את הפתרונות.
      1. מערבבים PDMS וזרז ב- 10: חלק 1 עם מוט זכוכית להשיג slurry צמיג.
      2. יוצקים את slurry בצלחת multiwell 6, מחלק כמות מספקת לכיסוי מחצית מכל הטוב.
      3. חכה לפילמור PDMS ב RT.
      4. חותך את PDMS נרפא באמצע לobtaining צורת ריבוע של אותו הממד של מדגם הפולימר.
      5. לעקר את בארות PDMS על ידי טבילה בתערובת של 70% אתנול-מים לפחות 30 דקות.
   2. אם באמצעות PDMS גם, לגרד את שכבת photoactive לאורך כל הגבול של היטב עם פינצטה המחודדת, על מנת להימנע מניתוק של כל השכבה בעת הסרת PDMS גם לאחר culturing התא.
   3. מכסה את כל פני השטח של כל דגימה עם פתרון פיברונקטין (2 מ"ג / ליטר בPBS). נפח בין 500-750 μl לדגימה הוא בדרך כלל מספיק אם PDMS גם משמש (משטח ברור של באר: מ"מ 15x15 ^2). ללא PDMS גם, על 2 מיליליטר של פתרון פיברונקטין נחוץ כדי לטבול את המדגם לחלוטין; לשים לב שהמצע לא לצוף תוך הוספת הפתרון. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1.
   4. הסר את פתרון פיברונקטין עם טפטפת זכוכית ולשטוף פעם אחת עם 2 מיליליטר של PBS.
3. Plאכלתי HEK-293 תאים בדגימות שטופל פיברונקטין בצפיפות של 15,000 תאים / ² סנטימטר במדיום גידול שלם. השתמש בנפח של 750-1,000 μl של CGM עבור כל דגימה אם PDMS גם משמש, אחרת 2-3 מיליליטר של CGM נחוצים. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ל24-48 שעות.

4. מדידות אופטיות גירוי פרוטוקול ואלקטרו

1. שים את הפתרון תאי באמבט מים ב 37 ° C לthermalize; להפשיר את הפתרון תאיים, לשים אותו במזרק 1 מיליליטר עם מחט 34 מד ולשמור אותו במגע עם קרח, כדי למנוע השפלה של ATP.
2. קח מצע מצופה תא מן החממה, הסרת PDMS בזהירות גם אם קיימים. הסר את מדיום גידול עם טפטפת זכוכית ולשטוף את המדגם עם פתרון תאי. להתקדם לאט, כדי למנוע ניתוק תא.
3. להעביר את המכשיר לדוגמה-בעל תחנת אלקטרופיזיולוגיה עם solutio תאיn ואת האלקטרודה ההתייחסות. הכן micropipettes זכוכית הטרי לתיקון מהדק עם חולץ (התנגדות אידיאלית הוא בטווח 2-4 MΩ). מלא חצי של פיפטה עם פתרון תאיים ולהעלות אותו על micromanipulator.
4. חפש תא בריא לתיקון במכשיר. כדי להימנע מעירור לא רצוי של מצע photoactive, להשתמש תאורת IR עבור הדמיה, הצבת מסנן ארוך גל לעבור (לדוגמא, λ = 750 ננומטר אורך גל חתך יכול לשמש לקליטת פולימרים בגלוי) מול נורת מיקרוסקופ.
5. תיקון התא הנבחר ולהחיל את הפרוטוקול הרצוי לגירוי אופטי על ידי מתן אור למדגם דרך השביל עירור הקרינה של מיקרוסקופ (איור 1). ניתן למצוא תיאור מפורט של פרוטוקול תיקון מהדק בהתייחסות 20.
   1. מקם את פיפטה התיקון בקרבת קרום התא עם מניפולטור מיקרומטרי. במהלך המיצוב, להחיל overpressurדואר לפיפטה כדי למנוע הידבקות לכלוך על הקצה. פיפטה צריכה להיות כמה מיקרונים מעל התא.
   2. התחל הורדת פיפטה לעבר קרום התא תוך שליטה על התנגדות פיפטה בתוכנת שליטת תיקון. כאשר התנגדות פיפטה גדלה על 1 MΩ, להסיר את לחץ היתר מפיפטה תוך יישום שאיבה עדינה, כדי ליצור את gigaseal בין פיפטה וקרום התא (כלומר, ההתנגדות הנמדדת צריכה להגדיל בערכים גדולים מ -1 GΩ) .
   3. החל פוטנציאל שלילי לפיפטה הקרובה לתא הצפוי פוטנציאל מנוחה (לHEK293 תא פוטנציאל של -40 יכול לשמש mV) כדי לעזור לייצב את החותם. לפצות ארעיים קיבולי בשל קיבול פיפטה עם פקודות יחסי על מגבר התיקון ו / או תוכנת שליטת תיקון.
   4. לשבור את הקרום כדי לאפשר גישת חשמל לציטופלסמה התא על ידי החלת דופק יניקה קצרה ואינטנסיבילפיפטה. הגדר את מגבר התיקון למצב הנוכחי מהדק (אני = 0, כלומר, ללא נוכחית מוזרק לתוך התא) כדי לעקוב אחר פוטנציאל קרום תא. חכה כמה דקות כדי לראות אם פוטנציאל התא הוא יציב.
   5. החל פרוטוקול התאורה הרצויה לתא ולהקליט את ההשפעה על פוטנציאל הממברנה.
      הערה: התאורה יכולה להיות מועברת למדגם או מלמטה או מלמעלה, בהתאם לארכיטקטורת מיקרוסקופ.
      1. בחר גל עירור שנספג היטב על ידי החומר הפעיל; לP3HT: תערובת PCBM, ניתן להשתמש באורך גל בטווח 450-600 ננומטר. צפיפות photoexcitation מתאימה נמצאות ב10-100 mW / מ"מ הטווח ^2.
         הערה: פולסים קצרים של אור (להלן 10-20 אלפיות שנייה) תוצאה בשלילת קוטביות חולפת של התא, ואילו עם תאורה ממושכת (מאות אלפיות שנייה או פולסים ארוכים יותר) hyperpolarization מתמשך הוא ציין עד האור כבוי.

תוצאות

תאים יכולים להיות בקלות בתרבית על P3HT: מצעי PCBM, ובלבד ששכבת הדבקה מתאימה מופקדת (כמו פיברונקטין משמש בשלב 3.2 של הפרוטוקול המתואר). פסגות קליטה אופטי PCBM בחלק הירוק של הספקטרום הנראה;: P3HT עם זאת ניתן לבחור פולימרים מצומדות רגישים לאור אחרים, בהתאם לטווח אורכי גל photostimulation המועדף (איור 2). התאמה ביולוגית של מצעים אלה כבר הוכיחה לא רק עם שורות תאים ^18,21 כמו HEK-293, אבל גם עם תרבויות עיקריות של נוירונים ^...

דיון

שלבים קריטיים של הפרוטוקול דיווח ב- מבחנה גירוי אופטי של תאים בעיקר נוגע לבחירה של הפולימר רגיש לאור, פרמטרים עיקור התרמיים, העצמה והמשך הזמן של גירויי אור. P3HT: סרט דק PCBM נבחר כאן, שכן הוא מבטיח יציבות זמנית ואלקטרוכימיים טובה. עם זאת, יש לשים לב שלא כל הפולימרים הרגישים לאור יכולים להציע הופעות אנלוגיות, ²² באופן ספציפי יותר על תאורה. בנוסף, במקרה זה נבחר עיקור תרמית פרמטרים לא יובילו להשפלה גדולה של תכונות אופטו פולימר; הודעה, עם זאת, במקרה שיטת העיקור או...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
מצעים מצופים ITO	Nano-CS	IT10300100
פיברונקטין	סיגמא אולדריץ'	F1141
כלורובנזן	סיגמא אולדריץ'	319996
PCBM	Nano-C Nano-CPCBM-BF
אצטון	סיגמא אולדריץ'	270725
אלכוהול איזופרופיל	סיגמא אולדריץ'	563935
תאי	HEK תקני LGC srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	סיגמא אולדריץ'	H0887
PBS	סיגמא אולדריץ'	P5244
E-MEM	LGC תקני	SRL ATCC-30-2003
EDTA	סיגמא אולדריץ'	E8008-FBS
	תקני LGC srl	ATCC-30-2020