מאמר שיטה

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

DOI:

10.3791/53529

⸱

6 בינואר 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phosphoinositides (PtdInsPs) הם שומני איתות חיוניים האחראים לגיוס אפקטורים ספציפיים ולהענקת אברונים עם זהות ותפקוד מולקולריים. כל אחד משבעת ה-PtdInsPs משתנה בתפוצה ובשפע שלו, המווסתים באופן הדוק על ידי קינאזות ופוספטאזות ספציפיות. השפע של PtdInsPs יכול להשתנות בפתאומיות בתגובה לאירועי איתות שונים או הפרעה במנגנון הרגולטורי. כדי להבין כיצד אירועים אלה מובילים לשינויים בכמות ה-PtdInsP והשפעתם הנובעת מכך, חשוב לכמת את רמות ה-PtdInsP לפני ואחרי אירוע איתות או בין בקרה לתנאים חריגים. עם זאת, בשל השפע והדמיון הנמוכים שלהם, כימות הכמויות היחסיות של כל PtdInsP יכול להיות מאתגר. מאמר זה מתאר שיטה לכימות רמות PtdInsP על ידי תיוג מטבולי של תאים עם 3H-myo-inositol, המשולב ב-PtdInsPs. לאחר מכן פוספוליפידים משקעים ומפורקים. 3ה-H-glycero-inositides המסיסים המתקבלים מופקים עוד יותר, מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), ומזוהים על ידי נצנוץ זרימה. התיוג והעיבוד של דגימות שמרים מתואר בפירוט, כמו גם ההגדרה האינסטרומנטלית עבור HPLC ונצנוץ הזרימה. למרות אובדן מידע מבני לגבי תכולת שרשרת האציל, שיטה זו רגישה וניתנת לאופטימיזציה כדי לכמת בו זמנית את כל שבעת ה-PtdInsPs בתאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוספואינוזיטידים (PtdInsPs) הם פוספוליפידים חשובים המסייעים בוויסות מגוון פונקציות תאיות, כולל העברת אותות, סחר בממברנות וביטוי גנים, אשר לאחר מכן מווסתים את התנהגות התאים מסדר גבוה יותר כגון חלוקת תאים, זהות אברונים ופעילות מטבולית1-3. ישנם שבעה מינים של PtdInsPs שמקורם בזרחון של מיקומי 3, 4 ו/או 5 של קבוצת ראש האינוזיטול של פוספטידילינוזיטול (PtdIns), פוספוליפיד האב. חשוב לציין, שבעת ה-PtdInsP מפוזרים בצורה לא שווה והריכוז המקומי של כל מין PtdInsP יכול לעלות או לרדת באתרים תת-תאיים ספציפיים שבהם הם נקשרים לקבוצה מובחנת של אפקטורים חלבונים, אשר יחד מאפשרים לכל PtdInsP לשלוט בזהות ובתפקוד של הממברנה המארחת שלו3,4. בנוסף, יש לשלוט היטב ברמות של כל PtdInsP מכיוון שהדבר יכול להשפיע באופן משמעותי על עוצמת האות המיוצר על ידי PtdInsP. הלוקליזציה והרמות של כל PtdInsP תלויות במיקוד ובפעילות של מספר רב של ליפידים קינאזות, פוספטאזות ופוספוליפאזות המתווכות את הסינתזה והתחלופה של כל PtdInsP3,4. לפיכך, ויסות שגוי של מנגנון הרגולציה של PtdInsP יכול להפריע לתפקוד התאים, ולהוביל למחלות כמו סרטן ומחלות ניווניות2,5,6. כדי להבין באופן מלא את התפקידים והפונקציות של PtdInsPs ומנגנון הרגולציה שלהם, פותחו טכניקות מבוססות מיקרוסקופיה וביוכימיות למעקב וכימות של PtdInsPs.

במקרים רבים, PtdInsPs נקשרים לאפקטורים החלבוניים שלהם דרך תחום חלבון ספציפי7-9. מודולי חלבון אלה שומרים לרוב על תכונות הקיפול וזיהוי השומנים הנכונות שלהם כאשר הם באים לידי ביטוי בנפרד מהחלבון כולו. זה הוליד בדיקות PtdInsP על ידי מיזוג תחום חלבון קושר PtdInsP ספציפי לחלבון פלואורסצנטי (FP) כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לזיהוי תת-תאי של PtdInsPs על ידי מיקרוסקופיה. ואכן, מחקרים רבים השתמשו במודולי חלבון קושרי PtdInsP התמזגו עם FP כדי לזהות את הלוקליזציה והדינמיקה של מינים ספציפיים של PtdInsP על ידי הדמיית תאים חיים1,10. לדוגמה, תחום ההומולוגיה של Pleckstrin (PH) של פוספוליפאז C δ1 (PLCδ1) שהתמזג ל-GFP מזהה באופן ספציפי את הפוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט [PtdIns(4,5)P2] על קרום הפלזמה, בעוד שעותקי טנדם של תחום FYVE של אנטיגן אנדוזום מוקדם 1 (EEA1) שימשו למעקב אחר פוספטידילינוזיטול-3-פוספט (PtdIns3P) על אנדוזומים10-13. בסך הכל, טכניקות מבוססות מיקרוסקופיה נהדרות להמחשת לוקליזציה ודינמיקה של PtdInsP, אך ישנן מספר אזהרות, כולל שתחומי קשירת PtdInsP עשויים גם לקיים אינטראקציה עם גורמים נוספים מלבד מיני המטרה PtdInsP וכי הם אינם יכולים לזהות שינויים מתחת לפלואורסצנטיות ציטוזולית של בדיקות ה-FP.

ניתן להשתמש בטכניקות ביוכימיות הכוללות כרומטוגרפיה של שכבה דקה, ספקטרומטריית מסה ותיוג רדיואיזוטופים כדי לאפיין ולכמת את הרמות של כל PtdInsP14-16. שיטות אלו דורשות בידוד של שומנים לזיהוי רמות תאיות של PtdInsPs. ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסה כדי לאפיין פוספוליפידים מתמציות ליפידים והיא לא יסולא בפז לקביעת הרכב שרשרת האציל של PtdInsPs14,17. עם זאת, ספקטרומטריית מסה היא ברובה כמותית למחצה ועדיין קשה לפתור ולכמת במקביל מיני PtdInsP בעלי אותו משקל מולקולרי14,17. לשם השוואה, תיוג רדיואיזוטופים של PtdInsPs ואחריו נצנוץ זרימה בשילוב כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעל ביצועים גבוהים שימושי להפרדה וכימות בו-זמנית של כל שבעת המינים של PtdInsPs18. השימוש ב-HPLC עם עמודת חילופי אניונים חזקה (SAX) משיג הפרדה המבוססת על משקל מולקולרי, מטען וצורה, ובכך מפצל את ה-PtdInsPs (Gro-InsPs) אפילו מאותו משקל ומטען מולקולרי. צימוד חומר ה-HPLC לנצנוץ זרימה יוצר שיאי אות מבוססי רדיואקטיביות עבור כל מין Gro-InsPs ביחס להורה המקורי גליצרול-אינוזיטול (Gro-Ins)18. זה בסופו של דבר תואם לרמות יחסיות של PtdInsPs בתאים.

תיוג רדיו של PtdInsPs ונצנוץ זרימה מצומד HPLC הוא כלי שימושי לחקירת הוויסות והתפקוד של פוספטידילינוזיטול 3,5-ביספוספט [PtdIns(3,5)P2], PtdInsP המהווה רק ~0.1-0.3% מ-PtdIns16,19,20. סינתזה של PtdIns(3,5)P2 מבוצעת על ידי PtdIns3P 5-kinase הנקרא Fab1 בשמרים ו-PIKfyve ביונקים21. תגובה זו מנוטרלת על ידי PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase הנקרא Fig4 בשמרים או mFig4/Sac3 ביונקים22-24. מעניין שגם PIKfyve/Fab1 וגם mFig4/Fig4/Sac3 קיימים בקומפלקס יחיד ומווסתים על ידי חלבון מתאם הפיגומים, Vac14 בשמרים או mVac14/ArPIKfyve ביונקים25,26. בתאי שמרים שנמחקו על ידי VAC14, Fab1 אינו מתפקד ביעילות מה שמוביל לירידה של 90% ברמות PtdIns(3,5)P2 27,28. מצד שני, Atg18 הוא חלבון אפקטור PtdIns(3,5)P2 שעשוי לשלוט בביקוע ואקואולרי 29. Atg18 הוא גם מווסת שלילי של PtdIns(3,5)P2 מכיוון שמחיקת הגן שלו, ATG18, גורמת לעלייה של פי 10 עד פי 20 ברמות PtdIns(3,5)P2 29,30. בסך הכל, שינויים ברמות PtdIns(3,5)P2 משפיעים קשות על תפקוד ואקואול השמרים והליזוזומים של היונקים, וכתוצאה מכך משפיעים על תהליכים כגון סחר בממברנות, התבגרות פגוזומים, אוטופגיה והובלת יונים 6,19,21,31.

מאמר זה מתאר את תהליך התיוג הרדיואיזוטופי של PtdInsPs עם 3H-myo-inositol בשמרים כדי לזהות את הרמות היחסיות של PtdIns(3,5)P2 בזני שמרים מסוג בר, vac14Δ ו-atg18Δ. אם נשתמש בזה כדוגמה, מוצגות יכולות הפתרון של HPLC להפרדה של PtdInsPs בודדים כמו גם הרגישות של נצנוץ הזרימה לזיהוי כמות עקבות של 3 H-myo-inositol. אנו גם מרחיבים כיצד ניתן לייעל את המתודולוגיה לתיוג והפרדה של 3PtdInsPs עם תווית H מתאי יונקים, שהדגימות שלהם נוטות להיות מורכבות יותר מכיוון שתאים אלה מכילים את כל שבעת מיני ה-PtdInsP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הטקסט למטה מתאר בפירוט שיטה למדידת PtdInsPs בשמרים. הוא מספק את הפרטים הניסיוניים לתאי תיוג שמרים עם -inositol מיו 3 H-, שומני חילוץ וdeacylating ופרוטוקול HPLC-elution לfractionate ולכמת PtdInsPs deacylated. שים לב שתיוג, deacylation, רזולוציה וכימות של PtdInsPs בתאי יונקים דורש אופטימיזציה ופרופילי HPLC-elution עוד. ניתן למצוא את הפרטים הללו במקום אחר, אם כי אנו דנים בחלק מהיבטים בדיון. בסך הכל, המתודולוגיה לחלץ שומנים, deacylate ולחלץ את מסיסים במים Gro-InsPs משמרים ניתן ומאויר באיור 1.

1. פרוטוקול PtdInsPs תיוג והניתוח בשמרים

  1. תרבית תאים וradiolabeling
    1. לגדול תרבות נוזלית 20 מיליליטר של SEY6210 זן שמרים על 30 מעלות צלזיוס עם קבוע רועד בסינטטי מלאהתקשורת לשלב אמצע יומן-או צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) בסך של כ 0.6-0.7.
      הערה: אל תשתמש בתקשורת YPD זה עלול להשפיע 3 H- התאגדות מיו -inositol. גודל תרבות זה אמור לספק מספיק חומר במשך 2-3 ריצות HPLC.
    2. גלולה כוללת של 10-14 OD של תאי השמרים (שים לב שתרבות 1 מיליליטר עם OD 600 = 1 מכילה ~ 1x10 7 תאים) על ידי צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות בצינור 12 מיליליטר מסביב לתחתית. Resuspend עם 2 מיליליטר של תקשורת חופשית אינוסיטול (IFM) (ראה טבלה 1 להרכב IFM).
    3. חזור צנטריפוגה ולשאוב את התקשורת. Resuspend גלולה עם 440 μl של IFM ולדגור על RT במשך 15 דקות.
    4. הוסף 60 μl של 3 H- מיו -inositol (μl 1 = μCi 1) לכל דגימה ודגירה בטמפרטורה הולך וגדל של 30 מעלות צלזיוס במשך 1-3 שעות עם רעד קבוע.
      זהירות: 3 -inositol מיו H- היא בן זוג רדיואקטיבייםריאל שצריך להיות מטופלים לאחר הכשרה מתאימה. בנוסף, כל החומרים המתכלים שליצור קשר עם 3 חומרים המכיל H צריכים להיות מסולקים כראוי ומיועדים כפסולת רדיואקטיבית.
      הערה: טמפרטורת הצמיחה ניתן לשנות בהתאם לצורך, כל עוד כל הזנים שגדלים בהשוואה באותה הטמפרטורה.
    5. מעבירים את ההשעיה התא (500 μl) לצינור microcentrifuge המכיל 500 μl של 9% חומצת perchloric ו -200 μl של חומצה שטף חרוזי זכוכית. מערבבים על ידי היפוך ודגירה על קרח למשך 5 דקות.
    6. מערבולת המדגם במהירות שיא במשך 10 דקות ולהעביר את lysates לצינור microcentrifuge חדש באמצעות קצה ג'ל טעינה כדי למנוע את חרוזי הזכוכית.
    7. גלולה המדגם ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולשאוב supernatant.
    8. Resuspend גלולה ידי sonication אמבטיה ב 1 מיליליטר של קר כקרח 100 מ"מ EDTA. גלולה שוב כמו קודם.
  2. Deacylation וחילוץ
    1. טרי להכין 5.0 מיליליטר של מגיב deacylation על ידי שילוב של 2.3 מיליליטר של מתנול, 1.3 מיליליטר של methylamine 40%, 0.55 מיליליטר של 1-butanol ו0.80 מיליליטר של מים. הפוך לערבב.
    2. לשאוב EDTA וsonicate גלולה ב -50 μl של מים.
    3. הוסף 500 μl של מגיב deacylation וsonicate לערבב. לדגור על RT במשך 20 דקות.
    4. שומני חום במשך 50 דקות ב 53 מעלות צלזיוס בגוש חום. ייבש את הדגימות לחלוטין על ידי צנטריפוגה ואקום מעל 3 שעות או O / N.
      1. ודא שמלכודת כימית מותקנת בין הוואקום-צנטריפוגה ומשאבת הוואקום כדי למנוע אדים מלהיכנס לאוויר.
    5. Resuspend גלולה עם 300 μl של מים על ידי sonication אמבטיה ולדגור על RT במשך 20 דקות. ייבש את הדגימות על ידי צנטריפוגה ואקום במשך 3 שעות או O / N. חזור על פעולה זו פעם נוספת.
    6. Sonicate גלולה עם 450 μl של מים. זהו השלב המימי במהלך חילוץ.
    7. טרי להכין 10 מיליליטר של extractioמגיב n על ידי הוספת 8.0 מיליליטר של 1-butanol, 1.6 מיליליטר של אתר אתיל ו0.40 מיליליטר של formate אתיל. הפוך לערבב.
    8. להוסיף 300 μl של מגיב החילוץ לשלב המימי. מערבולת את התערובת במהירות שיא במשך 5 דקות ולהפריד את השכבות על ידי צנטריפוגה במהירות שיא (18,000 XG) במשך 2 דקות.
    9. לאסוף את השכבה המימית התחתונה לתוך צינור microfuge חדש, תוך הימנעות את השכבה העליונה אורגנית, הממשק, וגלול. חזור על חילוץ של השלב המימי עוד פעמיים עם מגיב חילוץ טרי.
    10. יבש לחלוטין את השכבה מימית שנאסף על ידי צנטריפוגה ואקום. לפזר את גלולה ב -50 μl של מים על ידי sonication אמבטיה.
    11. הוסף 2 μl של כל דגימה 4 מיליליטר של נוזל נצנץ בבקבוקון נצנץ 6 מיליליטר פוליאתילן. לקבוע את מספר הספירות (בCPM) בכל דגימה על ידי נצנץ נוזלי באמצעות חלון פתוח.
    12. אחסן את הדגימות ב -20 ° C עד מוכן לHPLC.
  3. הפרדה3 H-glycero-inositides ידי HPLC
    1. הכן חיץ ידי סינון 1 ליטר של מים ultrapure עם בקבוק מסנן 0.22 מיקרומטר ואקום עליון, ואחרי סילוק גזים.
    2. הכן חיץ B על ידי ביצוע פתרון 1 ליטר של פוספט dibasic M אמוניום 1 (APS, MW 132.06) במים ולהתאים את ה- pH 3.8 עם חומצה זרחתית. סנן פוספט אמוניום עם בקבוק מסנן 0.22 מיקרומטר ואקום עליון, ואחרי סילוק גזים.
    3. להרכיב את הבקבוקון על ידי הזרקת זיווד 2 מיליליטר בקבוקון עם הוספת נפח קטן 250 μl קפיץ. לטעון 10 מיליון CPM ולהוסיף מים להיקף כולל של 55 μl. הכן בקבוקון ריק עם 55 μl של מים.
    4. מכסה את צלוחיות עם כובעי בורג לבוש עם septa PTFE / סיליקון (צד אדום מול בתוך הבקבוקון). מניחים כל בקבוקון במגש דגימה האוטומטי של HPLC, החל בבקבוקון הריק.
    5. השתמש HPLC ותוכנה הקשורים השולט זרימת חיץ, degasses מאגרים ובקרות להזריק מדגםעַל. השתמש בזרימת scintillator מקוון ותוכנה הקשורים אליו להסדיר את קצב זרימת הזוהרים ולפקח על אות H-3 הריקבון.
      1. השתמש בעמודת כרומטוגרפיה נוזלית SAX עם ממדים של 250 מ"מ x 4.6 מ"מ ומכיל 5 מיקרומטר שרף סיליקה בHPLC. לצייד את הטור עם שומר עמודה כדי למנוע הזרקה של חומרים מזהמים.
      2. התקן תא זרימה 500 μl 3 H-תואם בזרימת scintillator.
        הערה: פלזמה ניתן לעשות עם מערכת HPLC סדרת אינסוף Agilent 1,200 נשלטת על ידי תוכנת Chemstation או עם מערכות HPLC זמינות מסחרי אחרות. נצנץ זרימת eluent HPLC ניתן לעשות עם זרימת scintillator β-RAM נשלט על ידי תוכנת לורה או אחר זרימת scintillator זמין מסחרי או תוכנה תואמת.
    6. לאתחל את משאבת רבעוני בקצב זרימה של 1.0 מיליליטר / דקה עם 100% א חיץ
    7. הגדרת פרופיל איזון על HPLCכדי לשלוט בצבע של חוצצים ו- B (לקרוא "פרוטוקול איזון" זה): 1% הצפת B ל5 דקות, 1-100% B ל5 דקות, 100% B דקות 5, 100-1% B ל5 דקות, 1% B במשך 20 דקות. להגדיר את מגבלת הלחץ ב -400 בר, 1.0 מיליליטר / קצב זרימה דק ', ו -30 דקות זמן לרוץ.
    8. הגדרת פרופיל elution (איור 2) על HPLC לשלוט השיפוע של חוצצים ו- B (קורא לזה "פרוטוקול"): 1% ב 5 דקות ל, 1-20% ב 40 דקות, 20-100% B במשך 10 דקות, 100% B דקות 5, 100-1% B עבור 20 דקות, 1% ב 10 דקות. להגדיר את מגבלת הלחץ ב -400 בר, 1.0 מיליליטר / קצב זרימה דק ', ו -90 דקות זמן לרוץ.
    9. הגדר את פרוטוקול זיהוי על זרימת scintillator (קורא לזה "פרוטוקול זיהוי") לרוץ במשך 60 דקות, עם קצב זרימת נוזל נצנץ של 2.5 מיליליטר / דקה ולהתעכב זמן 8.57 שניות.
    10. לתכנת רצף הזרקה אוטומטית על HPLC להתחיל עם ריק מים על "פרוטוקול איזון", ואחריו בדואראח radiolabelled מדגם על "פרוטוקול". לאתחל את הרצף כאשר מוכן.
    11. בעוד הטווח הוא עדיין בפרוטוקול האיזון, ליצור אצווה על זרימת scintillator למדוד כל הדגימות עם "פרוטוקול זיהוי." ההזרקה של כל דגימה חדשה תהיה לאתחל "פרוטוקול" על HPLC תוך מפעילה את הזרימה scintillator להתחיל "פרוטוקול זיהוי."
    12. בסיום כל הריצות, לשטוף את HPLC, העמודה ולזרום scintillator עם 100% הצפת למשך 30 דקות ב 1.0 מיליליטר / קצב זרימה דק '.
  4. ניתוח נתונים
    1. השתמש בתוכנת לורה או כל תוכנה אחרת שיכול לכמת את ספקטרום כרומטוגרפיה. השלבים מתוארים בסעיף זה מתוארים באיור 3.
    2. לפתוח את הקבצים על ידי לחיצה על "קובץ", "פתח", ובחר את קובץ הנתונים הגולמי עבור כל דגימה.
    3. בכרטיסייה "chromatograms", zoאום בלמתוח כל אחת מהפסגות פחותות (כ 1000 ספירה [ציר y]) תוך השמירה על הרזולוציה הזמן. זום לשיא כל פרט במידת צורך.
    4. סמן כל אחד מהפסגות לניתוח שימוש באפשרות "הוסף את ההחזר על ההשקעה". לזהות פסגות על ידי זמן של elution: Gro-Ins הורים ב 10 דקות, Gro-Ins3P ב 18 דקות, Gro-Ins4P ב 20 דקות, Gro-Ins P (3,5) 2 ב -29 דקות וGro-Ins (4,5 P) 2 ב 32 דקות.
    5. בכרטיסייה "שולחנות אזורים", להקליט "האזור (ספירות)" של כל שיא. הערה "להתחיל (mm: ss)" זמן ו: זמן של כל שיא "הסוף (מ"מ SS)".
    6. לחיסור רקע, להדגיש אזור סמוך לשיא פורש את אותה הכמות של זמן. הפחת את מספר הסעיפים מהשיא המקביל.
    7. לנרמל את השטח של כל שיא נגד Gro-Ins של הורים (המבוטא "% מPtdIns הכולל"). לאחר מכן, לנרמל כל אחד מהשיאים בכל תנאי ניסוי נגד מצב השליטה (המבוטא "nעליית -fold לעומת שליטה ").
      הערה: נורמליזציה של שיא כל יכולה להיעשות גם נגד ספירה כוללת אבל מאז Gro-Ins של ההורים הוא הרבה יותר עשיר מכל PtdInsPs האחר התוצאות נוטות להיות דומה.
    8. לייצא את הנתונים לchromatographs ידי לחיצה על "קובץ", "שמור בשם ...", ולבחור את "CSV (מופרד בפסיקים)" פורמט קובץ. העלילה נתונים על גיליון אלקטרוני ולהציג במידת צורך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות שיטה זו, שמרי PtdInsPs תויגו מטבולית עם -inositol מיו 3 H-. לאחר תיוג, פוספוליפידים היו זירז עם חומצת perchloric, ואחריו deacylation וחילוץ של מסיסים במים Gro-InsPs (איור 1) פוספוליפידים. בשלב זה, חשוב לכמת את האות רדיואקטיבי הכוללת הקשורים Gro-InsPs שחולץ על ידי נצנץ נוזלי על מנת להבטיח יחס אות לרעש מספיק לPtdInsPs מאוד נמוך השפע כמו PtdIns (3,5) P 2; בסך הכל 5-10 מ'עלויות לאלף הופעות צריך לה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מפרט את פרוטוקול הניסוי נדרש לכמת רמות סלולריות של PtdnsPs ידי זרימת נצנץ מצמידים HPLC משמרים. המתודולוגיה מאפשרת תיוג המטבולית של PtdInsPs עם -inositol מיו 3 H-, ואחריו עיבוד שומנים והפקה של 3 H-Gro-InsPs, חלוקה HPLC מסיס במים וניתוח. באמצעות שיטה זו, הרמות יחסי של PtdInsPs בתאים בתנאים שונים ניתן לכמת, כפי שמוצג לPtdIns (3,5) P 2 בפרא-סוג, vac14 D ותאי atg18 D שמרים (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.H. נתמך על ידי מלגת אונטריו לתארים מתקדמים מממשלת אונטריו. מאמר זה התאפשר הודות למימון של R.J.B. ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה, תוכנית כיסאות המחקר של קנדה ואוניברסיטת ריירסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-בוטנולביובייסיקBC1800ריאגנט כיתה
אמוניום פוספט דיבסיסיביושופAPD001ACS כיתה
אמוניום גופרתיביובייסיקADB0060אולטרה טהור כיתה
דגימה אוטומטיתAgilentG1329BAgilent 1260 סדרת אינפיניט
ביוטיןסיגמאB4501
חומצה בוריתBiobasicBB0044ביולוגיה מולקולרית כיתה
סידן כלורידBiobasicCT1330Ahydrous, בדרגה תעשייתית
סידן פנטותנטSigmaC8731
נחושת (II) סולפטSigma451657
נטול מים D-גלוקוזBiobasicGB0219נטול מים,
שינוי Dulbecco בדרגת ביוטכנולוגיה של Eagle's MediumLife11995-065עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, 110 מ"ג/ליטר פירואט, השינוי של L-גלוטמין
Dulbecco לביו-רפואי Eagle's Medium MP0916429 עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, ללא L-גלואטמין, ללא אינוזיטול
EDTABiobasicEB0107ללא חומצה, כיתה טהורה במיוחד
אתיל אתרקלדון מעבדות1/10/4700נטול מים, בדרגת ריאגנט
Ethyl formateSigma112682Reagent grade סרום
בקר עובריWisent080-450ממקור ארה"ב, איכות פרימיום,
סרום בקר עובריחיים26400044ארה"ב מקור
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05נוזל נצנוץ לנצנוץ זרימה 
חומצה פוליתBiobasicFB0466USP דרגת
USP תמיסת חיץ HEPESתמיסת חיים156300801 M
אינוזיטול, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 אתנול למים
אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמיןLife51500056תמיסה פי 100
ברזל (III) כלורידסיגמא157740מגיב כיתה
לורה - תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים כרומטוגרפיהLabLogic Systems Ltdגרסה 4.2.1.18תוכנת נצנוץ זרימה
L-גלוטמיןSigmaG7513200  mM, תמיסה, מסוננת סטרילית, BioXtra, מתאימה לתרבית תאים
מגנזיום כלורידסיגמאM8266מנגן גופרתי נטול מים
ביובייסיקMB0334מונוהידרט, מתנול קלדון בדרגת ACS
מעבדות6701-7-40בדרגת
סיגמא42646640% (v/v)
מונופוטסיום פוספטBiobasicPB0445נטול מים,
חומצה ניקוטיניתBiobasicNB0660ריאגנט בדרגת
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 תוכנת HPLC
חומצה p-אמינובנזואית (PABA)BioshopPAB001.100חומצה חופשית
פניצילין-סטרפטומיציןSigmaP4333100X, נוזלי, מיוצב, מסונן סטרילי, נבדק בתרבית תאים
חומצה פרכלוריתסיגמא244252מגיב ACS, 70%
עמודת SAX PhenoSpherPhenomenex00G-315-E05 ומיקרו; m, 80 Å, 250 x 4.6 מ"מ
חומצה זרחתיתCaledon labs1/29/8425ריאגנט כיתה
אשלגן כלוריביובייסיקPB0440ACS כיתה
אשלגן יודידביובייסיקPB0443ACS
כיתה פירידוקסין הידרוכלורידסיגמאP9755
משאבה רבעוניתAgilentG1311CAgilent 1260 סדרת אינפיניטי
ריבופלביןביושופRIB333.100USP כיתה
נתרן כלורידביובייסיDB0483ביוטק כיתה
נתרן מוליבדטסיגמא243655
תרמוסטט תא עמודיםAgilentG1316AAgilent 1260 סדרת אינסוף
תיאמין הידרוכלורידSigmaT4625דרגת ריאגנט; לעשות תמיסה של 0.02% (W/V), יוצר השעיה. לערבב ולהקפיא aliquots
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail לספירת נצנוץ נוזלי
אבץ גופרתיBiobasicZB2906Heptahydrate, דרגת ריאגנט
& beta;-RAM 4מערכות IN/USדגם 4מנצנץ זרימה - 500 & מיקרו; l תא זרימה; מנתח מנצנץ זרימה רדיומטית חלופי מאת פרקין אלמר 
מומת בחום, בדיאליזה HPLC תמיסת מתילאמין בדרגת ACS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
  3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
  4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
  5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
  6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
  7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
  8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
  9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
  10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
  11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
  13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
  15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
  16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
  17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
  18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
  19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
  20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
  21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
  22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
  23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
  24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
  25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
  26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
  27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
  28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
  29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
  30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
  31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
  32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
  33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
  34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
  35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
  36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
  37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
  38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
  39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
  40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
  41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
  42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
  43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Phosphoinositide QuantificationHPLC Flow ScintillationTritium LabelingYeast Cell AnalysisPhospholipid ExtractionDeacylation ProcedureRadioactive DetectionGradient ElutionPeak IntegrationData Normalization

מאמרים קשורים