שיבוט פונקציונלי שימוש Xenopus

Summary

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

Abstract

זיהוי גנים האחראים לאינדוקציה עוברית מציב מספר אתגרים; בין היתר, מולקולות מופרשות מעניינות עשויות להיות בשפע נמוך, עשויות שלא להיות מופרשות אלא קשורות לתאי האיתות, או עשויות לדרוש נוכחות של שותפים קושרים או מולקולות רגולטוריות במעלה הזרם. לפיכך, בחיפוש אחר תוצרי גנים המסוגלים לעורר תגובה אינדוקטיבית מוקדמת של עדשה באקטודרם מוכשר, השתמשנו במערכת שיבוט ביטוי שתאפשר זיהוי של גורמים פרקריניים או סמוכים כמו גם חלבונים שעתוק או רגולטוריים אחרים. בריכות של mRNA הוזרקו לביציות Xenopus, ורקמת תגובה הונחה ישירות על הביציות ותרבית משותפת. בעקבות שיבוט תפקודי של ldb1 מספריית cDNA בשלב צלחת עצבית בהתבסס על יכולתו לעורר את הביטוי של סמן הפלאקוד המוקדם של העדשה foxe3 באקטודרם כובע בעלי חיים בעל יכולת עדשה, אפיינו את דפוס ביטוי ה-mRNA, ובדקנו את ההתקדמות ההתפתחותית לאחר ביטוי יתר או נוק-דאון של ldb1. מערכת זו מתאימה במגוון רחב מאוד של הקשרים שבהם מחפשים זיהוי של משרה או מולקולות הרגולציה שלו במעלה הזרם באמצעות תגובה פונקציונלית ברקמה מוכשרת.

Introduction

גישות גנטיות קדימה לזיהוי גנים מעניינים באמצעות תפקודם או אובדן תפקודם^1,2 הן חלק בלתי נפרד מהבנת אירועי דפוס מורכבים בהתפתחות. בשילוב עם טכניקות גנטיות הפוכות עוצמתיות הזמינות למגוון הולך וגדל של מערכות וחוקרים^3-5, ניתן כעת לזהות גנים בעלי תפקיד תפקודי מרכזי במסלול ולאחר מכן להבהיר את התפקוד ברמה התאית ובאינטראקציה עם תוצרי גנים אחרים. גישה אחת לזיהוי פונקציונלי של גנים מעניינים שהניבה ממצאים מרכזיים רבים בעבר היא שיבוט ביטוי^6,7.

המטרה האחרונה שלנו⁸ הייתה לזהות גורמים אינדוקטיביים מוקדמים לעדשה, מכיוון שהוכח כי שלבים ראשוניים בתהליך השראת עדשות החולייתנים מתרחשים כבר בשלבי הקיבה. למטרה זו, השתמשנו באקטודרם של⁹ בעלי חיים בעלי יכולת ארעית (שלב 11-11.5¹⁰) של עוברי קסנופוס כרקמה מגיבה לאינדוקציה, ובביצית Xenopus שלב VI כמקור ייצור לגורמים המעוררים.

הפרוטוקול הבא מתבסס על פרוטוקולי שיבוט הביטויים ובחירת ה-sib של סמית והרלנד^6,7, ששימשו בהצלחה גם אחרים^11-13. במערכת ביטוי הביציות שלנו (ששימשה לראשונה לייצור גורמים מעוררים על ידי לוסטיג וקירשנר¹⁴), נבחרים ומזוהים מאגרי תעתיקים מוזרקים המסוגלים לגרום במישרין או בעקיפין לביציות לייצר גורמים המעוררים תגובה אינדוקטיבית לעדשה באקטודרם של כובע בעלי חיים. מכיוון שהמערכת שימושית לביטוי מולקולות מעוררות המופרשות ישירות (INHBB mRNA המוזרק על ידי ביצית גורם לאינדוקציה של מזודרם באקטודרם 8 של כובע בעלי חיים בעל יכולת מזודרם^), ציפינו במקור שהליך הסינון יהיה שימושי בעיקר לזיהוי גורמים פרקריניים. עם זאת, מכיוון שזיהינו גורם גרעיני במסך שלנו (ldb1⁸), ברור שניתן להשתמש במערכת כדי לזהות מגוון רחב של מולקולות כגון גורמי רגולציה שעתוק או תרגום, miRNAs, קופקטורים או גורמים סמוכים.

Protocol

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי אוניברסיטת וירג'יניה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

הערה: איור 1 מציג סקירה סכמטי של הפרוצדורות.

1. הכנת ביציות

1. X. טרום ראש laevis נקבות עם 150 U של הסוסה הרה סרום גונדוטרופין (PMSG) כשבוע מראש של בידוד ביצית. הזרק 1 מיליליטר 150 U PMSG / מיליליטר לצק הלימפה הגבי עם מזרק סטרילי 1 סמ"ק עם 29 מחט G.
2. הכן את הפתרונות להזרקת ביצית וביצית assay כובע-חיה.
   1. הכן Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ -חינם OR2 (OR2-): 82 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ Na ₂ HPO _4, 50 מ"מ HEPES pH 7.2.
   2. הכן OR2: OR2- בתוספת 1 ​​מ"מ CaCl ₂ ו 1 מ"מ MgCl _2.
   3. הכן OCM: 60% L15 ליבוביץ, 0.4 מ"ג / מיליליטר BSA, 100 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, pH 7.8.
   4. מִרֹאשׁלקלף MBS 1x: 88 מ"מ NaCl, 1 מ"מ KCl, 0.7 מ"מ CaCl _2, 1 מ"מ MgSO _4, 5 מ"מ HEPES (pH 7.8), 2.5 מ"מ NaHCO _3.
   5. הכן 3% Ficoll בMBS 1x.
   6. הכן NAM 1x: 110 מ"מ NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ Ca (NO _{3) 2,} 1 מ"מ MgSO _4, 0.1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ NaHCO _3, 2 מ"מ Na ₃ PO _4, pH 7.4.
3. להרדים את הנקבה בפתרון של 0.03% אתיל מלח methanesulfonate 3-aminobenzoate (MS222) ב0.1x MBS (לפזר MS222 0.3 גרם ב 10 מיליליטר אתנול 95% ראשון, ואז לדלל בL 1 MBS 0.1x) על ידי הצבת צפרדע בפתרון ל 10 - 15 דקות או עד שאינו מגיב.
   1. בדוק ההרדמה שהושלמה על ידי הפיכת צפרדע הרדים על הגב שלה, כדי להבטיח שלא מגיב (חלקי צפרדעים הרדים להזיז גפיים או להתהפך גוף).
4. ניתוח לבודד ברי השחלות על ידי ביצוע חתך בבטן דרך עור וקיר גוף עם להב סכין מנתחים, בידוד רקמת השחלה עם מלקחייםומספריים. מניחים שברי השחלות לOR2-. סגור את קיר הגוף עם תפר 3-0 משי על מחט מעוקלת 24 מ"מ ולסגור את העור בנפרד עם אותו התפרים. לאפשר התאוששות של נקבה במלח אקווריום 1 גרם / L במים.
5. באמצעות מלקחיים עדינים, רקמת השחלה מדמיע לתוך קטנות - חתיכות (10 20 ביציות) והעברה לOR2- הטרי.
6. שברי Defolliculate השחלות ב2.0 מ"ג / מיליליטר collagenase בOR2- על ידי התססה בעדינות על שייקר לשעה 1, העברה לcollagenase הטרי והתססה לשעה אחת נוספת.
7. לשטוף ביציות 10 פעמים בOR2 [המכילות Ca ⁺⁺ / Mg ^++], השלכת ביציות קטנות יותר.
8. לשטוף ביציות בOCM שתי פעמים ולהעביר לOCM הטרי. לבודד ביציות השלב השישי בגודל על בדיקה ויזואלית וזורקי ביציות לא בשלות (קטנות יותר): ביציות השלב השישי הן גדולות יותר מביציות לא בשלות עם פיגמנטציה אפילו בחצי כדור בעלי החיים וכ 1.2-1.4 מ"מ בקוטר.
9. לשמור על ביציות בגיל 18 - אני C ° 20n OCM לפני ההזרקה. הערה: צלחות פטרי מצופה Agarose ניתן להשתמש כדי למזער דבק של ביציות לצלחת.

2. הזרקה של תמלילי הספרייה

1. הכן RNA באמצעות ספריית cDNA כיוונית ¹⁵ חולץ בשלב מתאים של פיתוח (לדוגמא, שלב צלחת עצבית 14 ^10). לרכוש ספריית cDNA או לבנות אחד באמצעות ערכה מסחרית לסקירה בארבעה השלבים הבאים.
   1. לבודד כ 5 מיקרוגרם mRNA על ידי שימוש במוצר להעשרה לפולי () + RNA (ראה טבלה של חומרים) והבאים הוראות יצרן. הערה: התמלילים לשמש כדי לייצר ספריית cDNA עשוי להיות מוגבלת לרקמת התרמה (כגון צלחת העצבית, הבאים microdissection של הרקמה הרצויה), או יכולים להיות מכל עוברים בשלב מסוים.
   2. לייצר cDNA עם ערכה מסחרית, הבא הוראות יצרן.
   3. ולקשור כ 20 ng cDNA לתוך vector כלול בערכה המסחרית או אחר וקטור מתאים. וקטור פלסמיד מתאים כולל רצפים ליציבות mRNA כגון 5 'β-גלובין ורצפי 3 פולי (א) (pCS2 +, pTnT, pCS105).
   4. להפוך קשירה לתאי חיידקים המוסמכים באמצעות הפרוטוקול המומלץ של ספק לשינוי הלם חום.
      הערה: לחלופין, אוסף של שיבוטים מסגרת קריאה פתוחה (ORFeome) הוא זמין באופן מסחרי וניתן להשתמש כדי ליצור תעתיקים להזרקה.
2. הכן 10 בריכות של פלסמידים של ¹⁰ מרס - 10 אפריל מורכבות ⁽¹⁰ אפריל - 10 מאי מורכבות כוללת). זה מייצג 10 צלחות עם 1,000 - 10,000 מושבות כל אחד.
   1. ספריית צלחת תרבות על 10 צלחות LB-אמפיצילין 15 ס"מ, לגדול 12-18 שעות ב 37 C, ולאסוף מושבות מכל על ידי לחץ עדין עם מפזר זכוכית ב -7 ליטראות מיליליטר
   2. הכן מלאי גליצרול מ0.5 מיליליטר (להוסיף לגליצרול סטרילי 0.2 מ"ל ולאחסן ב -20 ו730 #; ג), ולהשתמש ב6.5 מיליליטר שנותר להכין DNA עם ערכה סטנדרטית זמינה מסחרי DNA miniprep הבא הוראות יצרן.
3. Linearize DNA נקווה פלסמיד (1.0-2.0 ק"ג) עם הגבלה מתאימה אנזים עיכול ¹⁶ ב 37 C עבור 1-1.5 שעות. לבודד את ה- DNA לינארית עם חילוץ פנול / כלורופורם ואחריו משקעים אתנול וresuspension במים למפרט של ערכת RNA פולימראז משמשת. לסנתז RNA תחושה עם ערכת RNA פולימראז מסחרית הבאים הוראות יצרן.
4. הכן מחטים עבור microinjection (באמצעות חולץ מחט עם צינורות זכוכית נימים) של כ 20 מיקרומטר קוטר; למדוד טיפים מחט במיקרוסקופ מתחם עם מיקרומטר עיני מכויל. הערה: הגדרות חולץ מחט חייבת לקבוע באופן אמפירי כדי לייצר מחט עם קצה קנס כזה שכאשר נשבר עם מלקחיים עדינים מניב גודל הקצה הרצוי.
5. הכן (לדחוף חימר לשכבה אחידה על תחתית הצלחת) 35 x 10 מ"מ צלחות פטרי עם חריצים מקבילים להחזיק ביציות במקום במהלך microinjection מרופד חימר; לייצר חריצים עם בדיקה קניון או פיפטה פסטר התמזגה בקצה בלהבה. כחלופה לחימר, להכין מנות agarose עושים חריצים עם עובש אלסטומר ^17. העברת ביציות עם טפטפת רחב נשא לFicoll 3% בMBS 1X (כ 2 מיליליטר) בשורות במנות עטורות חימר.
6. שימוש microinjector, למלא מחט עם 1 ננוגרם / RNA NL ולכוון את האיזון כדי לייצר לחץ חיובי קל (כדי למנוע עריכת של ציטופלסמה ביצית).
7. הזרק ביציות עם כ 20 RNA NL באזור הקו המשווה. הרשה שעה 1 לביציות מוזרקות להישאר בFicoll-MBS, ולאחר מכן להעביר בעדינות לMBS 1x. דגירה עבור 8 - 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לפני assay כובע בעלי החיים.

3. בעלי החיים קאפ Assay

1. הכן 3 / 4x NAM ולהשיג מלקחיים עדינים, שיער לולאה, שברי coverslip מעוקלים, דיס-מצופה חימרהס עם חריצים בצורת כוס להחזיק ביציות. הפוך ברי coverslip מעוקלים על ידי מתפרק coverslips זכוכית לרסיסים קטנים (1 כ - 2 מ"מ x 2 - 4 מ"מ) ועובר דרך להבה עד קצוות פולני ולצנוח, הפקת חתיכה מעוקלת.
2. לדשן X. laevis ביצים ¹⁸ דרך במבחנה או הזדווגות ותרבות לgastrula שלבים טבעיות (10 - 11 שעות לאחר הפריה בRT) ב0.1x MBS לפני המיון לפי שלב; לאסוף אמצע gastrula (שלב 11-11.5) ¹⁰ עוברים.
3. העברה עובר לצלחת פטרי כ חצי מלא עם 3 / 4x NAM. שימוש בשני זוגות של מלקחיים בסדר, להסיר את קרום הפריה (vitelline) מgastrulae.
4. העברת ביציות כדי 3 / 4x NAM (כ 2 מיליליטר) במנות עטורות חימר ולשתק בהופעות בודדות בחימר, הפקת הופעות כדי להכיל עוברי אדם כחריצים תוארו לעיל.
5. העברה עובר לכלים מצופה חימר ולחתוך כובעי בעלי חיים מזastrulae באמצעות שני זוגות מלקחיים בסדר. דואג לבודד את האאקטודרם כובע חיה רקמה המשוונית בלבד ולא ^18.
6. הנח כובע בעלי חיים בחצי כדור החיה של כל ביצית עם המשטח הפנימי של כובע החיה פנייה הביצית. החזק recombinants יחד על ידי יישום בר coverslip זכוכית מעוגלת והפעלת לחץ כלפי מטה על הזכוכית, משטח את האאקטודרם כאנשי קשר coverslip החימר (כובעי בעלי חיים יכולים להישאר פתוח עם השכבה הפנימית החשופה על פני השטח של הביצית ל6 - 8 שעות או יותר ).
   הערה: לחלופין, למקם את כובע החיה לכניסת חימר עם המשטח הפנימי שלה פונה כלפי מעלה ומניח את ביצית בכובע; לאבטח את רקומביננטי עם סיומות קטנות של חימר.
7. תרבות בC ° 20 עד עוברי שליטה להגיע רצוי שלב עבור assay.
8. רקומביננטי נפרד על ידי הסרת coverslip / חימר ובידוד האאקטודרם עם מלקחיים ושיער לולאה.
9. תקן שברי ectodermal עבור שעה 1 בMEMFA (3.8%פורמלדהיד בממ [0.1 M pH 7.4 מגבים, 2 מ"מ EGTA, ו 1 מ"מ MgSO _4]).
10. שברי העברה (ועוברים בקרה) מMEMFA לתוך אתנול והחנות ב -20 מעלות.

4. ניתוח של תגובה בהאאקטודרם על ידי אתר בהכלאה (עורך)

1. הכן את הפתרונות לאיש.
   1. הכן 1x PBS: 0.01 מלוח M פוספט שנאגרו, NaCl 0.138 M, pH 7.4
   2. הכן PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0.1% Tween-20
   3. הכן את הפתרון של 100x Denhart: BSA 2%, polyvinylpyrrolidone 2%, 2% Ficoll
   4. הכן הכלאה הצפת: 50 Formamide%, 5x SSC, 1 מ"ג / מיליליטר torula שמרי RNA, 1 מיקרוגרם / מ"ל הפרין, הפתרון של 1x Denhart, 0.1% Tween-20, 0.1% בחורים, 10 מ"מ EDTA, DEPC-H ₂ O
   5. הכן חומצהמאלית הצפת (MAB): חומצת maleic 100 מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 7.5
   6. הכן MAB + בלוק: MAB, 2% חסימה מגיב (חום עד 60 ג 'ללפזר)
   7. הכן אלקליין phosphatase (AP) מאגר: 100 מ"מ טריסpH 9.5, 50 מ"מ MgCl _2, 100 מ"מ NaCl, Tween 0.1%, DH ₂ O
2. הכן את הבדיקה RNA.
   1. באמצעות ערכת RNA פולימראז מסחרית ולחפור-NTP לערבב, להוסיף לצינור 1.5 מיליליטר (50 תגובת μl): DEPC-H 25.5 μl ₂ O, 10 μl 5X תמלול הצפת, 2.5 μl תערובת 10x חפירה-NTP, 5 μl 100 מ"מ DTT, 2 μl RNAsin, 2 μl תבנית ה- DNA לינארית (~ 1 מיקרוגרם / μl), 3 μl RNA פולימראז ודגירת 37 צלזיוס למשך 90 דקות.
   2. הוסף 2 μl RNA פולימראז ודגירה 37 צלזיוס למשך 60 דקות.
   3. בדוק 2 μl של תגובה על 1% agarose ג'ל.
   4. להוסיף RNase ללא DNase RQ1 μl 1 דגירה 37 צלזיוס למשך 20 דקות.
   5. לזרז את הבדיקה על ידי הוספת 50 μl DEPC-H ₂ O, 25 μl 10 M אמוניום אצטט וμl 313 אתנול. חנות ב -20 מעלות למשך לילה (O / N) ולאחר מכן לשחזר RNA על ידי צנטריפוגה ב13800 XG במשך 20 דקות. לשטוף עם 500 אתנול 75% μl, ספין בקצרה, להסיראתנול ולאפשר גלולה לייבוש באוויר. הוסף 50 μl DEPC-H ₂ O.
   6. להוסיף הכלאה הצפת לריכוז סופי של ~ 0.5 מיקרוגרם / μl.
3. הכן רקמות לכלאה. אלא אם צוין אחרת, למלא בקבוקונים לראש עם כל שינוי פתרון מתואר (כ 4 מיליליטר).
   1. הסר אתנול מבקבוקונים ועוברי העברה לאתנול 75% / PTW, אז 50% אתנול / PTW במשך 10 דקות כל אחד, במאוזן על נדנדה.
   2. לשטוף שלוש פעמים בPTW במשך 5 דקות כל אחד על כיסא נדנדה.
   3. העבר עד 10 מיקרוגרם / טיפול proteinase K μl בPTW; צינורות רוק אנכי 15 דקות.
   4. יש לשטוף פעמיים 10 דקות כל אחד ב 0.1 7.8 M Triethanolamine pH - צינורות רוק אנכי.
   5. להוסיף 12.5 μl אנהידריד אצטית לצינורות ורוק אנכי 5 דקות. חזור עם אנהידריד אצטית 12.5 μl נוסף במשך 5 דקות.
   6. לשטוף בPTW 5 דקות אנכית על נדנדה.
   7. Refix ב -4% דקות paraformaldehyde 20 על כיסא נדנדה. חום הכלאה הצפת60 ג.
   8. לשטוף שלוש פעמים בPTW במשך 5 דקות כל אחד על כיסא נדנדה.
   9. הסר את כל אבל ~ 1 מיליליטר של PTW מצינור אחד ולהוסיף 250 היב הצפת μl; בעדינות מערבולת צינורות לערבב. צינורות רוק אנכי 5 דקות.
   10. החלף עם C 60 היב מאגר (0.5 מיליליטר) ולהתסיס בעדינות על 60 ג '10 דק'. החלף עם טרי היב הצפת ולהתסיס בC 60 שנים עד 4 שעות.
   11. בדיקה חום (1 ​​מיליליטר ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl בהיב מאגר) עד 60 C (3 דקות). הסר היב מאגר ולהוסיף בדיקה לצינורות. להתסיס בעדינות O / N ב 60 ג.
4. הכן רקמות לנוגדן.
   1. 0.1% Tween-20 פתרונות היב מאגר חם ו2x SSC + 60 ג.
   2. החלף פתרון בדיקה עם היב הצפת (להציל את הבדיקות ב -20 מעלות במשך 2 - 3x שימוש חוזר). לשטוף ב 60 צלזיוס למשך 10 דקות.
   3. לשטוף שלוש פעמים ב -60 C ב2x SSC-Tween (20 דקות כל אחד עם תסיסה).
   4. לשטוף שלוש פעמים ב -60 C ב0.2X SSC-Tween (20 דקות כל אחד עם תסיסה).
   5. לשטוף פעמיים בMAB (RT) במשך 15 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
   6. להוסיף MAB מיליליטר 1 + בלוק. לשטוף 2 שעות אנכית על נדנדה.
   7. העברה לMAB מיליליטר 1 + בלוק המכיל 1 / 2,000 אנטי-digoxygenin-AP. רוק אנכי ב 4 CO / N.
5. הכן רקמות לצבע מגיב.
   1. החלף פתרון נוגדן עם MAB; לשטוף שלוש פעמים בMAB 5 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
   2. לשטוף שלוש פעמים בשעה MAB 1 כל אופקי על נדנדה.
   3. לשטוף פעמיים בAP הצפת 10 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
   4. העבר את רקמות ולמרובה-מגש פלסטיק, להסיר ולהוסיף AP מאגר בע"מ מגיב סגול (~ 1 מיליליטר). לאפשר תגובה להמשיך בדקות 5 כהות לO / N.
   5. כאשר הצביעה מתאימה מושגת, להעביר רקמות לבקבוקונים של PTW. לשטוף פעמיים 10 דקות כל אחד בPTW על נדנדה.
   6. לתקן בפתרון של Bouin ב 4 CO / N על נדנדה.
   7. לשטוף את Bouin של עם שלושה שוטף PTW / 30% אתנול 70% ב RT. המשך to לכידת תמונה באמצעות עלית תאורה ומצלמה רכוב מיקרוסקופ, הלבנה אם ¹⁸ דרושים.

5. Sib בחירה ושיבוט

1. בריכה בחר עם הפעילות הגבוהה ביותר (התגובה הגדולה ביותר ברקמת ectodermal).
2. לכיל (לדלל עם LB לצפיפות מתאימה) מניית גליצרול לבריכה עם הפעילות הגבוהה ביותר וצלחת את עשר צלחות חדשות עם כ עשירית מושבות מהשלב הקודם (באמצעות סעיף 2 בפרוטוקול לעיל).
3. להקטין את גודל בריכה עד הפעילות היא לייחס למושבה אחת.
4. להשיג רצף ה- DNA באמצעות פריימרים סטנדרטיים בווקטור.

Results

בתגובה לביטוי של mRNA מוזרק לתוך ביציות, להגיב רקמת כובע חיה assayed לביטוי של otx2 ידי הכלאה באתר (איור 2 ולוח 1); otx2 בא לידי ביטוי בהאאקטודרם העדשה המשוערת (PLE) מסגירת צינור עצבית באמצעות placode העדשה עיבוי ^19. עם זאת, מאז otx2 בא לידי ביטוי גם בהאאקטודרם הקדמי עצבי כמו גם האאקטודרם ראש שאינו עצבי מחוץ לPLE, זה קשור לשני עצבי ותגובות placodal. השימוש בfoxe3 להקרין את הספ...

Discussion

השיטה המתוארת כאן לשיבוט הפונקציונלי של גנים מסוגלים גרימת תגובה בהאאקטודרם מוסמך יכולה לשמש כדי לזהות מגוון רחב של מוצרי גן. שיטה זו מרחיבה על העבודה האחרונה על ידי שילוב של מבחני וישכנע רקמה עם טכניקות שיבוט ביטוי. אנו מנצלים את המסלולים המטבוליים של ביצית Xenopus כמקור לייצור של גרימת גורמים, במישרין או בעקיפין, לאחר הזרקת RNA. זה, בשילוב עם השימוש בשיטות שהוקמו לשיבוט גן של עניין ^6,7 באמצעות ביטוי של תמלילים שנוצרו מספריית cDNA או אוסף אחר של שיבוטים, מספק ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101	מחקרי התפתחות נוגדנים בנק היברידומה	12/101	נוגדן חד שבטי לזיהוי רקמת שריר
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	עבור ISH
אנהידריד אצטי	Sigma	A6404	עבור ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	עבור ISH
Aurum פלסמיד מיני קיט	Bio-Rad	732-6400	טיהור DNA פלסמיד
חסימת ריאגנט	Roche	11096176001	עבור ISH
BM סגול	Roche	11442074001	עבור ISH
Boekel Hybridization	Oven Fisher Scientific	13-245-121	עבור ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	עבור ISH
BSA	Sigma	A9647	עבור OCM
CHAPS	Sigma	C3023	עבור ISH
קולגנאז A	Roche	10103578001	דפוליקולציה של ביציות
ציסטאין	סיגמא	C121800	עוברי Dejelly
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	לתערובת
תיוג ISH Dig-RNA	Roche	11277073910	לבדיקות ISH
Dumont #5 מלקחיים	World Precision Instruments	500233	למעטפת Vitelline הסרה
אתיל 3-aminobenzoate	Sigma	A5040	MS222 חומר הרדמה
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	עבור הזרקת מדיה
פורממיד	Sigma	F9037	עבור ISH
Gentamicin sulfate	Sigma	G1914	עבור נימי
זכוכית	OCM מכשירי דיוק עולמיים	4878	3.5 אינץ' אורך, I, D, 0.530 מ"מ
בקבוקוני דגימת זכוכית	פישר סיינטיפיק	06-408B
לולאת			שיער מודבק בפיפטה פסטור למניפולציה של רקמות
מלח נתרן הפרין	סיגמא	H4784
למזרק ISH ננוליטר 2010	מכשירי דיוק עולמיים	ננוליטר 2010	מיקרו-מזרק נשלט על ידי מיקרו-מעבד
אוקיינוס	מיידי		מלח אקווריום 972433 קרולינה לשחזור צפרדעים
IRBG XGC Xenopus מאומת באורך מלא cDNA	מקור Bioscience	989_IRBG	cDNA library
צלחות LB Agar עם 100 ומיקרו; גרם/מ"ל Ampicillin	Teknova	L5004	150 מ"מ צלחות LB-Amp שנשפכו מראש לבחירת אחים
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB לאיסוף מושבות בבחירת sib מצלחות ודילול תרביות
ערכת בידוד mRNA מגנטי	New England BioLabs	S1550S	לבידוד של RNA מועשר בפולי (A)
חומצה מאלית	Sigma	M0375	עבור ISH
מיקרופיל מיקרומניפולטור ידני	מכשירים מדויקים בעולם	M3310R	מיקרומניפולטור ידני
מיקסר אגוזים	פישר מדעי	22-363-152	נדנדה ל-ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	חימר לכלי הזרקה וחיתוך
פוספט חוצץ	מלח סיגמא	P5368	עבור ISH
PMSG	Sigma	G4877	כדי לעורר את התפתחות הביציות
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	PVP40	עבור ISH
חולץ לתכנות	מכשירים דיוק עולמי	PUL-1000	חולץ מחט מיקרופיפטה
Proteinase K	Sigma	P6556	עבור ISH
pTnT וקטור	Promega	L5610	cDNA ספריית בניית
מערכת שילוב Riboprobe	Promega	P1450	במבחנה תמלול
Superscript ערכת בניית ספריית cDNA באורך מלא	Technologies	ערכת 18248013	לבניית ספריית cDNA
תפרים, 3-0 משי	Fisher Scientific	19-037-516	חוט תפר ומחט להסרת ביצית
Torula RNA	Sigma	R3629	עבור ISH
Triethanolamine	Sigma	T1502	עבור ISH
Tween 20	Sigma	P9416	עבור
ISH מערכת סינתזה אוניברסלית של RiboClone cDNA	Promega	C4360	ערכה חלופית לבניית ספריית cDNA
Xenopus שיבוטי כניסה מלאים של ORF - ORFeome שיתוף פעולה	מקור Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue תאים אולטרה-מוכשרים	Agilent Technologies	200150	תאים לטרנספורמציה של cDNA ספריה