Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Phosphoinositides (PtdInsPs) הם שומני איתות חיוניים האחראים לגיוס אפקטורים ספציפיים ולהענקת אברונים עם זהות ותפקוד מולקולריים. כל אחד משבעת ה-PtdInsPs משתנה בתפוצה ובשפע שלו, המווסתים באופן הדוק על ידי קינאזות ופוספטאזות ספציפיות. השפע של PtdInsPs יכול להשתנות בפתאומיות בתגובה לאירועי איתות שונים או הפרעה במנגנון הרגולטורי. כדי להבין כיצד אירועים אלה מובילים לשינויים בכמות ה-PtdInsP והשפעתם הנובעת מכך, חשוב לכמת את רמות ה-PtdInsP לפני ואחרי אירוע איתות או בין בקרה לתנאים חריגים. עם זאת, בשל השפע והדמיון הנמוכים שלהם, כימות הכמויות היחסיות של כל PtdInsP יכול להיות מאתגר. מאמר זה מתאר שיטה לכימות רמות PtdInsP על ידי תיוג מטבולי של תאים עם 3H-myo-inositol, המשולב ב-PtdInsPs. לאחר מכן פוספוליפידים משקעים ומפורקים. 3ה-H-glycero-inositides המסיסים המתקבלים מופקים עוד יותר, מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), ומזוהים על ידי נצנוץ זרימה. התיוג והעיבוד של דגימות שמרים מתואר בפירוט, כמו גם ההגדרה האינסטרומנטלית עבור HPLC ונצנוץ הזרימה. למרות אובדן מידע מבני לגבי תכולת שרשרת האציל, שיטה זו רגישה וניתנת לאופטימיזציה כדי לכמת בו זמנית את כל שבעת ה-PtdInsPs בתאים.
מבוא
פוספואינוזיטידים (PtdInsPs) הם פוספוליפידים חשובים המסייעים בוויסות מגוון פונקציות תאיות, כולל העברת אותות, סחר בממברנות וביטוי גנים, אשר לאחר מכן מווסתים את התנהגות התאים מסדר גבוה יותר כגון חלוקת תאים, זהות אברונים ופעילות מטבולית1-3. ישנם שבעה מינים של PtdInsPs שמקורם בזרחון של מיקומי 3, 4 ו/או 5 של קבוצת ראש האינוזיטול של פוספטידילינוזיטול (PtdIns), פוספוליפיד האב. חשוב לציין, שבעת ה-PtdInsP מפוזרים בצורה לא שווה והריכוז המקומי של כל מין PtdInsP יכול לעלות או לרדת באתרים תת-תאיים ספציפיים שבהם הם נקשרים לקבוצה מובחנת של אפקטורים חלבונים, אשר יחד מאפשרים לכל PtdInsP לשלוט בזהות ובתפקוד של הממברנה המארחת שלו3,4. בנוסף, יש לשלוט היטב ברמות של כל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הטקסט למטה מתאר בפירוט שיטה למדידת PtdInsPs בשמרים. הוא מספק את הפרטים הניסיוניים לתאי תיוג שמרים עם -inositol מיו 3 H-, שומני חילוץ וdeacylating ופרוטוקול HPLC-elution לfractionate ולכמת PtdInsPs deacylated. שים לב שתיוג, deacylation, רזולוציה וכימות של PtdInsPs בתאי יונקים דורש אופטימיזציה ופרופילי HPLC-elution עוד. ניתן למצוא את הפרטים הללו במקום אחר, אם כי אנו דנים בחלק מהיבטים בדיון. בסך הכל, המתודולוגיה לחלץ שומנים, deacylate ולחלץ את מסיסים במים Gro-InsPs משמרים ניתן ומאויר באיור 1.
1. פרוטוקול PtdInsPs תיוג והני....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות שיטה זו, שמרי PtdInsPs תויגו מטבולית עם -inositol מיו 3 H-. לאחר תיוג, פוספוליפידים היו זירז עם חומצת perchloric, ואחריו deacylation וחילוץ של מסיסים במים Gro-InsPs (איור 1) פוספוליפידים. בשלב זה, חשוב לכמת את האות רדיואקטיבי הכוללת הקשורים Gro-InsPs שחולץ על ידי נצנץ נוזלי על מנת להבטיח יחס אות לרעש מספיק לPtdInsPs מאוד נמוך השפע כמו PtdIns (3,5) P 2; בסך הכל 5-10 מ'עלויות לאלף הופעות צרי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה מפרט את פרוטוקול הניסוי נדרש לכמת רמות סלולריות של PtdnsPs ידי זרימת נצנץ מצמידים HPLC משמרים. המתודולוגיה מאפשרת תיוג המטבולית של PtdInsPs עם -inositol מיו 3 H-, ואחריו עיבוד שומנים והפקה של 3 H-Gro-InsPs, חלוקה HPLC מסיס במים וניתוח. באמצעות שיטה זו, הרמות יחסי של PtdInsPs בתאים בתנאים שונים ניתן לכמת, כפי שמוצג לPtdIns (3,5) P 2 בפרא-סוג, vac14 D ותאי atg18 D שמרים (איור 4).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
C.Y.H. נתמך על ידי מלגת אונטריו לתארים מתקדמים מממשלת אונטריו. מאמר זה התאפשר הודות למימון של R.J.B. ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה, תוכנית כיסאות המחקר של קנדה ואוניברסיטת ריירסון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1-בוטנול | ביובייסיק | BC1800 | ריאגנט כיתה |
| אמוניום פוספט דיבסיסי | ביושופ | APD001 | ACS כיתה |
| אמוניום גופרתי | ביובייסיק | ADB0060 | אולטרה טהור כיתה |
| דגימה אוטומטית | Agilent | G1329B | Agilent 1260 סדרת אינפיניט |
| ביוטין | סיגמא | B4501 | |
| חומצה בורית | Biobasic | BB0044 | ביולוגיה מולקולרית כיתה |
| סידן כלוריד | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, בדרגה תעשייתית |
| סידן פנטותנט | Sigma | C8731 | |
| נחושת (II) סולפט | Sigma | 451657 | |
| נטול מים D-גלוקוז | Biobasic | GB0219 | נטול מים, |
| שינוי Dulbecco בדרגת ביוטכנולוגיה של Eagle's Medium | Life | 11995-065 | עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, 110 מ"ג/ליטר פירואט, השינוי של L-גלוטמין |
| Dulbecco לביו-רפואי Eagle's Medium MP | 0916429 | עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, ללא L-גלואטמין, ללא אינוזיטול | |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | ללא חומצה, כיתה טהורה במיוחד |
| אתיל אתר | קלדון מעבדות | 1/10/4700 | נטול מים, בדרגת ריאגנט |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade סרום |
| בקר עוברי | Wisent | 080-450 | ממקור ארה"ב, איכות פרימיום, |
| סרום בקר עוברי | חיים | 26400044 | ארה"ב מקור |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | נוזל נצנוץ לנצנוץ זרימה |
| חומצה פולית | Biobasic | FB0466 | USP דרגת |
| USP תמיסת חיץ HEPES | תמיסת חיים | 15630080 | 1 M |
| אינוזיטול, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 אתנול למים |
| אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין | Life | 51500056 | תמיסה פי 100 |
| ברזל (III) כלוריד | סיגמא | 157740 | מגיב כיתה |
| לורה - תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים כרומטוגרפיה | LabLogic Systems Ltd | גרסה 4.2.1.18 | תוכנת נצנוץ זרימה |
| L-גלוטמין | Sigma | G7513 | 200 mM, תמיסה, מסוננת סטרילית, BioXtra, מתאימה לתרבית תאים |
| מגנזיום כלוריד | סיגמא | M8266 | מנגן גופרתי נטול מים |
| ביובייסיק | MB0334 | מונוהידרט, מתנול קלדון בדרגת ACS | |
| מעבדות | 6701-7-40 | בדרגת | |
| סיגמא | 426466 | 40% (v/v) | |
| מונופוטסיום פוספט | Biobasic | PB0445 | נטול מים, |
| חומצה ניקוטינית | Biobasic | NB0660 | ריאגנט בדרגת |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | תוכנת HPLC |
| חומצה p-אמינובנזואית (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | חומצה חופשית |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Sigma | P4333 | 100X, נוזלי, מיוצב, מסונן סטרילי, נבדק בתרבית תאים |
| חומצה פרכלורית | סיגמא | 244252 | מגיב ACS, 70% |
| עמודת SAX PhenoSpher | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 ומיקרו; m, 80 Å, 250 x 4.6 מ"מ |
| חומצה זרחתית | Caledon labs | 1/29/8425 | ריאגנט כיתה |
| אשלגן כלורי | ביובייסיק | PB0440 | ACS כיתה |
| אשלגן יודיד | ביובייסיק | PB0443 | ACS |
| כיתה פירידוקסין הידרוכלוריד | סיגמא | P9755 | |
| משאבה רבעונית | Agilent | G1311C | Agilent 1260 סדרת אינפיניטי |
| ריבופלבין | ביושופ | RIB333.100 | USP כיתה |
| נתרן כלוריד | ביובייסי | DB0483 | ביוטק כיתה |
| נתרן מוליבדט | סיגמא | 243655 | |
| תרמוסטט תא עמודים | Agilent | G1316A | Agilent 1260 סדרת אינסוף |
| תיאמין הידרוכלוריד | Sigma | T4625 | דרגת ריאגנט; לעשות תמיסה של 0.02% (W/V), יוצר השעיה. לערבב ולהקפיא aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail לספירת נצנוץ נוזלי |
| אבץ גופרתי | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, דרגת ריאגנט |
| & beta;-RAM 4 | מערכות IN/US | דגם 4 | מנצנץ זרימה - 500 & מיקרו; l תא זרימה; מנתח מנצנץ זרימה רדיומטית חלופי מאת פרקין אלמר |
מקורות
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
- Botelho, R. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
