הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיבוט פונקציונלי שימוש

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53518

⸱

30 בינואר 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Shepherd University, 2Department of Biology, University of Virginia

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

תקציר

זיהוי גנים האחראים לאינדוקציה עוברית מציב מספר אתגרים; בין היתר, מולקולות מופרשות מעניינות עשויות להיות בשפע נמוך, עשויות שלא להיות מופרשות אלא קשורות לתאי האיתות, או עשויות לדרוש נוכחות של שותפים קושרים או מולקולות רגולטוריות במעלה הזרם. לפיכך, בחיפוש אחר תוצרי גנים המסוגלים לעורר תגובה אינדוקטיבית מוקדמת של עדשה באקטודרם מוכשר, השתמשנו במערכת שיבוט ביטוי שתאפשר זיהוי של גורמים פרקריניים או סמוכים כמו גם חלבונים שעתוק או רגולטוריים אחרים. בריכות של mRNA הוזרקו לביציות Xenopus, ורקמת תגובה הונחה ישירות על הביציות ותרבית משותפת. בעקבות שיבוט תפקודי של ldb1 מספריית cDNA בשלב צלחת עצבית בהתבסס על יכולתו לעורר את הביטוי של סמן הפלאקוד המוקדם של העדשה foxe3 באקטודרם כובע בעלי חיים בעל יכולת עדשה, אפיינו את דפוס ביטוי ה-mRNA, ובדקנו את ההתקדמות ההתפתחותית לאחר ביטוי יתר או נוק-דאון של ldb1. מערכת זו מתאימה במגוון רחב מאוד של הקשרים שבהם מחפשים זיהוי של משרה או מולקולות הרגולציה שלו במעלה הזרם באמצעות תגובה פונקציונלית ברקמה מוכשרת.

מבוא

גישות גנטיות קדימה לזיהוי גנים מעניינים באמצעות תפקודם או אובדן תפקודם1,2 הן חלק בלתי נפרד מהבנת אירועי דפוס מורכבים בהתפתחות. בשילוב עם טכניקות גנטיות הפוכות עוצמתיות הזמינות למגוון הולך וגדל של מערכות וחוקרים3-5, ניתן כעת לזהות גנים בעלי תפקיד תפקודי מרכזי במסלול ולאחר מכן להבהיר את התפקוד ברמה התאית ובאינטראקציה עם תוצרי גנים אחרים. גישה אחת לזיהוי פונקציונלי של גנים מעניינים שהניבה ממצאים מרכזיים רבים בעבר היא שיבוט ביטוי6,7.

המטרה האחרונה שלנו8 הייתה לזהות גורמים אינדוקטיביים מוקדמים לעדשה, מכיוון שהוכח כי שלבים ראשוניים בתהליך השראת עדשות החולייתנים מתרחשים כבר בשלבי הקיבה. למטרה זו, השתמשנו באקטודרם של9 בעלי חיים בעלי יכולת ארעית (שלב 11-11.510) של עוברי קסנופוס כרקמה מגיבה לאינדוקציה, ובביצית Xenopus שלב VI כמקור ייצור לגורמים המעוררים.

הפרוטוקול הבא מתבסס על פרוטוקולי שיבוט הביטויים ובחירת ה-sib של סמית והרלנד6,7, ששימשו בהצלחה גם אחרים11-13. במערכת ביטוי הביציות שלנו (ששימשה לראשונה לייצור גורמים מעוררים על ידי לוסטיג וקירשנר14), נבחרים ומזוהים מאגרי תעתיקים מוזרקים המסוגלים לגרום במישרין או בעקיפין לביציות לייצר גורמים המעוררים תגובה אינדוקטיבית לעדשה באקטודרם של כובע בעלי חיים. מכיוון שהמערכת שימושית לביטוי מולקולות מעוררות המופרשות ישירות (INHBB mRNA המוזרק על ידי ביצית גורם לאינדוקציה של מזודרם באקטודרם 8 של כובע בעלי חיים בעל יכולת מזודרם), ציפינו במקור שהליך הסינון יהיה שימושי בעיקר לזיהוי גורמים פרקריניים. עם זאת, מכיוון שזיהינו גורם גרעיני במסך שלנו (ldb18), ברור שניתן להשתמש במערכת כדי לזהות מגוון רחב של מולקולות כגון גורמי רגולציה שעתוק או תרגום, miRNAs, קופקטורים או גורמים סמוכים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי אוניברסיטת וירג'יניה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

הערה: איור 1 מציג סקירה סכמטי של הפרוצדורות.

1. הכנת ביציות

  1. X. טרום ראש laevis נקבות עם 150 U של הסוסה הרה סרום גונדוטרופין (PMSG) כשבוע מראש של בידוד ביצית. הזרק 1 מיליליטר 150 U PMSG / מיליליטר לצק הלימפה הגבי עם מזרק סטרילי 1 סמ"ק עם 29 מחט G.
  2. הכן את הפתרונות להזרקת ביצית וביצית assay כובע-חיה.
    1. הכן Ca ++ / Mg ++ -חינם OR2 (OR2-): 82 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ Na 2 HPO 4, 50 מ"מ HEPES pH 7.2.
    2. הכן OR2: OR2- בתוספת 1 ​​מ"מ CaCl 2 ו 1 מ"מ MgCl 2.
    3. הכן OCM: 60% L15 ליבוביץ, 0.4 מ"ג / מיליליטר BSA, 100 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, pH 7.8.
    4. מִרֹאשׁלקלף MBS 1x: 88 מ"מ NaCl, 1 מ"מ KCl, 0.7 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgSO 4, 5 מ"מ HEPES (pH 7.8), 2.5 מ"מ NaHCO 3.
    5. הכן 3% Ficoll בMBS 1x.
    6. הכן NAM 1x: 110 מ"מ NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ Ca (NO 3) 2, 1 מ"מ MgSO 4, 0.1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ NaHCO 3, 2 מ"מ Na 3 PO 4, pH 7.4.
  3. להרדים את הנקבה בפתרון של 0.03% אתיל מלח methanesulfonate 3-aminobenzoate (MS222) ב0.1x MBS (לפזר MS222 0.3 גרם ב 10 מיליליטר אתנול 95% ראשון, ואז לדלל בL 1 MBS 0.1x) על ידי הצבת צפרדע בפתרון ל 10 - 15 דקות או עד שאינו מגיב.
    1. בדוק ההרדמה שהושלמה על ידי הפיכת צפרדע הרדים על הגב שלה, כדי להבטיח שלא מגיב (חלקי צפרדעים הרדים להזיז גפיים או להתהפך גוף).
  4. ניתוח לבודד ברי השחלות על ידי ביצוע חתך בבטן דרך עור וקיר גוף עם להב סכין מנתחים, בידוד רקמת השחלה עם מלקחייםומספריים. מניחים שברי השחלות לOR2-. סגור את קיר הגוף עם תפר 3-0 משי על מחט מעוקלת 24 מ"מ ולסגור את העור בנפרד עם אותו התפרים. לאפשר התאוששות של נקבה במלח אקווריום 1 גרם / L במים.
  5. באמצעות מלקחיים עדינים, רקמת השחלה מדמיע לתוך קטנות - חתיכות (10 20 ביציות) והעברה לOR2- הטרי.
  6. שברי Defolliculate השחלות ב2.0 מ"ג / מיליליטר collagenase בOR2- על ידי התססה בעדינות על שייקר לשעה 1, העברה לcollagenase הטרי והתססה לשעה אחת נוספת.
  7. לשטוף ביציות 10 פעמים בOR2 [המכילות Ca ++ / Mg ++], השלכת ביציות קטנות יותר.
  8. לשטוף ביציות בOCM שתי פעמים ולהעביר לOCM הטרי. לבודד ביציות השלב השישי בגודל על בדיקה ויזואלית וזורקי ביציות לא בשלות (קטנות יותר): ביציות השלב השישי הן גדולות יותר מביציות לא בשלות עם פיגמנטציה אפילו בחצי כדור בעלי החיים וכ 1.2-1.4 מ"מ בקוטר.
  9. לשמור על ביציות בגיל 18 - אני C ° 20n OCM לפני ההזרקה. הערה: צלחות פטרי מצופה Agarose ניתן להשתמש כדי למזער דבק של ביציות לצלחת.

2. הזרקה של תמלילי הספרייה

  1. הכן RNA באמצעות ספריית cDNA כיוונית 15 חולץ בשלב מתאים של פיתוח (לדוגמא, שלב צלחת עצבית 14 10). לרכוש ספריית cDNA או לבנות אחד באמצעות ערכה מסחרית לסקירה בארבעה השלבים הבאים.
    1. לבודד כ 5 מיקרוגרם mRNA על ידי שימוש במוצר להעשרה לפולי () + RNA (ראה טבלה של חומרים) והבאים הוראות יצרן. הערה: התמלילים לשמש כדי לייצר ספריית cDNA עשוי להיות מוגבלת לרקמת התרמה (כגון צלחת העצבית, הבאים microdissection של הרקמה הרצויה), או יכולים להיות מכל עוברים בשלב מסוים.
    2. לייצר cDNA עם ערכה מסחרית, הבא הוראות יצרן.
    3. ולקשור כ 20 ng cDNA לתוך vector כלול בערכה המסחרית או אחר וקטור מתאים. וקטור פלסמיד מתאים כולל רצפים ליציבות mRNA כגון 5 'β-גלובין ורצפי 3 פולי (א) (pCS2 +, pTnT, pCS105).
    4. להפוך קשירה לתאי חיידקים המוסמכים באמצעות הפרוטוקול המומלץ של ספק לשינוי הלם חום.
      הערה: לחלופין, אוסף של שיבוטים מסגרת קריאה פתוחה (ORFeome) הוא זמין באופן מסחרי וניתן להשתמש כדי ליצור תעתיקים להזרקה.
  2. הכן 10 בריכות של פלסמידים של 10 מרס - 10 אפריל מורכבות (10 אפריל - 10 מאי מורכבות כוללת). זה מייצג 10 צלחות עם 1,000 - 10,000 מושבות כל אחד.
    1. ספריית צלחת תרבות על 10 צלחות LB-אמפיצילין 15 ס"מ, לגדול 12-18 שעות ב 37 C, ולאסוף מושבות מכל על ידי לחץ עדין עם מפזר זכוכית ב -7 ליטראות מיליליטר
    2. הכן מלאי גליצרול מ0.5 מיליליטר (להוסיף לגליצרול סטרילי 0.2 מ"ל ולאחסן ב -20 ו730 #; ג), ולהשתמש ב6.5 מיליליטר שנותר להכין DNA עם ערכה סטנדרטית זמינה מסחרי DNA miniprep הבא הוראות יצרן.
  3. Linearize DNA נקווה פלסמיד (1.0-2.0 ק"ג) עם הגבלה מתאימה אנזים עיכול 16 ב 37 C עבור 1-1.5 שעות. לבודד את ה- DNA לינארית עם חילוץ פנול / כלורופורם ואחריו משקעים אתנול וresuspension במים למפרט של ערכת RNA פולימראז משמשת. לסנתז RNA תחושה עם ערכת RNA פולימראז מסחרית הבאים הוראות יצרן.
  4. הכן מחטים עבור microinjection (באמצעות חולץ מחט עם צינורות זכוכית נימים) של כ 20 מיקרומטר קוטר; למדוד טיפים מחט במיקרוסקופ מתחם עם מיקרומטר עיני מכויל. הערה: הגדרות חולץ מחט חייבת לקבוע באופן אמפירי כדי לייצר מחט עם קצה קנס כזה שכאשר נשבר עם מלקחיים עדינים מניב גודל הקצה הרצוי.
  5. הכן (לדחוף חימר לשכבה אחידה על תחתית הצלחת) 35 x 10 מ"מ צלחות פטרי עם חריצים מקבילים להחזיק ביציות במקום במהלך microinjection מרופד חימר; לייצר חריצים עם בדיקה קניון או פיפטה פסטר התמזגה בקצה בלהבה. כחלופה לחימר, להכין מנות agarose עושים חריצים עם עובש אלסטומר 17. העברת ביציות עם טפטפת רחב נשא לFicoll 3% בMBS 1X (כ 2 מיליליטר) בשורות במנות עטורות חימר.
  6. שימוש microinjector, למלא מחט עם 1 ננוגרם / RNA NL ולכוון את האיזון כדי לייצר לחץ חיובי קל (כדי למנוע עריכת של ציטופלסמה ביצית).
  7. הזרק ביציות עם כ 20 RNA NL באזור הקו המשווה. הרשה שעה 1 לביציות מוזרקות להישאר בFicoll-MBS, ולאחר מכן להעביר בעדינות לMBS 1x. דגירה עבור 8 - 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לפני assay כובע בעלי החיים.

3. בעלי החיים קאפ Assay

  1. הכן 3 / 4x NAM ולהשיג מלקחיים עדינים, שיער לולאה, שברי coverslip מעוקלים, דיס-מצופה חימרהס עם חריצים בצורת כוס להחזיק ביציות. הפוך ברי coverslip מעוקלים על ידי מתפרק coverslips זכוכית לרסיסים קטנים (1 כ - 2 מ"מ x 2 - 4 מ"מ) ועובר דרך להבה עד קצוות פולני ולצנוח, הפקת חתיכה מעוקלת.
  2. לדשן X. laevis ביצים 18 דרך במבחנה או הזדווגות ותרבות לgastrula שלבים טבעיות (10 - 11 שעות לאחר הפריה בRT) ב0.1x MBS לפני המיון לפי שלב; לאסוף אמצע gastrula (שלב 11-11.5) 10 עוברים.
  3. העברה עובר לצלחת פטרי כ חצי מלא עם 3 / 4x NAM. שימוש בשני זוגות של מלקחיים בסדר, להסיר את קרום הפריה (vitelline) מgastrulae.
  4. העברת ביציות כדי 3 / 4x NAM (כ 2 מיליליטר) במנות עטורות חימר ולשתק בהופעות בודדות בחימר, הפקת הופעות כדי להכיל עוברי אדם כחריצים תוארו לעיל.
  5. העברה עובר לכלים מצופה חימר ולחתוך כובעי בעלי חיים מזastrulae באמצעות שני זוגות מלקחיים בסדר. דואג לבודד את האאקטודרם כובע חיה רקמה המשוונית בלבד ולא 18.
  6. הנח כובע בעלי חיים בחצי כדור החיה של כל ביצית עם המשטח הפנימי של כובע החיה פנייה הביצית. החזק recombinants יחד על ידי יישום בר coverslip זכוכית מעוגלת והפעלת לחץ כלפי מטה על הזכוכית, משטח את האאקטודרם כאנשי קשר coverslip החימר (כובעי בעלי חיים יכולים להישאר פתוח עם השכבה הפנימית החשופה על פני השטח של הביצית ל6 - 8 שעות או יותר ).
    הערה: לחלופין, למקם את כובע החיה לכניסת חימר עם המשטח הפנימי שלה פונה כלפי מעלה ומניח את ביצית בכובע; לאבטח את רקומביננטי עם סיומות קטנות של חימר.
  7. תרבות בC ° 20 עד עוברי שליטה להגיע רצוי שלב עבור assay.
  8. רקומביננטי נפרד על ידי הסרת coverslip / חימר ובידוד האאקטודרם עם מלקחיים ושיער לולאה.
  9. תקן שברי ectodermal עבור שעה 1 בMEMFA (3.8%פורמלדהיד בממ [0.1 M pH 7.4 מגבים, 2 מ"מ EGTA, ו 1 מ"מ MgSO 4]).
  10. שברי העברה (ועוברים בקרה) מMEMFA לתוך אתנול והחנות ב -20 מעלות.

4. ניתוח של תגובה בהאאקטודרם על ידי אתר בהכלאה (עורך)

  1. הכן את הפתרונות לאיש.
    1. הכן 1x PBS: 0.01 מלוח M פוספט שנאגרו, NaCl 0.138 M, pH 7.4
    2. הכן PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0.1% Tween-20
    3. הכן את הפתרון של 100x Denhart: BSA 2%, polyvinylpyrrolidone 2%, 2% Ficoll
    4. הכן הכלאה הצפת: 50 Formamide%, 5x SSC, 1 מ"ג / מיליליטר torula שמרי RNA, 1 מיקרוגרם / מ"ל הפרין, הפתרון של 1x Denhart, 0.1% Tween-20, 0.1% בחורים, 10 מ"מ EDTA, DEPC-H 2 O
    5. הכן חומצהמאלית הצפת (MAB): חומצת maleic 100 מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 7.5
    6. הכן MAB + בלוק: MAB, 2% חסימה מגיב (חום עד 60 ג 'ללפזר)
    7. הכן אלקליין phosphatase (AP) מאגר: 100 מ"מ טריסpH 9.5, 50 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ NaCl, Tween 0.1%, DH 2 O
  2. הכן את הבדיקה RNA.
    1. באמצעות ערכת RNA פולימראז מסחרית ולחפור-NTP לערבב, להוסיף לצינור 1.5 מיליליטר (50 תגובת μl): DEPC-H 25.5 μl 2 O, 10 μl 5X תמלול הצפת, 2.5 μl תערובת 10x חפירה-NTP, 5 μl 100 מ"מ DTT, 2 μl RNAsin, 2 μl תבנית ה- DNA לינארית (~ 1 מיקרוגרם / μl), 3 μl RNA פולימראז ודגירת 37 צלזיוס למשך 90 דקות.
    2. הוסף 2 μl RNA פולימראז ודגירה 37 צלזיוס למשך 60 דקות.
    3. בדוק 2 μl של תגובה על 1% agarose ג'ל.
    4. להוסיף RNase ללא DNase RQ1 μl 1 דגירה 37 צלזיוס למשך 20 דקות.
    5. לזרז את הבדיקה על ידי הוספת 50 μl DEPC-H 2 O, 25 μl 10 M אמוניום אצטט וμl 313 אתנול. חנות ב -20 מעלות למשך לילה (O / N) ולאחר מכן לשחזר RNA על ידי צנטריפוגה ב13800 XG במשך 20 דקות. לשטוף עם 500 אתנול 75% μl, ספין בקצרה, להסיראתנול ולאפשר גלולה לייבוש באוויר. הוסף 50 μl DEPC-H 2 O.
    6. להוסיף הכלאה הצפת לריכוז סופי של ~ 0.5 מיקרוגרם / μl.
  3. הכן רקמות לכלאה. אלא אם צוין אחרת, למלא בקבוקונים לראש עם כל שינוי פתרון מתואר (כ 4 מיליליטר).
    1. הסר אתנול מבקבוקונים ועוברי העברה לאתנול 75% / PTW, אז 50% אתנול / PTW במשך 10 דקות כל אחד, במאוזן על נדנדה.
    2. לשטוף שלוש פעמים בPTW במשך 5 דקות כל אחד על כיסא נדנדה.
    3. העבר עד 10 מיקרוגרם / טיפול proteinase K μl בPTW; צינורות רוק אנכי 15 דקות.
    4. יש לשטוף פעמיים 10 דקות כל אחד ב 0.1 7.8 M Triethanolamine pH - צינורות רוק אנכי.
    5. להוסיף 12.5 μl אנהידריד אצטית לצינורות ורוק אנכי 5 דקות. חזור עם אנהידריד אצטית 12.5 μl נוסף במשך 5 דקות.
    6. לשטוף בPTW 5 דקות אנכית על נדנדה.
    7. Refix ב -4% דקות paraformaldehyde 20 על כיסא נדנדה. חום הכלאה הצפת60 ג.
    8. לשטוף שלוש פעמים בPTW במשך 5 דקות כל אחד על כיסא נדנדה.
    9. הסר את כל אבל ~ 1 מיליליטר של PTW מצינור אחד ולהוסיף 250 היב הצפת μl; בעדינות מערבולת צינורות לערבב. צינורות רוק אנכי 5 דקות.
    10. החלף עם C 60 היב מאגר (0.5 מיליליטר) ולהתסיס בעדינות על 60 ג '10 דק'. החלף עם טרי היב הצפת ולהתסיס בC 60 שנים עד 4 שעות.
    11. בדיקה חום (1 ​​מיליליטר ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl בהיב מאגר) עד 60 C (3 דקות). הסר היב מאגר ולהוסיף בדיקה לצינורות. להתסיס בעדינות O / N ב 60 ג.
  4. הכן רקמות לנוגדן.
    1. 0.1% Tween-20 פתרונות היב מאגר חם ו2x SSC + 60 ג.
    2. החלף פתרון בדיקה עם היב הצפת (להציל את הבדיקות ב -20 מעלות במשך 2 - 3x שימוש חוזר). לשטוף ב 60 צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. לשטוף שלוש פעמים ב -60 C ב2x SSC-Tween (20 דקות כל אחד עם תסיסה).
    4. לשטוף שלוש פעמים ב -60 C ב0.2X SSC-Tween (20 דקות כל אחד עם תסיסה).
    5. לשטוף פעמיים בMAB (RT) במשך 15 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
    6. להוסיף MAB מיליליטר 1 + בלוק. לשטוף 2 שעות אנכית על נדנדה.
    7. העברה לMAB מיליליטר 1 + בלוק המכיל 1 / 2,000 אנטי-digoxygenin-AP. רוק אנכי ב 4 CO / N.
  5. הכן רקמות לצבע מגיב.
    1. החלף פתרון נוגדן עם MAB; לשטוף שלוש פעמים בMAB 5 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
    2. לשטוף שלוש פעמים בשעה MAB 1 כל אופקי על נדנדה.
    3. לשטוף פעמיים בAP הצפת 10 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
    4. העבר את רקמות ולמרובה-מגש פלסטיק, להסיר ולהוסיף AP מאגר בע"מ מגיב סגול (~ 1 מיליליטר). לאפשר תגובה להמשיך בדקות 5 כהות לO / N.
    5. כאשר הצביעה מתאימה מושגת, להעביר רקמות לבקבוקונים של PTW. לשטוף פעמיים 10 דקות כל אחד בPTW על נדנדה.
    6. לתקן בפתרון של Bouin ב 4 CO / N על נדנדה.
    7. לשטוף את Bouin של עם שלושה שוטף PTW / 30% אתנול 70% ב RT. המשך to לכידת תמונה באמצעות עלית תאורה ומצלמה רכוב מיקרוסקופ, הלבנה אם 18 דרושים.

5. Sib בחירה ושיבוט

  1. בריכה בחר עם הפעילות הגבוהה ביותר (התגובה הגדולה ביותר ברקמת ectodermal).
  2. לכיל (לדלל עם LB לצפיפות מתאימה) מניית גליצרול לבריכה עם הפעילות הגבוהה ביותר וצלחת את עשר צלחות חדשות עם כ עשירית מושבות מהשלב הקודם (באמצעות סעיף 2 בפרוטוקול לעיל).
  3. להקטין את גודל בריכה עד הפעילות היא לייחס למושבה אחת.
  4. להשיג רצף ה- DNA באמצעות פריימרים סטנדרטיים בווקטור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בתגובה לביטוי של mRNA מוזרק לתוך ביציות, להגיב רקמת כובע חיה assayed לביטוי של otx2 ידי הכלאה באתר (איור 2 ולוח 1); otx2 בא לידי ביטוי בהאאקטודרם העדשה המשוערת (PLE) מסגירת צינור עצבית באמצעות placode העדשה עיבוי 19. עם זאת, מאז otx2 בא לידי ביטוי גם בהאאקטודרם הקדמי עצבי כמו גם האאקטודרם ראש שאינו עצבי מחוץ לPLE, זה קשור לשני עצבי ותגובות placodal. השימוש בfoxe3 להקרין את הספ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארת כאן לשיבוט הפונקציונלי של גנים מסוגלים גרימת תגובה בהאאקטודרם מוסמך יכולה לשמש כדי לזהות מגוון רחב של מוצרי גן. שיטה זו מרחיבה על העבודה האחרונה על ידי שילוב של מבחני וישכנע רקמה עם טכניקות שיבוט ביטוי. אנו מנצלים את המסלולים המטבוליים של ביצית Xenopus כמקור לייצור של גרימת גורמים, במישרין או בעקיפין, לאחר הזרקת RNA. זה, בשילוב עם השימוש בשיטות שהוקמו לשיבוט גן של עניין 6,7 באמצעות ביטוי של תמלילים שנוצרו מספריית cDNA או אוסף אחר של שיבוטים, מספק ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיתוח מקצועי ל-C.Z.P. מקרן אוניברסיטת שפרד. המחברים מבקשים להודות לברט צירקל ומליה דסהוטל על הדיונים המועילים על הפרוטוקולים, ולד"ר קרול הרני על הסיוע הנדיב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12/101מחקרי התפתחות נוגדנים בנק היברידומה12/101נוגדן חד שבטי לזיהוי רקמת שריר
20x SSC BufferSigmaS6639עבור ISH
אנהידריד אצטיSigmaA6404עבור ISH
Anti-Dig-APRoche11093274910עבור ISH
Aurum פלסמיד מיני קיטBio-Rad732-6400טיהור DNA פלסמיד
חסימת ריאגנטRoche11096176001עבור ISH
BM סגולRoche11442074001עבור ISH
Boekel HybridizationOven Fisher Scientific13-245-121עבור ISH
Bouin's SolutionSigmaHT10132עבור ISH
BSASigmaA9647עבור OCM
CHAPSSigmaC3023עבור ISH
קולגנאז ARoche10103578001דפוליקולציה של ביציות
ציסטאיןסיגמאC121800עוברי Dejelly
DEPC-H2OFisher ScientificBP5611לתערובת
תיוג ISH Dig-RNARoche11277073910לבדיקות ISH
Dumont #5 מלקחייםWorld Precision Instruments500233למעטפת Vitelline הסרה
אתיל 3-aminobenzoateSigmaA5040MS222 חומר הרדמה
Ficoll PM 400SigmaF4375עבור הזרקת מדיה
פורממידSigmaF9037עבור ISH
Gentamicin sulfateSigmaG1914עבור נימי
זכוכיתOCM מכשירי דיוק עולמיים48783.5 אינץ' אורך, I, D, 0.530 מ"מ
בקבוקוני דגימת זכוכיתפישר סיינטיפיק06-408B
לולאתשיער מודבק בפיפטה פסטור למניפולציה של רקמות
מלח נתרן הפריןסיגמאH4784
למזרק ISH ננוליטר 2010מכשירי דיוק עולמייםננוליטר 2010מיקרו-מזרק נשלט על ידי מיקרו-מעבד
אוקיינוסמיידימלח אקווריום 972433 קרולינה לשחזור צפרדעים
IRBG XGC Xenopus מאומת באורך מלא cDNAמקור Bioscience989_IRBGcDNA library 
צלחות LB Agar עם 100 ומיקרו; גרם/מ"ל AmpicillinTeknovaL5004150 מ"מ צלחות LB-Amp שנשפכו מראש לבחירת אחים
LB Luria BrothTeknovaL8650LB לאיסוף מושבות בבחירת sib מצלחות ודילול תרביות
ערכת בידוד mRNA מגנטיNew England BioLabsS1550Sלבידוד של RNA מועשר בפולי (A)
חומצה מאליתSigmaM0375עבור ISH
מיקרופיל מיקרומניפולטור ידנימכשירים מדויקים בעולםM3310Rמיקרומניפולטור ידני
מיקסר אגוזיםפישר מדעי22-363-152נדנדה ל-ISH
PermoplastNascoSB33495Mחימר לכלי הזרקה וחיתוך
פוספט חוצץמלח סיגמאP5368עבור ISH
PMSGSigmaG4877כדי לעורר את התפתחות הביציות
PolyvinylpyrrolidoneSigmaPVP40עבור ISH
חולץ לתכנותמכשירים דיוק עולמיPUL-1000חולץ מחט מיקרופיפטה
Proteinase KSigmaP6556עבור ISH
pTnT וקטורPromegaL5610cDNA ספריית בניית
מערכת שילוב RiboprobePromegaP1450במבחנה תמלול
Superscript ערכת בניית ספריית cDNA באורך מלאTechnologiesערכת 18248013לבניית ספריית cDNA
תפרים, 3-0 משיFisher Scientific19-037-516חוט תפר ומחט להסרת ביצית
Torula RNASigmaR3629עבור ISH
TriethanolamineSigmaT1502עבור ISH
Tween 20SigmaP9416עבור
ISH מערכת סינתזה אוניברסלית של RiboClone cDNAPromegaC4360ערכה חלופית לבניית ספריית cDNA
Xenopus שיבוטי כניסה מלאים של ORF - ORFeome שיתוף פעולהמקור Bioscience5055_XenORFeomeORFeome Clones
XL2-Blue תאים אולטרה-מוכשריםAgilent Technologies200150תאים לטרנספורמציה של cDNA ספריה
שיער ISH Life

מקורות

  1. Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
  2. Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
  3. Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
  4. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  5. Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
  6. Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
  7. Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  8. Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
  9. Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
  10. Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
  11. Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
  12. Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
  13. Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
  14. Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
  15. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
  16. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
  17. Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).
  18. Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
  19. Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
  20. Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
  21. Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
  22. Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
  23. Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת מכסה של בעלי חיים (Animal Cap Assay)הזרקת mRNAהשראה עובריתסמן של פלטת העדשה (Lens Placode Marker)היברידיזציה במקום (In Situ Hybridization)בידוד תאי ביציתרקומבינציה של רקמותביולוגיה התפתחותית
שיבוט פונקציונלי שימוש
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.